制藤茶水提物對(duì)大鼠急性咽炎作用及炎癥因子的影響*

★ 鄭海音 楊英祥 沙玫 張玉琴 褚克丹

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 福州 350122；2.福建海誠(chéng)藥業(yè)有限公司 福建 寧德352000；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 福州 350122）

急性咽炎（acute pharyngitis）是一種常見(jiàn)的上呼吸道疾病，多由病毒、細(xì)菌感染或物理、化學(xué)因素刺激咽部粘膜引起。近些年來(lái)，由于作息時(shí)間紊亂和飲食不規(guī)律導(dǎo)致的急性咽炎發(fā)作也日益增多［1］。臨床表現(xiàn)為咽喉部干癢，有灼熱感或異物感。因多次復(fù)發(fā)或可演變成慢性咽炎，影響患者生活質(zhì)量。

藤茶為葡萄科植物顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata（Hand.-Mazz.）W.T.Wang）的 新 鮮枝葉，主要生長(zhǎng)于我國(guó)東南、江南山區(qū)［2］。具有清熱解毒、利濕消腫的功效，民間常用于咽喉腫痛、感冒發(fā)熱、小便黃赤、皮炎濕疹和高血壓等疾病的防治［3］。福建中醫(yī)藥大學(xué)將藤茶炒制加工，研制為制藤茶（批準(zhǔn)文號(hào)為閩2016ZP0001），其炮制方法已列入《福建省中藥飲片炮制規(guī)范》。制藤茶性味，微甘、苦，微涼；歸肺、肝經(jīng)；對(duì)咽喉腫痛、失音有良好的治療效果。本文探討制藤茶水提物對(duì)急性咽炎模型大鼠狀態(tài)和炎癥因子的影響，為進(jìn)一步利用制藤茶預(yù)防和治療急性咽炎提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠60 只，雌雄各半，體重180～220g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001）。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室（使用合格證：SYXK（閩）2014-005），室溫（22±2）℃，濕度（60±5）%，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水和攝食。

1.2 儀器與試藥 喉頭噴霧器（型號(hào)：WI66710，東 西 儀 科 技 有 限 公 司）；PCR 儀（Bio-rad）；Infinite M200 Pro 多功能酶標(biāo)儀（TECAN）。

阿莫西林膠囊(山東淄博新達(dá)制藥有限公司，規(guī)格：0.25g，批號(hào)：15050206)；氨水（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ 檢測(cè)試劑盒（Biotechnology Systems）；RNeasy? Mini Kit（Qiagen）；RevertAid TM First stand cDNA Synthsis Kit（Thermo）；Power SYBR? Green PCR Master Mix（Thermo）。制藤茶（批號(hào)：170701，福建海誠(chéng)藥業(yè)有限公司），符合福建省中藥炮制規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)（FJ-ZP-2016-0001）。

2 方法

2.1 制藤茶水提物的制備 稱(chēng)取制藤茶約5kg，加入25 倍水浸泡30min，加熱煎煮提取2 次，每次45min。取上層清液干凈紗布過(guò)濾，合并濾液減壓濃縮至生藥濃度0.5g/mL 即得。

2.2 氨水急性咽炎大鼠模型的建立 SD 大鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為6 組，每組10 只，分別設(shè)為正常組，模型組，制藤茶低、中、高劑量組，阿莫西林陽(yáng)性藥組。參考相關(guān)文獻(xiàn)及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建立氨水急性咽炎模型［4-5］。除正常組以外，其余5 組使用喉頭噴霧器給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物咽部噴20%濃度氨水，每次噴霧3 撳，每日上午、下午各1 次，連續(xù)3d 形成急性炎癥，大鼠急性咽炎模型制備成功（大鼠表現(xiàn)為頻繁搔抓口部、飲水、咳嗽、腹式呼吸等）。造模后第4 天，制藤茶水提物低、中、高劑量組分別灌胃給予大鼠4.375，8.75，17.5g/kg 劑量的藥液，陽(yáng)性對(duì)照組給予0.36g/kg 劑量的阿莫西林，給藥體積為10mL/kg，正常組灌胃等體積的動(dòng)物飼養(yǎng)用水，每天1 次，連續(xù)給藥14d。末次給藥1h 后，水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血后肉眼觀察各組大鼠咽部情況。并按下述評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)記錄：頻繁搔抓口部，飲水，并出現(xiàn)咽部充血、腫脹，黏膜呈鮮紅色，積3 分；咽部腫脹，部分充血，積2 分；咽部腫脹，無(wú)充血，積1 分；無(wú)上述情況，積0 分。

