基于碳量子點(diǎn)熒光恢復(fù)檢測(cè)牛奶中多巴胺殘留

王騰飛，朱嘉薇，霍梅俊，唐佳琪，武文英

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 外事處，山西 太谷 030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，山西 太谷 030801)

我國(guó)是一個(gè)食品生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，食品安全問(wèn)題不容忽視。獸藥殘留是全球最受關(guān)注的食品安全問(wèn)題之一，獸藥殘留對(duì)人體、環(huán)境都有很大危害，導(dǎo)致人體中毒事件比比皆是，牛奶作為每個(gè)家庭必不可少的食品，需求量也越來(lái)越大，然而目前乳制品的安全問(wèn)題并不樂(lè)觀[1,2]。

鹽酸克倫特羅(俗稱(chēng)“瘦肉精”)作為一種飼料添加劑，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而提高動(dòng)物飼料利用率，但其在動(dòng)物性食品中的殘留給人體健康帶來(lái)威脅[3]。歐盟和美國(guó)先后在1988年、1991年禁止將克倫特羅作為獸藥飼料添加劑, 中國(guó)在1997年明確禁止將該類(lèi)藥物添加在飼料中添加。中國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定, 克倫特羅在所有動(dòng)物性食品中不得檢出[4]。鹽酸多巴胺又稱(chēng)多巴胺鹽酸鹽，是“瘦肉精”的一種。目前較為常用的檢測(cè)方法有高效液相色譜紫外檢測(cè)法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜檢測(cè)法、電化學(xué)分析、化學(xué)分析法、分光光度法等，而以上檢測(cè)方法都存在儀器昂貴、檢測(cè)范圍受限制、不夠靈敏快速、前處理復(fù)雜、成本高等缺點(diǎn)[5～7]。熒光碳量子點(diǎn)檢測(cè)不僅快速、成本低，還具有高效準(zhǔn)確、靈敏度高等突出優(yōu)點(diǎn)，在檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用也越來(lái)越廣泛[8～10]。本文旨在從原料上對(duì)碳量子點(diǎn)合成進(jìn)行創(chuàng)新，用綠色環(huán)保、價(jià)格低廉的生物材料作為碳源合成量子點(diǎn)[11]。

本文利用小麥、大米、玉米作為3種碳源，通過(guò)水熱法一步合成3種碳量子點(diǎn)，根據(jù)碳量子點(diǎn)的發(fā)光特性，與不同濃度鐵離子結(jié)合后碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度降低，再利用鹽酸多巴胺與鐵離子絡(luò)合作用，將鐵離子剝離下來(lái)釋放量子點(diǎn)，同時(shí)碳量子點(diǎn)熒光恢復(fù)的原理來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)牛奶中的獸藥鹽酸多巴胺殘留[9,12,13]，盡可能的防止人類(lèi)食用有鹽酸多巴胺殘留的動(dòng)物性食品而引起的中毒，保障人的食品安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥、大米、玉米和牛奶(市售)，F(xiàn)eCl3、FeCl2、KCl、NaCl、MgCl2、CuCl2(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，鹽酸多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品(98%)、50%三氯乙酸(阿拉丁試劑(上海)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

AR224CN型電子天平：奧豪斯儀器(常州)有限公司；LK100型粉碎機(jī)：武漢理科光電技術(shù)有限公司；WF型聚四氟乙烯水熱反應(yīng)釜：威海自控反應(yīng)釜有限公司；YHG-400-BS-Ⅱ型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；F96S型熒光分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；Cary60型紫外分光光度計(jì)：安捷倫科技(中國(guó))有限公司；SC-3610型低速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 量子點(diǎn)的合成

本試驗(yàn)運(yùn)用水熱法制取碳量子點(diǎn)。稱(chēng)取4 g小麥加入40 mL水，放入粉碎機(jī)中粉碎3 min，將粉碎好的溶液倒入50 mL聚四氟乙烯水熱反應(yīng)釜中，旋緊蓋子后置于電熱鼓風(fēng)干燥箱，180 ℃下加熱5 h。將制取的量子點(diǎn)溶液冷卻至室溫，用5 mL的一次性注射器吸取量子點(diǎn)溶液，通過(guò)濾膜過(guò)濾到用鋁箔包裹好的離心管中，4 ℃避光條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

