HPLC 法同時測定龍甘胃舒分散片中5 種成分的含量*

★ 李晶 虞金寶

（江西省中醫(yī)藥研究院 南昌 330046）

龍甘胃舒分散片經(jīng)由民間傳統(tǒng)驗方研制而成。處方由龍膽草、大黃、甘草、陳皮、炒香附等組成，具有清熱瀉火、疏肝理氣、和胃止痛的功效，對胃熱熾盛證和肝氣犯胃證所致的胃脘灼熱，疼痛拒按，口干、口苦、泛酸，嘈雜等臨床療效甚佳，此外還可用于幽門螺桿菌陽性的胃病?；谥兴幘邆涞亩喑煞?、多靶點作用特點，為了進一步規(guī)范并監(jiān)控制劑質(zhì)量，本文研究了大黃、陳皮和甘草3 味主藥的有效成份含量測定，以期更加全面地保證產(chǎn)品質(zhì)量，確保臨床療效。

現(xiàn)代藥理研究表明,龍膽草中主要有效成分龍膽苦苷具有抗炎、解痙以及促進胃液和膽汁分泌的作用［1］；大黃瀉下實熱主要功效成分大黃素可通過增加小腸胃動素和抑制生長激素抑制素兩種途徑促進小鼠腸道平滑肌收縮，增強腸道蠕動［2-3］；陳皮中的活性成分橙皮苷和新橙皮苷可通過胃環(huán)氧合酶-2（COX-2）和胃DNA 碎片的表達從而改善大鼠（吲哚美辛誘導(dǎo)）的胃潰瘍癥狀［4］；甘草化學(xué)成分以黃酮類、三萜類以及多糖類為主，具有抑菌抗炎、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)機體免疫等作用［5-6］。前期研究通過HPLC 法建立了制劑中君藥所含龍膽苦苷的含量測定方法［7-8］，但由于檢測指標(biāo)單一，不能全面反映產(chǎn)品質(zhì)量，同時因龍膽苦苷半縮醛結(jié)構(gòu)具有化學(xué)不穩(wěn)定性。因此，本次實驗分別選取更為穩(wěn)定的大黃酚、大黃素、甘草次酸、甘草苷以及橙皮苷為檢測指標(biāo)進行含量測定方法考察。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HP-1260 全自動高效液相色譜儀（美國：安捷倫公司）；Simplicity TM 個人型超純水系統(tǒng)（Millipore 公司）；CQ-250 超聲波清洗器（上海船舶電子設(shè)備研究所）；AG-135 電子天平（梅特勒——托利多儀器上海有限公司）。

1.2 材料 大黃酚對照品（批號：171238-200303）、大黃素對照品（批號：171203-200303）、甘草酸銨對照品（批號：171238-200303，甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207）、甘草苷對照品（批號：171203-200303）、橙皮苷對照品（批號：171238-200303）均購自中國食品藥品檢定研究院，供含測用；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。龍甘胃舒分散片（自制，批 號：20171101、20171102、20171103、20180101、20180102、20180103；投料藥材購于江西匯仁堂藥品連鎖有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液 分別精密稱取大黃酚、大黃素、甘草酸銨、甘草苷和橙皮苷對照品10.62，10.16，10.96，10.41，10.71mg，以甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為每1mL 含大黃酚84.96μg、大黃素121.96μg、甘草酸銨131.52μg、甘草苷208.2μg、橙皮苷428.4μg 的混合對照品儲備溶液。精密吸取儲備液2mL 于10mL 容量瓶并加甲醇至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取本品適量，研勻，取約2.0g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，浸泡60min 后加熱回流45min，放冷，再次稱重，以甲醇補充減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液適量以微孔濾膜（0.45μm）濾過，作為供試品溶液。

2.1.3 陰性供試品溶液 取龍甘胃舒分散片制劑處方中缺大黃、甘草和陳皮的其它藥材按制劑處方比例及工藝制備三味藥的陰性制劑，并以其依2.1.2項下供試品溶液方法制得陰性供試品溶液。

2.2 色譜條件的選擇 色譜柱：Dikma Platisil ODS柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸系統(tǒng)（B）梯度洗脫，流動相梯度（0～15min，40%A；15～50min，40%A →90%A；50～60min，90%A；61～70min，40%A），流速：1mL/min，檢測波長283nm。在此條件下，供試品溶液色譜圖中呈現(xiàn)大黃酚、大黃素、甘草酸銨、甘草苷以及橙皮苷對照品相同保留時間的色譜峰，且與其它相鄰色譜峰均能獲得分離度大于2.0 的較好分離，同時測定陰性供試品溶液未出現(xiàn)干擾此五種成分的色譜峰，見圖1。