2.3 炎癥因子檢測(cè) ELISA 法檢測(cè)血清樣本TNFα、IL-1β、IL-6、IL-10 及IFN-γ 含量，檢測(cè)過(guò)程均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.4 Real time-PCR 檢測(cè)制藤茶水提物對(duì)急性咽炎模型大鼠炎癥相關(guān)基因的影響 水合氯醛麻醉大鼠，摘取咽部粘膜及組織，液氮中保存。常規(guī)方法提取總RNA，檢測(cè)RNA 濃度和純度，選用20μL 反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。進(jìn)行Real time-PCR 擴(kuò)增，引物堿基序列見(jiàn)表1。最后以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算F 值（F=2-ΔΔCt），進(jìn)行結(jié)果分析。F 值即為各實(shí)驗(yàn)組與空白組mRNA 表達(dá)的相對(duì)差異。

表1 引物堿基序列

2.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果均用（）表示，不同組間采用方差分析，當(dāng)P＜0.05 時(shí)，具有顯著性差異，當(dāng)P＜0.01 時(shí)，具有極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)的影響 造模后大鼠呈現(xiàn)攝食減少，飲水頻繁，口腔粘性分泌物增多，咽部粘膜充血腫脹，毛色發(fā)暗，活動(dòng)減少等狀態(tài)。給藥結(jié)束時(shí)，陽(yáng)性藥組和制藤茶中、高劑量給藥組大鼠攝食和飲水量較正常組相似，口腔粘膜充血腫脹狀態(tài)得到改善，活動(dòng)基本正常。同時(shí)期模型組狀態(tài)無(wú)明顯改善。各組大鼠咽部病變積分情況見(jiàn)表2，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.01）。

表2 制藤茶水提物對(duì)急性咽炎模型大鼠的影響（，n=10）分

表2 制藤茶水提物對(duì)急性咽炎模型大鼠的影響（，n=10）分

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

組別 積分均值正常組 0.00±0.00模型組 2.80±0.42##制藤茶低劑量組 1.80±0.60**制藤茶中劑量組 1.40±0.58**制藤茶高劑量組 1.30±0.56**陽(yáng)性藥組 1.30±0.54**

3.2 對(duì)炎癥因子含量的影響 ELISA 法檢測(cè)血清樣 本TNFα、IL-1β、IL-6、IL-10 和IFN-γ 指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表3。與正常組相比，模型組大鼠血清TNFα、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 含量顯著升高（P ＜0.05，P＜0.01），IL-10 含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，制藤茶中、高劑量給藥組TNFα、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 指標(biāo)含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），IL-10 含量顯著升高（P＜0.05）。

表3 制藤茶水提物對(duì)急性咽炎模型大鼠血清炎癥因子的影響（，n=10） pg/mL

表3 制藤茶水提物對(duì)急性咽炎模型大鼠血清炎癥因子的影響（，n=10） pg/mL

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 TNF-α IL-1β IL-6 IL-10 IFN-γ正常組 562.55±29.67 3.36±0.12 78.36±4.63 89.86±1.45 356.85±19.98模型組 957.51±44.21## 12.21±0.44## 296.68±11.22## 33.57±4.28## 921.68±95.79##低劑量組 845.36±28.60* 12.07±0.81 292.35±28.64 41.65±6.89 797.21±48.92**中劑量組 632.51±27.58** 9.51±0.33* 171.53±14.33** 69.59±2.37* 672.55±34.87**高劑量組 416.28±21.56** 7.25±0.21** 145.28±7.82** 77.24±3.45** 307.68±42.68**陽(yáng)性藥組 412.17±18.54** 4.82±0.37** 138.26±6.71** 62.88±1.36** 389.85±45.29**

