原始卵泡激活與卵泡發(fā)育相關(guān)機制的研究進展

毛菁沁，冒韻東

原始卵泡激活和卵泡發(fā)育過程的異常信號調(diào)控將導(dǎo)致早發(fā)性卵巢功能不足（premature ovarian insufficient，POI）、卵泡生長遲緩、排卵障礙、卵母細胞質(zhì)量下降等卵源性不孕事件發(fā)生。由于供卵來源有限，卵源性不孕是目前輔助生殖醫(yī)學界面臨的一大難題。因此，針對原始卵泡激活和卵泡發(fā)育相關(guān)機制的研究能使我們對卵源性不孕的原因有更加深入的了解，有利于提高卵泡發(fā)育異常、卵巢功能減退等疾病的臨床診治技術(shù)。本文就原始卵泡激活與卵泡發(fā)育過程相關(guān)信號通路的研究綜述如下。

1 原始卵泡激活

卵泡是卵巢功能發(fā)揮的基本單位，卵泡儲備池中原始卵泡的有序激活是雌性哺乳動物生育力維持的必要條件。目前針對卵泡激活較為經(jīng)典的信號通路有磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B-FOXO3a/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K-AKT-FOXO3a/mTORc）通路和Hippo通路。

1.1 PTEN-PI3K-AKT-FOXO3a通路 PI3K是一種脂質(zhì)激酶，在細胞增殖、代謝的調(diào)控上發(fā)揮關(guān)鍵作用。AKT是許多信號通路的交叉信號分子，對細胞生存、凋亡抑制起正性調(diào)控作用[1]。PTEN是在癌組織中突變頻率較高的抑癌基因，對PI3K和AKT活性有抑制作用[2]。特異性敲除小鼠卵母細胞PTEN基因后對PI3K的抑制解除，誘導(dǎo)磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為第二信使磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3）。隨后，磷脂酰肌醇依賴性激酶1（phosphatidylinositol-dependent kinase1，PDK1）激活使AKT磷酸化，激活的AKT向核內(nèi)轉(zhuǎn)移使FOXO3a過度磷酸化（失活狀態(tài)）并向核外轉(zhuǎn)移[3]。FOXO3a是叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在細胞穩(wěn)態(tài)維持和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮核心作用[4]。原始卵泡激活研究中FOXO3a通過核-胞漿穿梭作用調(diào)控原始卵泡激活與休眠[2]。當PTEN保持高活性時，核內(nèi)FOXO3a保持低磷酸化水平（活性狀態(tài)），活化的FOXO3a促進細胞周期抑制因子表達，如細胞周期依賴性激酶抑制子（cyclin-dependent kinase inhibitor 1b，Cdkn1b/p27Kip1），而當過度磷酸化的FOXO3a核外轉(zhuǎn)出時其對卵母細胞核的抑制作用解除，原始卵泡被激活[3]。綜上提示PTEN與FOXO3a可抑制原始卵泡激活，避免大量休眠期卵泡同時進入生長階段，防止卵泡過早過度消耗，是維持雌性哺乳動物正常生育年限的重要調(diào)節(jié)因子。

1.2 Kit/KitL-PI3K-AKT-TSC1/2-mTORc通路mTORc是絲/蘇氨酸激酶復(fù)合體，具有促進蛋白合成，調(diào)節(jié)細胞生長、增殖的作用[5]。腫瘤抑制結(jié)節(jié)硬化復(fù)合物1/2（tumorsuppressortuberoussclerosiscomplex1/2，TSC1/2）是mTOR上游抑制因子[5]。酪氨酸激酶受體（receptor tyrosine kinase，Kit）是卵母細胞表面的跨膜蛋白，在前體顆粒細胞（pregranulosa cell）來源的Kit配體（KitL）作用下能夠激活PI3K-AKT通路，磷酸化的AKT抑制TSC1/2活性從而解除其對mTORc的抑制作用[6]。4E結(jié)合蛋白（4E-binding protein，4EBP）是真核生物轉(zhuǎn)錄啟動子，活化后能促進蛋白合成。P70S6K是細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、細胞周期依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）的正性調(diào)控因子，參與調(diào)控細胞周期啟動和激活[5]。mTORc作用于下游靶點蛋白4EBP和P70S6K后使原始卵泡激活。綜上，在原始卵泡激活事件中，前體顆粒細胞來源的信號分子（KitL）激活卵母細胞表面相應(yīng)受體（Kit），進而啟動卵母細胞生長的信號通路。提示在原始卵泡激活過程中顆粒細胞與卵母細胞之間的信號交換使卵泡各組成部分同步發(fā)育。