取2 mL稀釋1 000倍的量子點(diǎn)溶液于比色皿，掃描其紫外吸收光譜圖和在λex=365 nm、λem=440 nm處的熒光光譜圖。

1.3.2 鐵離子與量子點(diǎn)的結(jié)合

配置濃度范圍為1 000～20 000 μmol·L-1的FeCl3溶液。取100 μL稀釋100倍的碳量子點(diǎn)溶液和100 μL FeCl3溶液于具塞比色管中，在室溫下混合并定容至10 mL，靜置30 min。取2 mL混合液于比色皿中檢測(cè)其在λex=365 nm、λem=440 nm處的熒光強(qiáng)度，確定使碳量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度猝滅的鐵離子線性濃度范圍。

1.3.3 鹽酸多巴胺的檢測(cè)

用鹽酸多巴胺標(biāo)品配置不同濃度的鹽酸多巴胺溶液(濃度分別為1、10、50、100和110 μmol·L-1)，取100 μL稀釋100倍的碳量子點(diǎn)、100 μL一定濃度的FeCl3溶液、100 μL的鹽酸多巴胺溶液于具塞比色管中，在室溫下混合并定容至10 mL，靜置30 min。取2 mL上述混合液于比色皿，檢測(cè)混合液在λex=365 nm、λem=440 nm處的熒光強(qiáng)度找到使碳量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度恢復(fù)的鹽酸多巴胺線性濃度范圍及檢出限。

1.3.4 實(shí)際樣品的應(yīng)用

取8 mL牛奶于15 mL離心管中，加入3 mL三氯乙酸(50%)進(jìn)行去蛋白，放入低速離心機(jī)離心5 min，取上層清液備用。取100 μL稀釋100倍的碳量子點(diǎn)、100 μL一定濃度的FeCl3和100 μL上述離心上清液于具塞比色管中，室溫下混勻并定容至10 mL，靜置30 min。將2 mL上述混合液于比色皿中，檢測(cè)其在λex=365 nm、λem=440 nm處的碳量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳量子點(diǎn)的選擇

碳量子點(diǎn)合成原料不同，合成的碳量子粒徑和發(fā)光特性也有可能不同，本試驗(yàn)分別用小麥、大米、玉米作為3種生物碳源，按照相同的合成方式制取3種碳量子點(diǎn)，分別比較它們的紫外吸收光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度(圖1～圖3)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3種碳量子點(diǎn)在435～445 nm處熒光強(qiáng)度有一個(gè)特征峰。比較3種碳量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示小麥量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于其他兩種碳量子點(diǎn)。并且以上3種量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度在15 d內(nèi)都趨于穩(wěn)定，光穩(wěn)定性好。

圖1 稀釋1 000倍小麥碳量子點(diǎn)的紫外吸收光譜圖(A)和熒光光譜圖(B)Fig.1 Ultraviolet absorption spectra (A) and fluorescence spectra (B) of wheat carbon quantum dots diluted 1 000 times

圖2 稀釋1 000倍大米碳量子點(diǎn)的紫外吸收光譜圖(A)與熒光光譜圖(B)Fig.2 Ultraviolet absorption spectra (A) and fluorescence spectra (B) of rice carbon quantum dots diluted 1 000 times in rice

圖3 稀釋1 000倍玉米碳量子點(diǎn)紫外吸收光譜圖(A)和熒光光譜圖(B)Fig.3 Ultraviolet absorption spectra (A) and fluorescence spectra (B) of rice carbon quantum dots diluted 1 000 times in corn

2.2 鐵離子及其濃度的確定

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鐵離子的濃度對(duì)碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度影響較大，并選擇牛奶中可能存在的其它金屬離子：Na+、Mg2+、Fe2+和Cu2+進(jìn)行干擾測(cè)試。取2 mL鐵離子(130 μmol·L-1)與稀釋1 000倍碳量子點(diǎn)的混合液檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，再按相同方法檢測(cè)同濃度的其它離子與碳量子點(diǎn)混合溶液的熒光強(qiáng)度。試驗(yàn)結(jié)果表明，有上述離子存在時(shí)對(duì)碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度影響微乎其微。

