橙皮素對(duì)17 ℃負(fù)壓環(huán)境下豬精子保存質(zhì)量的影響

李雁冰，王碩，李井春，孫天宇，魏國(guó)生

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

家畜的人工授精技術(shù)起源于20 世紀(jì)初期，并于20 世紀(jì)30 年代掀起了研究熱潮，時(shí)至今日人工授精技術(shù)已成為養(yǎng)殖業(yè)的重要技術(shù)支撐之一。在2011 年1 月1 日頒布的文件《豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范》國(guó)標(biāo)中指出豬常溫精液為“經(jīng)稀釋后在16～18 ℃下短期保存，仍具有受精能率的精液”[1]。人工授精技術(shù)作為重要的繁育方法，其中精液保存是人工授精技術(shù)重要的環(huán)節(jié)至關(guān)重要，與其他牲畜相比豬精子對(duì)溫度變化比較敏感，且常溫保存（17～25 ℃）不需要特殊設(shè)備，操作簡(jiǎn)單方便，便于短期保存等優(yōu)點(diǎn)，因此是生產(chǎn)中豬精液保存的常用方法。在精子常溫保存過(guò)程中，豬精液稀釋液主要是為精子活動(dòng)提供所需的能量，抑制微生物生長(zhǎng)繁殖，創(chuàng)造相對(duì)穩(wěn)定的生存環(huán)境，從而達(dá)到保證豬精液品質(zhì)的目的。目前，豬稀釋液的pH 值、滲透壓、抗氧化能力等是豬精液保存過(guò)程中重要的影響因素，這些影響因數(shù)直接或間接的影響母豬的受胎率，研究表明人工授精中一次輸入損失的精子數(shù)量達(dá)到45%左右，那么通過(guò)提高精液質(zhì)量可提高受胎率[2-3]。

在常溫保存過(guò)程中，由于精子自身代謝等原因產(chǎn)生的大量活性氧（ROS）致使細(xì)胞膜損傷，而在豬稀釋液中添加一定量的外源性抗氧化劑是目前最直接的方法，同時(shí)降低精子代謝速度也是有效措施。橙皮素（Hesperetin：Vitamin P）屬于生物類(lèi)黃酮，植物提取物，具有消除氧自由基、抗氧化、抗癌等功能。在近些年相關(guān)研究中，劉亞偉[4]發(fā)現(xiàn)低溫保存中向豬精液稀釋液中添加橙皮素顯著地提高了精液的品質(zhì)，除此之外，橙皮素在豬精液常溫保存相關(guān)領(lǐng)域鮮有報(bào)道。在精液常溫保存時(shí)，在豬精液中加入稀釋液可以為精子提供一定能量，同時(shí)減少豬精子能量消耗，使精子存活的時(shí)間更長(zhǎng)，提高精子的受精能力[5]。目前商品豬精液常溫保存多為3～5 d，為了更好地延長(zhǎng)精子存活時(shí)間，提高精子的受精能力，試驗(yàn)通過(guò)在Modena稀釋液中添加不同劑量的橙皮素，同時(shí)采用17 ℃和負(fù)壓環(huán)境條件，從溫度與低氧兩個(gè)方面降低精子代謝速度。試驗(yàn)利用邁朗全自動(dòng)精子質(zhì)量檢測(cè)儀檢測(cè)精子活率、活力、直線速度、側(cè)擺幅度、鞭打頻率、畸形率等質(zhì)量參數(shù)，探究橙皮素在17 ℃負(fù)壓環(huán)境下對(duì)豬精液保存效果，為稀釋液配方的完善提供一定的基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

橙皮素購(gòu)于上海源液生物技術(shù)有限公司；Modena 稀釋液組成為每1 L 溶液中含：青霉素0.074 g；鏈霉素0.05 g；葡萄糖27.50 g；NaHCO31 g；檸檬酸2.9 g；檸檬酸鈉6.9 g；TRIS 5.65 g；EDTA-2Na 2.6 g；BSA 4 g。Modena 稀釋液藥品成分均購(gòu)自西格瑪公司。

1.1 精液來(lái)源

精液采自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)豬場(chǎng)，采集3 頭健康長(zhǎng)白種公豬混合精液，年齡為2～3 歲。無(wú)異味、色澤為乳白色、精子活力在0.7 以上的精液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 豬精液的稀釋