1.3 Hippo信號通路 Hippo信號通路是在組織再生、機體發(fā)育過程中對組織器官大小起嚴格限制作用的保守信號通路[7]。癌蛋白（YAP/TAZ）信號激活后將導(dǎo)致細胞內(nèi)生長因子表達增加（如：結(jié)締組織生長因子）進而促進細胞增殖。Hippo信號通路磷酸化YAP/TAZ使之失活，從而抑制組織過度生長維持器官正常大小[8]。有研究表明機械應(yīng)力可以觸發(fā)Hippo信號通路的激活。將卵巢組織切成小塊時卵巢細胞之間的張力改變，細胞內(nèi)骨架蛋白Actin由單體聚合為多聚體，而這個過程將導(dǎo)致Hippo信號通路異常，失去對癌蛋白YAP/TAZ信號的抑制作用，去磷酸化的YAP/TAZ進入核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子TEAD結(jié)合后促進生長因子表達，加快細胞增殖與生長[8]。原始卵泡激活后形態(tài)學表現(xiàn)為卵母細胞增大，單層扁平前體顆粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)層立方顆粒細胞，這個轉(zhuǎn)變會使卵泡體積增大，增加卵巢組織內(nèi)的機械應(yīng)力進而觸發(fā)Hippo信號通路，抑制原始卵泡激活和卵泡生長[9]。因此，在卵巢中卵泡激活導(dǎo)致的形態(tài)學改變通過機械應(yīng)力觸發(fā)Hippo信號通路，抑制原始卵泡激活，對卵泡儲備維持發(fā)揮重要作用。

1.4 其他調(diào)節(jié)因子參與原始卵泡激活調(diào)控 動物實驗中發(fā)現(xiàn)叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族成員FOXL2促進前體顆粒細胞向立方形顆粒細胞分化并參與次級卵泡形成[6]。人類顆粒細胞中FOXL2轉(zhuǎn)錄水平的研究結(jié)果顯示：相比于原始卵泡，初級卵泡顆粒細胞內(nèi)FOXL2表達明顯下降，提示FOXL2可能參與抑制原始卵泡激活[10]。新生兒卵巢同源盒蛋白（newborn ovary homeobox，NOBOX）是FOXL2的結(jié)合蛋白，參與調(diào)控卵母細胞特異性基因表達和卵泡發(fā)育。POI患者血液樣本單細胞全外顯子基因測序結(jié)果顯示，NOBOX基因的截短突變與POI發(fā)生有關(guān)。NOBOX誘導(dǎo)細胞G2/M周期阻滯，當發(fā)生基因截短突變時這種阻滯作用喪失，可能是POI發(fā)生的原因之一[11]。LIM同源盒8（LIM homeobox 8，LHX8）是在原始卵泡激活研究中提及較多的轉(zhuǎn)錄因子。RNA結(jié)合蛋白LIN28A是PI3K-AKT-mTOR信號通路的上游激活子，LHX8抑制LIN28A活性，提示LHX8參與抑制原始卵泡激活[6]。人類原始卵泡過渡至初級卵泡的過程中卵母細胞LHX8表達下降，進一步提示LHX8對原始卵泡激活的負性調(diào)控[12]。Sirtuins是一組組蛋白去乙?；?，參與調(diào)控細胞能量代謝、衰老及炎癥反應(yīng)。SIRT1調(diào)節(jié)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）代謝，在原始卵泡激活過程中卵母細胞SIRT1表達增加使NADH/NAD+比值下降，為后續(xù)卵母細胞糖代謝方式由糖酵解途徑向氧化磷酸化途徑的轉(zhuǎn)變做準備，提示SIRT1參與卵母細胞激活[13]。SEMA6C（semaphorin6C）是一種分泌型蛋白，在神經(jīng)細胞生長和突觸形成過程中發(fā)揮作用，臨床上參與阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease）的疾病發(fā)展進程。然而近期的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白在卵巢細胞功能中發(fā)揮作用。當降調(diào)節(jié)新生小鼠卵巢細胞中SEMA6C表達水平后發(fā)現(xiàn)激活的原始卵泡數(shù)量顯著增加，使用AKT抑制劑LY294002后又可以逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象。提示在小鼠卵巢中，SEMA6C可能通過抑制PI3K-AKT信號通路使原始卵泡保持休眠狀態(tài)，在維持卵巢儲備上有一定的作用[6]。

2 卵泡發(fā)育

不計其數(shù)的生物學事件的發(fā)生使卵泡發(fā)育得以正常進行，最后獲得具有受精能力的次級卵母細胞，在受精后完成最后的減數(shù)分裂形成孕育新生命的受精卵。根據(jù)卵泡發(fā)育時對促性腺激素的反應(yīng)性可以將之分為兩個階段：竇前卵泡發(fā)育和竇卵泡發(fā)育。限于文章篇幅本文主要闡述這兩個階段卵泡發(fā)育中較為顯著的生物學事件。

