基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘的作用機(jī)制

陳達(dá)艷 顧萬(wàn)紅 馬新?lián)Q

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州730050

支氣管哮喘是臨床比較常見的疾病。哮喘屬于中醫(yī)“哮病”范疇，風(fēng)痰阻肺是其病機(jī)。三子養(yǎng)親湯來(lái)源于《韓氏醫(yī)通》，具有祛風(fēng)化痰、降氣平喘的功效。藥理研究發(fā)現(xiàn)［1］，三子養(yǎng)親湯具有抗炎、止咳、平喘、祛痰的藥理作用，作為治療支氣管哮喘的常用方劑。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型學(xué)科，已被廣泛用于中藥活性成分的篩選、作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)、中藥作用機(jī)制及疾病發(fā)生機(jī)制的推測(cè)［2-4］。分子對(duì)接技術(shù)被用于理論驗(yàn)證受體與藥物分子之間結(jié)合模式和親合力［5-8］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，探討三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘的潛在治療作用，為三子養(yǎng)親湯的臨床應(yīng)用和研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 三子養(yǎng)親湯活性成分的搜集、篩選和成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）以“紫蘇子”“萊菔子”“芥子”為關(guān)鍵詞，檢索各中藥的化學(xué)成分，并以O(shè)B≥30%、DL≥0.18作為篩選條件，得到活性成分［5-8］。同時(shí)，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)Targets Information項(xiàng)下得到活性成分對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白，并借助Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)化為基因名。

1.2 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org/），獲取支氣管哮喘的靶點(diǎn)基因。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 用R軟件，獲取疾病與成分的共同靶點(diǎn)。將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING在線軟件，物種選為homo sapiens，最高置信度設(shè)置為0.9，去掉游離節(jié)點(diǎn)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?，以種節(jié)點(diǎn)度（degree）值大于中位數(shù)作為篩選條件，確定關(guān)鍵靶點(diǎn)，探討三子養(yǎng)親湯的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)和治療支氣管哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)，并建立三子養(yǎng)親湯藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO和KEGG分析 使用David［9］（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析。GO分析選擇生物過(guò)程（BiologiclProcess，BP）、細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）3個(gè)模塊繪制成條形圖，并以P＜0.05作為顯著功能與通路的臨界值。通過(guò)R軟件，安裝相應(yīng)的安裝包，將生物通路圖制成氣泡圖。

1.5 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接 分別從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）和Pub Chem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pub chem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)和化合物的3D結(jié)構(gòu)，并轉(zhuǎn)化為Pdb格式；使用AutoDock軟件分別加氫、加電子等操作，分子對(duì)接設(shè)置蛋白結(jié)構(gòu)為剛性大分子，分子為柔性，算法為Genetic Algorithm；用Pymol對(duì)得到的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行繪圖。參照文獻(xiàn)，以結(jié)合能≤-5.0kJ/mol［5-8］的成分作為三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘的活性成分篩選依據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 三子養(yǎng)親湯活性成分篩選 通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合“OB≥30%”與“DL≥0.18”檢索到紫蘇子、萊菔子、芥子中活性化合物共22個(gè)，其中16個(gè)來(lái)自紫蘇子，3個(gè)來(lái)自萊菔子，3個(gè)來(lái)自芥子。見表1。

2.2 三子養(yǎng)親湯活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到的紫蘇子、萊菔子、芥子的靶點(diǎn)，利用Prel處理，獲得三子養(yǎng)親湯的活性靶點(diǎn)201個(gè)，其中179個(gè)來(lái)自紫蘇子，18個(gè)來(lái)自芥子，4個(gè)來(lái)自萊菔子。

2.3 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 通過(guò)GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索支氣管哮喘，共得到2210個(gè)與支氣管哮喘相關(guān)的靶點(diǎn)。

2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 用R軟件建立“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)與“疾病靶點(diǎn)”相互交集的韋恩圖，見圖1。共有93個(gè)交集靶點(diǎn)，是三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘的候選靶點(diǎn)，其中NCOA2、ADRA1A、ADRA1B、AR、CHRM1、CHRM2、CHRM3、OPRM1、PTGS1、PTGS2為紫蘇子和芥子的共同靶點(diǎn)基因；NCOA2、NR3C2、PGR為紫蘇子和萊菔子的共同靶點(diǎn)基因。用Cytoscape 3.7.2軟件建立三子養(yǎng)親湯藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包括106個(gè)節(jié)點(diǎn)，249條邊，見圖2。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲋?，網(wǎng)絡(luò)中度值＞中位數(shù)（中藥度值中位數(shù)=6，成分度值中位數(shù)=19，靶點(diǎn)度值中位數(shù)=6）的藥材有1個(gè)（紫蘇子），成分有4個(gè)，靶點(diǎn)有5個(gè)。排名前3位的化合物分別是MOL000006-木犀草素、MOL001439-花生四烯酸、MOL002773-β-胡蘿卜素，度值分別為44、25、22，均來(lái)自紫蘇子；排名前3位的靶點(diǎn)分別是NCOA2、PGR、PTGS2，度值分別為12、11、10，為網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。見表2。