3.3 對(duì)炎癥因子相關(guān)基因表達(dá)的影響 與正常組相比，模型組大鼠組織中TNFα、IL-1β 及IL-6炎癥相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），IL-10 基因表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。與模型組相比，制藤茶中、高劑量給藥組TNFα、IL-1β、IL-6 基因表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），IL-10 基因表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 制藤茶水提物對(duì)急性咽炎模型大鼠咽部組織炎癥因子基因表達(dá)的影響（，n=10）

表4 制藤茶水提物對(duì)急性咽炎模型大鼠咽部組織炎癥因子基因表達(dá)的影響（，n=10）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 TNF-α IL-1β IL-6 IL-10正常組 1.05±0.07 1.03±0.37 1.02±0.12 1.05±0.07模型組 2.31±0.19## 1.81±0.47## 4.21±1.03## 0.71±0.06##低劑量組 2.26±0.16 1.87±0.71 3.68±1.54 0.69±0.09中劑量組 1.98±0.15* 1.54±0.43* 2.64±1.25* 0.74±0.15高劑量組 1.58±0.09** 1.49±0.52* 1.95±0.88** 0.92±0.05*陽(yáng)性藥組 1.47±0.14** 1.43±0.41* 1.39±0.61** 0.97±0.04**

4 討論

藤茶提取物具有抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤和降血脂活性。藤茶富含多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)成分，如二氫楊梅素、楊梅素、花旗松素等，其中二氫楊梅素的含量可高達(dá)約38%［6］。有研究報(bào)道二氫楊梅素具有降糖、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保肝和神經(jīng)保護(hù)作用［7］，藥理機(jī)制研究表明可以通過(guò)抑制NF-κB 的活化，抑制p38 和JNK 磷酸化來(lái)發(fā)揮其局部抗炎作用［8］。

本實(shí)驗(yàn)選取的檢測(cè)指標(biāo)，TNF-α（血清腫瘤壞死因子）、IL-1β（白細(xì)胞介素1β）、IL-6（白細(xì)胞介素6）、IL-10（白細(xì)胞介素10）是炎癥反應(yīng)中起主要作用的細(xì)胞因子。TNF-α 主要由活化的巨噬細(xì)胞、NK 細(xì)胞及T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。IL-1β、IL-6 主要是由T、B 淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，能夠顯示炎癥發(fā)生時(shí)的損傷程度。IL-1β 與TNF-α 的釋放相互促進(jìn)，并可引起體溫升高等嚴(yán)重反應(yīng)［9］。IL-10 能夠抑制活化的T 細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，也曾稱(chēng)為細(xì)胞因子合成的抑制因子。IFN-γ（γ 干擾素）主要由活化的T、B 淋巴細(xì)胞分泌，也可由NK 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，并能促使巨噬細(xì)胞活化，具有多種生物活性和種屬特異性。

本研究從細(xì)胞因子和基因角度考察了制藤茶水提物治療急性咽炎的效果。結(jié)果顯示制藤茶水提物對(duì)氨水急性咽炎大鼠的咽部癥狀有明顯改善作用，能夠顯著降低造模大鼠血清中TNFα、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 含量，顯著下調(diào)炎癥相關(guān)基因表達(dá)；顯著增加造模大鼠血清中IL-10 含量，顯著上調(diào)IL-10 基因表達(dá)。呈現(xiàn)與阿莫西林一致的效果，表明制藤茶水提物對(duì)急性咽炎具治療效果。為下一步開(kāi)發(fā)利用制藤茶，發(fā)揮其治療急性咽炎的藥效，提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)支持。制藤茶作為一種“藥食同源”的藥物，安全性應(yīng)當(dāng)優(yōu)于常規(guī)藥物，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)同樣值得進(jìn)一步研究。