本試驗(yàn)用小麥碳量子點(diǎn)分別與不同濃度FeCl3結(jié)合，檢測(cè)小麥量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度隨鐵離子濃度增大而降低(圖4)，鐵離子濃度線性范圍為10～150 μmol·L-1(圖5)。本試驗(yàn)選擇鐵離子的濃度為130 μmol·L-1。(注：F0為CQDs熒光強(qiáng)度、F為CQDs-Fe3+熒光強(qiáng)度)

圖4 不同濃度鐵離子對(duì)碳量子點(diǎn)的熒光猝滅情況Fig.4 Fluorescence quenching of carbon quantum dots by iron ions at different concentrations

圖5 鐵離子濃度與碳量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度線性關(guān)系Fig.5 Linear relationship between iron ion concentration and fluorescence intensity of carbon quantum dots

2.3 鹽酸多巴胺的檢出限和線性范圍

鹽酸多巴胺表面含有豐富的羥基、氨基，向猝滅后的小麥碳量子點(diǎn)溶液中加入不同濃度鹽酸多巴胺，碳量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度會(huì)有所恢復(fù)，推測(cè)是鹽酸多巴胺與鐵發(fā)生離子絡(luò)合，產(chǎn)生比靜電作用力更強(qiáng)的作用力，將碳量子點(diǎn)釋放出來(lái)，熒光信號(hào)被恢復(fù)，碳量子點(diǎn)熒光信號(hào)“打開(kāi)”。

為了提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)進(jìn)行了反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化，待測(cè)物質(zhì)定容到具塞比色皿中，室溫下混合均勻，分別檢測(cè)其靜置0、10、30、40、60 min后的熒光強(qiáng)度，試驗(yàn)結(jié)果顯示，混合均勻后，靜置30 min后溶液熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，推測(cè)30 min后鹽酸多巴胺與鐵離子反應(yīng)完全，碳量子點(diǎn)熒光恢復(fù)完成,因此本試驗(yàn)選擇靜置30 min后進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明隨鹽酸多巴胺濃度增大，碳量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度恢復(fù)的越高(圖6)，在1～110 μmol·L-1范圍內(nèi)呈很好的線性，檢出限為0.3 μmol·L-1(圖7)。(注：F為CQDs-Fe3+熒光強(qiáng)度、F1為CQDs-Fe3+加入鹽酸多巴胺的熒光強(qiáng)度)

圖6 加入不同濃度鹽酸多巴胺后碳量子點(diǎn)的熒光恢復(fù)情況Fig.6 Fluorescence recovery of carbon quantum dots after adding different concentrations of dopamine hydrochloride

圖7 鹽酸多巴胺濃度與碳量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度線性關(guān)系Fig.7 Linear relationship between dopamine hydrochloride concentration and fluorescence intensity of carbon quantum dots

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)分析

本試驗(yàn)選擇當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的純牛奶作為檢測(cè)樣品，用三氯乙酸(50%)去蛋白后離心，取上清液分別加入不同濃度鹽酸多巴胺，使得鹽酸多巴胺在牛奶中的濃度為10、50、100 mol·L-1，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，按照上述檢測(cè)方法檢測(cè)，得到加標(biāo)回收率為82.38%～104.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.09%～2.01%(表1)。

表1 實(shí)際樣品的回收率Table 1 Recovery of real samples

3 討論與結(jié)論

獸藥殘留是是我國(guó)乃至全球食品安全的核心問(wèn)題之一，根據(jù)近年來(lái)報(bào)告顯示，我國(guó)人均飲奶量逐年上升，牛奶的需求量也大大增加[2]。隨之而來(lái)的乳制品安全問(wèn)題也受到極大關(guān)注，加強(qiáng)對(duì)牛奶生產(chǎn)鏈的安全監(jiān)管刻不容緩，建立高效、靈敏的有害物質(zhì)檢測(cè)方法十分必要。