精液運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室后，將精液從保溫箱中取出放入無(wú)菌操作臺(tái)，用3 層紗布包裹后在室溫下平衡降溫30 min。平衡降溫后取10 μL 原精液滴入載玻片上，并放于37 ℃加熱板上孵育2～3 min，通過(guò)邁朗全自動(dòng)精子分析儀檢測(cè)12 個(gè)視野區(qū)的豬精子質(zhì)量參數(shù)，精子活力不低于0.7[6]，精子質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)后進(jìn)行對(duì)原精液的稀釋處理。豬精液稀釋處理方法為將原精液分裝入15 mL 離心管中進(jìn)行離心，離心轉(zhuǎn)數(shù)為1 800 r·min-1，離心時(shí)間為5 min。離心后去除上清液，采用精板計(jì)數(shù)法檢測(cè)離心后的濃縮精液的精子密度，用各組試劑稀釋液將濃縮精液稀釋計(jì)算調(diào)整密度為1×108個(gè)·mL-1，精液離心后對(duì)精液稀釋過(guò)程要在15 min 內(nèi)完成，避免由于精子沉積而造成機(jī)械損傷，稀釋后各稀釋組在室溫下保存待用。

1.3.2 精液保存處理

將稀釋后的各組試管口用鋁紙包裹封口，將各組試管緩慢置于負(fù)壓保存瓶中，用帶有空氣流通開(kāi)關(guān)的活塞密封負(fù)壓保存瓶，將負(fù)壓保存瓶連接真空泵機(jī)，通過(guò)真空泵機(jī)將負(fù)壓保存瓶調(diào)整負(fù)壓為0.4 倍大氣壓強(qiáng)。負(fù)壓處理后將負(fù)壓保存瓶置于17 ℃恒溫箱中保存。每隔12 h 對(duì)各組試管中的精液進(jìn)行緩慢混勻，避免精子沉聚而損傷。

1.3.3 精子質(zhì)量參數(shù)的檢測(cè)

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在保存的各時(shí)間段（0 h，1，2，3，4，5 d）定時(shí)取樣，樣品需在37 ℃加熱板上復(fù)蘇2～3 min，通過(guò)邁朗全自動(dòng)精子分析儀檢測(cè)精子活率、活力、直線速度、側(cè)擺幅度、鞭打頻率、畸形率等質(zhì)量參數(shù)，并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)計(jì)5 組，在Modena 基礎(chǔ)稀釋液中添加橙皮素，調(diào)節(jié)濃度分別為0 L、40、80、120、160 μg·mL-1的橙皮素，試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)試驗(yàn)。通過(guò)邁朗全自動(dòng)精子分析儀檢查不同的保存時(shí)間下精子活率、活力、直線速度、側(cè)擺幅度、鞭打頻率、畸形率等質(zhì)量參數(shù)。1

.5 統(tǒng)計(jì)分析

將各時(shí)間段的各試驗(yàn)組質(zhì)量參數(shù)數(shù)據(jù)利用Excel 進(jìn)行匯總，再利用StatView 5.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行方差分析和多重比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不同，表示差異顯著P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 橙皮素對(duì)精子活率的影響

由表1 可知，添加橙皮素后0 μg·mL-1L 組在17 ℃負(fù)壓環(huán)境下保存1～2 d 時(shí)的精子活率顯著高于160 μg·mL-1組（P＜0.05），而40、80、120 μg·mL-1組之間差異不明顯；在保存3 d 時(shí)，0、40 μg·mL-1組精子活率顯著高于80、120、160 μg·mL-1組（P＜0.05）；在4～5 d內(nèi)40 μg·mL-1組的精子活率顯著高于其組，且80、120 μg·mL-1組精子活率顯著高于0、160 μg·mL-1組（P＜0.05）。

表1 橙皮素對(duì)精子活率的影響（單位：%）Table 1 The effect of hesperetin on sperm motility rate（unit:%）

2.2 橙皮素對(duì)精子活力的影響

由表2 可知，添加橙皮素后0、40 μg·mL-1組在17 ℃環(huán)境下保存1～2 d 時(shí)的精子活力顯著高于80、120、160 μg·mL-1組（P＜0.05）；在17 ℃環(huán)境下保存3 d 時(shí)，40、80 μg·mL-1組精子活力顯著高于0、120、160 μg·mL-1組且120、160 μg·mL-1組精子活力顯著高于0 μg·mL-1組（P＜0.05）；在17 ℃環(huán)境下保存4～5 d的時(shí)間內(nèi)40、80 μg·mL-1組的精子活力顯著高于0、120、160 μg·mL-1組（P＜0.05）。