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2.5 靶點(diǎn)通路分析 利用DAVID在線工具對(duì)三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘的93個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析（P<0.05）。GO分析得到條目523個(gè)，其中生物過(guò)程（BP）396個(gè)，細(xì)胞組成（CC）53個(gè)，分子功能（MF）74個(gè)，分別占76%、10%、14%。在生物過(guò)程中，凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）、一氧化氮生物合成過(guò)程正調(diào)控（positive regulation of nitricoxide biosynthetic process）、血管收縮正調(diào)控（positive regulation of vasoconstriction）等排位靠前；在細(xì)胞組分中，膜筏（membraneraft）、細(xì)胞外間隙（extracellular space）、胞質(zhì)溶膠（cytosol）等排在前面；在分子功能中，主要包括酶結(jié)合（enzyme binding）、同一蛋白結(jié)合（identical protein binding）、蛋白質(zhì)異二聚活性（protein heterodimerization activity）等。選取排名前20位的條目繪制成條形圖，見圖3。

圖1 VEEN圖

圖2 三子養(yǎng)親湯藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

圖3 Go富集分析

KEGG通路分析結(jié)果顯示，富集于144個(gè)信號(hào)通路中，以排位前20條信號(hào)通路（P＜0.05）繪制的高級(jí)氣泡圖及柱狀圖見圖4。結(jié)果顯示三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘KEGG通路分別與PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、人巨細(xì)胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、癌癥中的蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、前列腺癌（Prostate cancer）等多條通路有關(guān)，其中PI3K-Akt信號(hào)通路涉及CHRM1、CHRM2、RELA、CCND1、MAPK1等基因；人巨細(xì)胞病毒感染涉及PTGS2、RELA、CCND1、MAPK1、CASP3等基因；卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染涉及PTGS2、RELA、CCND1、MAPK1、CASP3等基因；癌癥中的蛋白聚糖涉及PLAU、CCND1、MAPK1、CASP3、COL1A2等基因；前列腺癌涉及PLAU、RELA、CCND1、MAPK1、EGF等基因。見圖4、5。這些通路與支氣管哮喘的形成機(jī)制有著密切的聯(lián)系，有研究顯示這些通路直接或間接介導(dǎo)并參與支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。上述結(jié)果表明三子養(yǎng)親湯主要化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)涉及的生物學(xué)過(guò)程多樣化，并分布于不同的代謝通路，體現(xiàn)了其多成分，多靶點(diǎn)，多途徑的治療特點(diǎn)。

2.6 分子對(duì)接結(jié)果 將3個(gè)核心活性化合物木犀草素、花生四烯酸、β-胡蘿卜素分別與3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)NCOA2、PGR、PTGS2進(jìn)行分子對(duì)接。以結(jié)合能≤-5.0kJ/mol作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，可知，三子養(yǎng)親湯中木犀草素、β-胡蘿卜素與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能均小于-5.0kJ/mol，構(gòu)象能量低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)合活性較高。見表2和圖6。

圖4 KEGG富集分析的20條通路（氣泡圖及柱狀圖）

圖5 PI3K-Akt信號(hào)通路

3 討論

3.1 三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘活性成分 本研究共篩選出三子養(yǎng)親湯中可被口服吸收的22個(gè)活性成分，其中16個(gè)來(lái)自紫蘇子，3個(gè)來(lái)自萊菔子，3個(gè)來(lái)自芥子。紫蘇子化合物中，黃酮類化合物有木犀草素，脂肪酸類化合物有花生四烯酸、順式-11-二十碳烯酸、二十碳三烯酸，甾醇類化合物有β-谷甾醇、豆甾醇、菠甾醇，脂肪族化合物有2，6，10，14，18-五甲基-2，6，10，14，18-戊烯、24-甲基異戊酚等。研究表明紫蘇葉的揮發(fā)油成分、黃酮類和酚酸類化合物是其抗炎活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，已明確的活性成分有木犀草素。三子養(yǎng)親湯平喘配伍量效關(guān)系研究結(jié)果［10］表明，紫蘇子是方中平喘的主要中藥，且平喘效果與用量有關(guān)聯(lián)性。另有研究表明［11］，三子養(yǎng)親湯的平喘作用優(yōu)于各單味藥，紫蘇子的平喘作用強(qiáng)于芥子，芥子的祛痰作用強(qiáng)于紫蘇子，萊菔子的鎮(zhèn)咳作用較強(qiáng)。這與本研究篩選出的結(jié)果相吻合，也與三子養(yǎng)親湯的傳統(tǒng)功效一致，是三子養(yǎng)親湯傳統(tǒng)功效的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，也是三子養(yǎng)親湯質(zhì)量標(biāo)志物篩選的主要途徑和重要依據(jù)。