圖1 陰性供試品溶液-混合對照品溶液-供試品溶液HPLC圖

2.3 線性范圍 取2.2.1 項下混合對照品儲備溶液分別稀釋并配制成不同濃度的混合對照品溶液。分別吸取10μL，注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定，將樣品濃度與峰面積進行回歸，發(fā)現(xiàn)大黃酚、大黃素、甘草酸銨、甘草苷以及橙皮苷濃度與峰面積在一定濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表1。

表1 對照品回歸方程及線性范圍（n=2）

2.4 精密度 精密吸取同一混合對照品溶液10μL，按上述色譜條件，重復(fù)進樣6 次，測定峰面積，計算大黃酚、大黃素、甘草酸銨、甘草苷以及橙皮苷峰面積值的RSD 分別為0.81%、0.72%、0.65%、0.93%和0.88%（n=6）。表明儀器性能穩(wěn)定。

2.5 穩(wěn)定性 精密吸取同一供試品溶液10μL，于0，1，2，4，8，12，24h 分別測定峰面積，結(jié)果24h 內(nèi)供試品溶液中大黃酚、大黃素、甘草酸銨、甘草苷以及橙皮苷峰面積的RSD 分別為1.53%，1.62%，1.71%，1.24%，1.87%，表明方法穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取同一批號制劑6 份，照2.2.2項下供試品溶液制備方法制成供試品溶液，測定并計算大黃酚、大黃素、甘草酸、甘草苷以及橙皮苷含量分別為0.0960，0.1471，0.1208，0.2675，0.6965mg/片，RSD 分別為0.96%，1.57%，0.96%，1.83%，1.61%。

2.7 加樣回收率試驗 取本品適量，研細，取約1.0g，共6 份，精密稱定，分別具塞錐形瓶中，各精密加入每1mL 含0.008552 mg 大黃酚、0.013116mg大黃素、0.012408 mg 甘草酸銨、0.024192 mg 甘草苷以及0.06204 mg 橙皮苷峰的混合對照品溶液25mL，余按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，測定并計算回收率，大黃酚、大黃素、甘草酸銨、甘草苷以及橙皮苷平均加樣回收率分別為98.93%，98.95%，102.57%，99.67%，103.43%，RSD 分 別為1.85%，1.27%，0.92%，0.89%，1.43%。

2.8 含量測定 按“2.2”項下方法制備供試品溶液，測定6 批不同批次制劑中大黃酚、大黃素、甘草酸銨、甘草苷以及橙皮苷的峰面積并計算含量，每批制劑平行操作2 份。結(jié)果見表2。

表2 6批制劑各成分含量（n=2） mg/片

3 討論

3.1 色譜條件 參考2015 年版《中國藥典》中大黃、甘草、陳皮含量測定下色譜條件，實驗中分別對流動相和檢測波長進行了考察，經(jīng)對比采用甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-冰醋酸系統(tǒng)為流動相梯度洗脫后各成分的分離效果，發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.1%磷酸系統(tǒng)為流動相進行梯度洗脫為優(yōu)；鑒于大黃素、大黃酚檢測波長為254nm，甘草酸銨、甘草苷和橙皮苷檢測波長分別為250，237，283nm，通過對以上各檢測波長予以考察，結(jié)合文獻分析并比對各對照品的DAD 光譜分析發(fā)現(xiàn)，各成分色譜峰在250，254，283nm 處分離效果良好，但以283nm 處各峰整體響應(yīng)值均較高，且基線平穩(wěn)，因此最終確定以283nm 作為檢測波長最為適宜。此外，還開展了流動相pH 值、流速、柱溫以及不同品牌色譜柱等色譜條件耐用性的考察，結(jié)果顯示文中建立的方法耐用性良好。

3.2 預(yù)試驗方法考察 供試品的制備方法研究中先后對提取方法（回流、超聲以及是否浸泡）、提取溶劑（50%甲醇、甲醇、70%乙醇、乙醇）、浸泡時間（30，60，120min）、提取時間（30，45，60min）以及溶劑用量（25，50，100mL）進行了單因素考察，結(jié)果顯示以提取1h 為前提，采用甲醇回流提取方法處理的供試品中甘草苷和橙皮苷的提取效果明顯優(yōu)于超聲提取方法，對其他三種成分該二種方法的提取效果相當(dāng)。同時，通過增加浸泡過程亦有助于各成分的提取，而回流提取45min與60min 各成分提取效果無顯著性差異，且不因溶劑用量和浸泡時間的增加而改變。

3.3 龍甘胃舒湯方 用于中醫(yī)證型的胃熱熾盛證和肝氣犯胃證所致的胃脘灼熱，疼痛拒按，口干、口苦等癥已近三十年，前期的臨床及藥理研究表明，其對于幽門螺桿菌（Hp）檢查陽性胃病的臨床治療取得良好效果，為進一步明晰其作用途徑，下一步我們將開展其抗Hp 作用機制研究，同時對影響其藥效的相應(yīng)化學(xué)成分進行進一步篩查并構(gòu)建其基于抗Hp 作用的質(zhì)量評價方法，為臨床Hp患者的治療用藥提供參考。