表2 橙皮素對(duì)精子活力的影響（單位：%）Table 2 The effect of hesperetin on sperm motility（unit:%）

2.3 橙皮素對(duì)精子直線速度的影響

由表3 可知，添加橙皮素后在17 ℃負(fù)壓環(huán)境下保存2 d 時(shí)，40 μg·mL-1組精子的直線速度顯著高于其他組（P＜0.05）；在保存3～4 d 內(nèi)40、80 μg·mL-1組的直線速度顯著高于其他組（P＜0.05）；在保存5 d時(shí)、40、80 μg·mL-1組的精子直線速度顯著高于120、160 μg·mL-1組（P＜0.05）。

表3 橙皮素對(duì)精子直線速度的影響（單位：μm·s-1）Table 3 The effect of hesperetin on sperm linear velocity（unit:%）

2.4 橙皮素對(duì)精子側(cè)擺幅度的影響

由表4 可知，添加橙皮素后在17 ℃負(fù)壓環(huán)境下保存1～2 d 內(nèi)的精子側(cè)擺幅度各組間無(wú)顯著差異（P＜0.05）；在保存3 d 時(shí)，各試驗(yàn)組精子側(cè)擺幅度顯著高于0 μg·mL-1組（P＜0.05）；在保存4～5 d 內(nèi)40、80 μg·mL-1組 的 直 線 速 度 顯 著 高 于0、120、160 μg·mL-1組（P＜0.05）。

表4 橙皮素對(duì)精子側(cè)擺幅度的影響（單位：μm）Table 4 The effect of hesperetin on sperm Side swing amplitude（unit: μm）

2.5 橙皮素對(duì)精子鞭打頻率的影響

由表5 可知，添加橙皮素后、160 μg·mL-1組（P＜0.05）在17 ℃環(huán)境下保存1 d 時(shí)的精子鞭打頻率顯著高于120 μg·mL-1組（P＜0.05），其中0、80、160 μg·mL-1組（P＜0.05）之間的精子鞭打頻率無(wú)顯著差異，40、80、120 μg·mL-1組（P＜0.05）之間的精子鞭打頻率無(wú)顯著差異；在17 ℃環(huán)境下保存2 d 時(shí)5 個(gè)試驗(yàn)組別的精子鞭打頻率無(wú)顯著差異；在17 ℃環(huán)境下保存3 d 時(shí)0 μg·mL-1組的精子鞭打頻率顯著高于40、80、120、160 μg·mL-1組（P＜0.05）；其中80 μg·mL-1組的精子鞭打頻率顯著高于40 μg·mL-1組（P＜0.05），且80、120、160 μg·mL-1組（P＜0.05）之間無(wú)顯著差異，40、120、160 μg·mL-1組（P＜0.05）之間無(wú)顯著差異；在17℃環(huán)境下保存4～5 d 時(shí)5 個(gè)試驗(yàn)組別的精子鞭打頻率無(wú)顯著差異。

表5 橙皮素對(duì)精子鞭打頻率的影響（單位：Hz）Table 5 The effect of hesperetin on sperm beat cross frequency（unit: Hz）

2.6 橙皮素對(duì)精子畸形率的影響

由表6 可知，添加橙皮素后40 μg·mL-1組在17 ℃負(fù)壓環(huán)境下保存1 d 時(shí)的精子畸形率顯著低于其他組（P＜0.05），在保存2～4 d 時(shí)0、120、160 μg·mL-1的精子畸形率顯著高于40、80 μg·mL-1組（P＜0.05）；在保存5 d 時(shí)0、160 μg·mL-1組（P＜0.05）的精子畸形率顯著高于80、120、40 μg·mL-1組（P＜0.05），且120、80 μg·mL-1組之間無(wú)顯著差異（P＜0.05）。

表6 橙皮素對(duì)精子畸形率的影響（單位：%）Table 6 The effect of hesperetin on abnormal sperm rate（unit:%）