陳志兵等曾報(bào)道CdTe量子點(diǎn)與鹽酸多巴胺組建二元體系檢測(cè)鹽酸多巴胺。目前已知合成量子點(diǎn)的材料多數(shù)為金屬材料，甚至很多是有毒金屬，不僅污染環(huán)境、操作過(guò)程復(fù)雜，原料價(jià)格也比較昂貴[14]。小麥、大米、玉米是3種常見(jiàn)的糧食，為人類(lèi)日常食用的種類(lèi)，擁有易獲取、價(jià)格低廉、低毒性等特點(diǎn)。本文通過(guò)水熱法一步合成3種不同的碳量子點(diǎn)，對(duì)構(gòu)建先進(jìn)、可持續(xù)和環(huán)境友好型光電檢測(cè)提供了新思路。

熒光檢測(cè)法具有高效快速檢測(cè)的特點(diǎn)，目前為止，大多試驗(yàn)是運(yùn)用熒光探針來(lái)檢測(cè)一種金屬離子，通過(guò)表面帶負(fù)電的量子點(diǎn)基團(tuán)與金屬陽(yáng)離子經(jīng)靜電作用力結(jié)合，引起量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度變化，通過(guò)觀察量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度變化來(lái)定量分析某種金屬離子，檢測(cè)物質(zhì)的范圍比較窄，有很大的局限性[15～17]。本文采用“開(kāi)-關(guān)-開(kāi)”熒光檢測(cè)原理來(lái)檢測(cè)牛奶中的獸藥鹽酸多巴胺。利用碳量子點(diǎn)自身發(fā)光的原理，與帶正電的鐵離子以靜電力結(jié)合，通過(guò)發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，從而發(fā)生碳量子點(diǎn)的熒光猝滅現(xiàn)象，導(dǎo)致碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度降低，“關(guān)閉”碳量子點(diǎn)熒光信號(hào)[13]。在猝滅后的體系中加入一定濃度的鹽酸多巴胺，可以將鐵離子從碳量子點(diǎn)表面剝離下來(lái)并與鹽酸多巴胺結(jié)合，釋放被猝滅的碳量子點(diǎn)，量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度上升，熒光信號(hào)被“打開(kāi)”[12]。通過(guò)觀察碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度先下降后上升來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶中鹽酸多巴胺的檢測(cè)。此方法大大拓寬了量子點(diǎn)痕量檢測(cè)的范圍，建立了一種新的檢測(cè)痕量物質(zhì)的機(jī)理，使得量子點(diǎn)在檢測(cè)痕量物質(zhì)方面發(fā)揮更大的意義。

本文以常見(jiàn)糧食小麥、大米、玉米作為碳源材料制備了一種新型熒光探針，利用鐵離子與碳量子點(diǎn)電子轉(zhuǎn)移引起碳量子點(diǎn)熒光猝滅以及鹽酸多巴胺與鐵離子之間的絡(luò)合作用，檢測(cè)牛奶中的獸藥鹽酸多巴胺殘留。最優(yōu)條件下，鹽酸多巴胺在1～110 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)與碳量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度變化呈線性關(guān)系，檢出限為0.3 μmol·L-1，牛奶中的回收率為82.38%～104.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.09%～2.01%，證明了該方法的靈敏性、適用性和準(zhǔn)確性。

綜上所述，本文采用日常食用的糧食作為量子點(diǎn)的原料，避免了使用重金屬作為原料的污染。通過(guò)量子點(diǎn)-鐵熒光探針檢測(cè)鹽酸多巴胺，構(gòu)建了三元體系，可用于檢測(cè)與量子點(diǎn)沒(méi)有直接相互作用的目標(biāo)物，為建立更多無(wú)熒光物質(zhì)的熒光檢測(cè)新方法提供理論依據(jù)，大大拓展了量子點(diǎn)在分析檢測(cè)方面的應(yīng)用。在今后的研究中，通過(guò)修飾量子點(diǎn)表面的官能團(tuán)，建立選擇性更強(qiáng)，靈敏度更高的熒光探針?lè)椒ň哂袕V闊的發(fā)展前景。