2.1 竇前卵泡發(fā)育 原始卵泡激活后顆粒細胞增殖至雙層時的卵泡稱為次級卵泡。在次級卵泡向竇卵泡發(fā)育的過程中分化形成卵泡膜細胞。膜細胞根據(jù)其前體細胞來源可以分為內(nèi)膜細胞和外膜細胞。內(nèi)膜細胞由中腎管間充質(zhì)細胞分化而來，具有合成分泌類固醇激素的作用；外膜細胞由卵巢髓質(zhì)基質(zhì)細胞分化而來，最終形成成纖維細胞、血管前平滑肌細胞和間質(zhì)細胞，包裹于卵泡最外層起保護支持作用[14]。卵母細胞來源的生長分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF-9）通過HH信號通路（hedgehog signaling pathway）參與調(diào)控膜細胞的分化過程。GDF-9作用于顆粒細胞促進HH通路的配體合成：DHH（desert hedgehog）與IHH（Indian hedgehog）[15]。DHH與IHH以旁分泌方式激活前體膜細胞表面的跨膜受體PTCH1/2，從而解除PTCH1/2對下游靶蛋白SMO的抑制作用[16]?；罨腟MO激活前體膜細胞的分子標志物膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物（glioma-associated oncogene homolog，GLI），最終促使膜細胞分化形成[16]。竇前卵泡發(fā)育形成卵泡膜細胞是性激素合成的必要條件。

2.2 竇卵泡發(fā)育 當卵泡發(fā)育至直徑5～9 mm時出現(xiàn)竇腔，使卵泡內(nèi)顆粒細胞從空間分布上分隔成有功能差異的兩個亞細胞群：卵丘顆粒細胞（cumulus，CC）和壁層顆粒細胞（mural granulosa cell，mGC）。CC是在解剖位置上與卵母細胞最接近的體細胞，其胞質(zhì)變形延伸形成偽足樣跨透明帶結(jié)構(gòu)（transzonal projection，TZP），縫隙連接（gap junction）位于TZP終端，與卵母細胞膜直接接觸[17]。TZP是卵母細胞與CC實現(xiàn)信號雙向溝通的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。卵母細胞來源的信號分子通過TZP調(diào)節(jié)顆粒細胞分化增殖。CC通過TZP結(jié)構(gòu)向卵母細胞輸送代謝底物（如丙酮酸、氨基酸、類固醇等），在維持卵母細胞的物質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)的同時也參與抑制卵母細胞減數(shù)分裂阻滯。

卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)是卵母細胞核成熟的標志。排卵前高濃度環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）是維持卵母細胞減數(shù)分裂阻滯的關(guān)鍵信號分子[18]。小鼠實驗研究發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）峰之前，mGC來源的C型利鈉肽前體（natriuretic peptide precursor type C，NPPC） 激 活CC 表 面 受 體 尿 鈉 肽 受 體2（natriuretic peptide receptor 2，NPR2），促進環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP） 合成，cGMP通過TZP結(jié)構(gòu)進入卵母細胞，抑制磷酸二酯酶3A（phosphodiesterase 3A，PDE3A）活性使其無法水解cAMP[18-19]。卵母細胞內(nèi)高濃度cAMP激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）使細胞周期依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）處于高度磷酸化狀態(tài)（失活狀態(tài)）無法激活成熟促進因子（mature promoting factor，MPF）[20]，此時卵母細胞處于生發(fā)泡期（germinal vesicle，GV）。當LH峰來臨，LH結(jié)合mGC表面LHR，釋放表皮調(diào)節(jié)素（epiregulin，EREG）。EREG激活CC、mGC表面受體后下調(diào)細胞間縫隙連接[21-22]。同時，LH峰使CC表面NPR2去磷酸化（失活狀態(tài)）使cGMP合成受到明顯抑制[23]。在縫隙連接表達下調(diào)和cGMP合成減少的雙重抑制下，卵母細胞內(nèi)cGMP水平顯著下降使PDE3A的抑制解除，發(fā)揮對cAMP水解作用后cAMP濃度快速下降，進而激活MPF，恢復(fù)卵母細胞減數(shù)分裂。

卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)伴隨的細胞形態(tài)學變化是胞內(nèi)生發(fā)泡破裂（germinal vesicle breakdown GVBD），染色質(zhì)濃縮形成同源染色體后在紡錘體的作用下排列于赤道板。在紡錘絲的牽引下同源染色體分離，第一極體排出象征著卵母細胞核發(fā)育成熟具備受精能力。至此，完整的卵泡發(fā)育過程結(jié)束，卵冠丘復(fù)合體從排卵孔中排出后在輸卵管內(nèi)等待受精，開始新一輪的生命循環(huán)。

3 結(jié)語

原始卵泡的有序激活是雌性哺乳動物出生后卵泡池中數(shù)量有限的卵泡儲備能夠維持數(shù)年甚至數(shù)十年生育年限的前提條件。原始卵泡過度激活則會出現(xiàn)POI、卵巢過度刺激等現(xiàn)象，過度抑制則會導(dǎo)致卵泡始終保持休眠狀態(tài)直至閉鎖，臨床上表現(xiàn)為原發(fā)性不孕。卵母細胞內(nèi)外源性的信號分子保持動態(tài)平衡使原始卵泡激活的信號通路正常進行。卵泡發(fā)育期，卵母細胞源性的信號分子參與調(diào)節(jié)膜細胞分化，LH峰誘發(fā)的信號通路對卵母細胞核的成熟極為重要，促使卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂具備受精能力。子宮內(nèi)膜異位癥患者LH激素水平異?？赡苁瞧渎涯讣毎|(zhì)量下降的原因之一[24]。綜上，原始卵泡激活和卵泡發(fā)育過程信號通路的研究將為卵源性不孕提供新的診治思路。