3 討論

試驗(yàn)中，選用的Modena 稀釋液對(duì)精子保存效果良好[7-8]。在豬精液中添加稀釋液能夠?yàn)樨i精子提供類(lèi)似于睪丸內(nèi)的理想存活環(huán)境，提高豬精子細(xì)胞膜的完整性，去除不利于豬精子長(zhǎng)期保存的影響因素，為豬精子提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)在提高豬精液質(zhì)量和豬精子受精力的前提下降低豬精子代謝強(qiáng)度，使豬精子達(dá)到可逆轉(zhuǎn)的休眠狀態(tài)。在豬的稀釋粉中所含的多種成分對(duì)精液長(zhǎng)期保存影響較大[9]，試驗(yàn)在Modena 稀釋液中的葡萄糖等可以為豬精子代謝提供能量，緩沖物質(zhì)可維持豬精液pH 的穩(wěn)定，碳酸氫鈉、檸檬酸鈉可以中和細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，從而維持相對(duì)穩(wěn)定的pH 環(huán)境[6]。而試驗(yàn)中在稀釋液中添加橙皮素，目的在于提高精液的抗氧化能力，減弱由于豬精子和細(xì)菌代謝所產(chǎn)生的ROS 對(duì)豬精子的損傷，完善稀釋液的功能，為豬精子提供更易存活的理想環(huán)境。

在精子質(zhì)量檢測(cè)中精子活率是反映精液質(zhì)量的常規(guī)指標(biāo)[10]。精子的活率指標(biāo)和精子的運(yùn)動(dòng)性能參數(shù)與精子細(xì)胞結(jié)構(gòu)和精子功能存在高度的相關(guān)性，通過(guò)檢測(cè)這些質(zhì)量參數(shù)可以預(yù)測(cè)精子的潛在授精能力[11]。精子的運(yùn)動(dòng)性與授精能力存在相關(guān)性，是最重要的檢測(cè)手段之一，精子的運(yùn)動(dòng)性包括精子活率和運(yùn)動(dòng)速度[12-13]。所以試驗(yàn)通過(guò)邁朗全自動(dòng)精子分析儀檢測(cè)精子活率和運(yùn)動(dòng)速度，從試驗(yàn)結(jié)果可知，隨著保存時(shí)間的增加，在4～5 d 期間40 μg·mL-1組的精子活率顯著高于其他組。這與劉亞偉[4]的研究結(jié)果趨于一致，橙皮素具有清除自由基和抗氧化的能力，其作用機(jī)理主要是阻止自由基在細(xì)胞內(nèi)形成的3 個(gè)階段，即與O2-反應(yīng)阻止自由基引發(fā)；與金屬離子螯合阻止OH-生成；與脂質(zhì)過(guò)氧基ROO-反應(yīng)阻止脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，橙皮素對(duì)常溫保存的豬精液品質(zhì)有一定程度的提高。在試驗(yàn)中，在2 d 時(shí)各組都發(fā)現(xiàn)一定量的細(xì)菌滋生，這也可能是0 μg·mL-1組在3～4 d 時(shí)精子活率相較其他4 個(gè)試驗(yàn)組下降趨勢(shì)明顯的主要原因。茆達(dá)干等[14]研究表明，精液中滋生一定量細(xì)菌后對(duì)精液保存效果影響較大，造成精子活力、頂體完整率、精液pH 值等質(zhì)量參數(shù)大幅度下降。試驗(yàn)說(shuō)明一定濃度的橙皮素能提高精子活率，并有一定的抑菌作用，橙皮素濃度為40 μg·mL-1為最佳。