表2木犀草素、β-胡蘿卜素、花生四烯酸與NCOA2、PGR、PTGS2的結(jié)合能

圖6 木犀草素、β-胡蘿卜素、花生四烯酸分別與NCOA2、PGR、PTGS2的分子對(duì)接模式

3.2 三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘潛在作用靶點(diǎn) 本研究表明，核受體輔激活因子2（NCOA2）、PGR、PTGS2是三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘互作網(wǎng)絡(luò)中排名前3的靶點(diǎn)，其中NCOA2、PTGS2為紫蘇子和芥子的共同靶點(diǎn)基因；NCOA2、PGR為紫蘇子和萊菔子的共同靶點(diǎn)基因。NCOA2為3味中藥的共同作用靶點(diǎn)，PTGS2為木犀草素、花生四烯酸、β-胡蘿卜素的共同作用靶點(diǎn)。說(shuō)明三子養(yǎng)親湯中不同成分具有共同或相似的靶點(diǎn)，這與中藥配伍的相使思想一致，這些靶點(diǎn)是三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘關(guān)鍵靶點(diǎn)。NCOA2是p160甾體受體輔活化子（SRC）家族的一員，在許多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，包括發(fā)育、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生。PGR即為孕激素受體，臨床研究發(fā)現(xiàn)月經(jīng)期哮喘患者雌激素升高和孕激素降低可增強(qiáng)氣道高反應(yīng)性，可能是月經(jīng)期哮喘的原因［12］。孕激素和雌激素可以降低重癥哮喘患者let-7fmicroRNA的表達(dá)和增加IL-23/IL-23信號(hào)表達(dá)和IL-17A表達(dá)，也可能是女性重癥哮喘患者多于男性的原因［13］。

前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶（PTGS），又稱環(huán)加氧酶，有組成型PTGS1（又稱COX1）和誘導(dǎo)型PTGS2（又稱COX2）兩種同工酶，它們?cè)诒磉_(dá)和組織分布的調(diào)節(jié)上存在差異。COX-2參與花生四烯酸代謝成各種PGI產(chǎn)物，能誘發(fā)哮喘急性發(fā)作［14］。COX-2也能誘導(dǎo)分泌IL-18、前列腺素等炎癥介質(zhì)，加重炎癥反應(yīng)，誘發(fā)哮喘或使哮喘加重。炎性細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等均能誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)［15］。

3.3 三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘的機(jī)制 哮喘與炎癥、細(xì)胞因子有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可通過(guò)抑制COX-2［16］的表達(dá)從而減少PGE2的生成；能顯著減輕活化的巨噬細(xì)胞的炎性反應(yīng)，下調(diào)IL-6、IL-1β和TNF-α等致炎因子的表達(dá)。木犀草素能減少活性氧和活性氮的生成，抑制炎性細(xì)胞［17-18］因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而緩解炎癥反應(yīng)。在哮喘的病理生理過(guò)程中，研究表明，PI3K通過(guò)影響炎癥細(xì)胞的募集、激活、凋亡及細(xì)胞因子的產(chǎn)生而發(fā)揮著重要作用。在哮喘發(fā)生的炎癥過(guò)程中，T細(xì)胞扮演著重要作用，哮喘發(fā)病機(jī)制與Th1/Th2細(xì)胞在數(shù)量、活化及功能方面的比例失衡有密切的關(guān)系。研究推測(cè)，PI3K信號(hào)通路通過(guò)參與Th1/Th2的失衡，而參與哮喘發(fā)病過(guò)程［19］。本研究結(jié)果顯示三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘涉及的最主要通路為PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway），這與文獻(xiàn)報(bào)到相一致。

3.4 分子對(duì)接 從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和分子對(duì)接結(jié)果可知，與關(guān)鍵靶點(diǎn)NCOA2、PGR、PTGS2的親和力，三子養(yǎng)親湯中木犀草素、β-胡蘿卜素比臨床常用化學(xué)藥沙丁胺醇、氨茶堿的低，表明結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)合活性較高，對(duì)于治療支氣管哮喘因該有較好的療效，可能是潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)三子養(yǎng)親湯中的核心活性成分木犀草素、β-胡蘿卜素作用于NCOA2、PGR、PTGS2等多個(gè)靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)PI3K-Akt等多條信號(hào)通路，從而發(fā)揮治療支氣管哮喘的作用，為進(jìn)一步研究三子養(yǎng)親湯藥理藥效機(jī)制提供了思路和科學(xué)依據(jù)。