實(shí)踐證明，所輸精液量和精子活力對(duì)配種效率、產(chǎn)仔數(shù)、仔豬斷奶成活率、斷奶體重和生產(chǎn)性能都有很大影響，活力對(duì)于精子受精能力是很重要的，是保證精子在受精過(guò)程中與卵子相遇的重要條件[15-16]。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出隨著保存時(shí)間的增加，稀釋液中的精子活力呈明顯下降趨勢(shì)。在17 ℃環(huán)境下保存的2 d 內(nèi)，0 μg·mL-1組、40 μg·mL-1組的精子活力已顯著高于其他試驗(yàn)組，但在第3 d 起40 μg·mL-1組的精子活力顯著優(yōu)于其他4 個(gè)試驗(yàn)組，且對(duì)照組保存效果最不理想，究其原因可能是4 個(gè)試驗(yàn)組在試驗(yàn)2 d開(kāi)始有存在不同程度的細(xì)菌滋生。精子直線速度參數(shù)是反映精子活力的重要指標(biāo)之一，無(wú)論是直線運(yùn)動(dòng)的精子，還是環(huán)繞運(yùn)動(dòng)的豬精子或者是原地運(yùn)動(dòng)的豬精子，它們都有活動(dòng)的能力，可以說(shuō)都有活力[17]。而直線運(yùn)動(dòng)的精子才屬于有效精子，因而精子的直線速度相較于其他速度指標(biāo)更具有代表性。試驗(yàn)中從2 d 開(kāi)始，40 μg·mL-1組精子的直線速度顯著高于其他組，而1 d 時(shí)各組差異不明顯，研究表明黃酮類(lèi)化合物被吸收后往往通過(guò)血清白蛋白進(jìn)行貯存和運(yùn)送，進(jìn)而發(fā)揮作用[18]。而橙皮素與血清蛋白形成絡(luò)合物的時(shí)間與Cu2+等金屬離子有關(guān)，而精液稀釋液配制采用的均為去離子水，可能因此影響了藥效發(fā)揮時(shí)間。從而說(shuō)明一定濃度的橙皮素能提高精子直線速度和間接提高精子活力，對(duì)精子保存有促進(jìn)作用，橙皮素濃度為40 μg·mL-1為最佳。

哺乳動(dòng)物精子在進(jìn)出雌性生殖道獲能前運(yùn)動(dòng)方式變化很大，在此期間精子經(jīng)歷了復(fù)雜的生理變化，運(yùn)動(dòng)方式發(fā)生了很大的改變，運(yùn)動(dòng)狀態(tài)更為強(qiáng)烈，表現(xiàn)出“鞭打”“小環(huán)形拋物”等運(yùn)動(dòng)形式，這樣的過(guò)程被稱(chēng)為超激活[19]，超激活主要表現(xiàn)形式是鞭毛鞭打的程度不對(duì)稱(chēng)性和相對(duì)較高的鞭打振幅[20]。超激活現(xiàn)象與精子的運(yùn)動(dòng)方式有關(guān)，有學(xué)者將側(cè)擺幅度（ALH）≥7 μm 作為其參數(shù)指標(biāo)，用以鑒定超激活運(yùn)動(dòng)。精子的鞭打頻率即精子的頭部運(yùn)動(dòng)偏離精子運(yùn)動(dòng)平均路徑的頻率，由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著時(shí)間的推移，所有試驗(yàn)組別的精子鞭打頻率呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，但是并未篩選出最適宜濃度組，但試驗(yàn)組與對(duì)照組的精子鞭打頻率并無(wú)顯著差異，說(shuō)明添加適量濃度橙皮素試驗(yàn)組對(duì)于精子鞭打頻率并無(wú)抑制作用，對(duì)此其相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。同時(shí)畸形率對(duì)精子運(yùn)動(dòng)性也存在一定的影響，研究表明化學(xué)物質(zhì)，環(huán)境溫度，細(xì)菌病毒感染，遺傳因素等均可引起精子畸形。從試驗(yàn)結(jié)果可知，添加橙皮素后在3～4 d 內(nèi)40 μg·mL-1組、80 μg·mL-1組的側(cè)擺幅度顯著高于其他組，且40 μg·mL-1組從1 d 開(kāi)始畸形率要明顯低于其他組，說(shuō)明橙皮素抗病毒抑菌作用在極低濃度就可抑制致病革蘭氏陰性菌，從而降低了畸形率和提高側(cè)擺幅度。同時(shí)試驗(yàn)采用負(fù)壓處理，模擬公豬睪丸負(fù)壓低氧環(huán)境，可有效降低精液含氧量，減緩精子代謝過(guò)程，再結(jié)合橙皮素的抗氧化和抗病毒抑菌作用，從而提高精液配方的抗氧化性和抑菌作用，延長(zhǎng)精液的保存時(shí)間。

4 結(jié)論

試驗(yàn)得出在精液基礎(chǔ)液中添加一定量的橙皮素在17 ℃負(fù)壓環(huán)境下可顯著提高豬精子的活率、直線速度、側(cè)擺幅度，降低精子畸形率。其中40 μg·mL-1組各項(xiàng)參數(shù)顯著優(yōu)于其他組，添加40 μg·mL-1的橙皮素最有利于豬精子在17 ℃環(huán)境下的保存，研究結(jié)果為豬人工授精生產(chǎn)實(shí)踐中精液保存技術(shù)的發(fā)展提供依據(jù)。