谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因家族鑒定及表達(dá)分析

武懿茂，樊武哲，李紅英*，李雪垠*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

谷子(Setariaitalica(L.) P. Beauv.)是禾本科狗尾草屬二倍體(2n=2X=18)一年生草本植物[1]。谷子起源于中國(guó)[2]，是一種傳統(tǒng)的糧食作物，主要生長(zhǎng)在中國(guó)黃河流域中上游的干旱和半干旱地區(qū)[3]，有著8700多年的栽培歷史[4]，其在中國(guó)農(nóng)產(chǎn)品中占據(jù)著重要地位。谷子基因組較小(約510 Mb)[5]、生育期短[6]、與其它主要糧食作物親緣關(guān)系較近，已逐漸成為禾本科C4植物基因組學(xué)研究的理想模式作物[7]。

隨著全球變暖、地下水位下降、地表水源不足，干旱已經(jīng)成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一[8]，發(fā)掘作物抗旱基因、開展抗旱育種迫在眉睫。眾所周知，谷子具有耐旱、耐瘠薄和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，是節(jié)水減肥的理想作物[9]。因此，研究谷子抗旱機(jī)制對(duì)發(fā)掘抗旱基因、提高作物抗旱性、發(fā)展節(jié)水農(nóng)業(yè)，進(jìn)而保證作物產(chǎn)量具有重要意義[10]。

蛋白激酶(Protein Kinase, PK)是一類催化蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)的酶，廣泛存在于植物體中[11]。蛋白激酶的催化亞基是高度保守的，在催化結(jié)構(gòu)域的中心存在保守的天冬氨酸，對(duì)酶催化活性起關(guān)鍵作用[12]。蛋白激酶參與調(diào)控植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆等多種生理反應(yīng)，在調(diào)節(jié)作物抗旱方面起著重要作用[13]。蛋白激酶主要包括PKc、CDPK、SnRK等家族，其中PKc通過調(diào)節(jié)二?；视?DAG)或鈣離子(Ca2+)濃度，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[14]。鈣依賴蛋白激酶(CDPK)參與植物非生物脅迫響應(yīng)，研究表明轉(zhuǎn)AtCDPK1基因馬鈴薯植株抗旱性顯著增強(qiáng)[15]；在水稻中過表達(dá)OsCDPK7能顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性[16]。SnRK2家族成員在脫落酸(ABA)信號(hào)通路和介導(dǎo)植物干旱脅迫信號(hào)中發(fā)揮重要作用[17]。SnRK2C也可介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)一系列干旱脅迫響應(yīng)基因，使得擬南芥的耐旱性增強(qiáng)[18]；MpSnRK2.10過表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥和蘋果的抗旱性[19]。

目前，谷子中抗旱相關(guān)蛋白激酶家族基因的研究報(bào)道較少，本研究通過抗旱品種勾勾母雞咀(GG)和干旱敏感品種晉汾16(JF16)在干旱條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選并鑒定谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)和基因表達(dá)分析，旨在為谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因的發(fā)掘與功能鑒定奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因鑒定及染色體定位分析

勾勾母雞咀(GG)為抗旱谷子品種，晉汾16(JF16)為干旱敏感品種。為了鑒定谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因，我們從干旱處理?xiàng)l件下勾勾母雞咀和晉汾16的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中篩選差異表達(dá)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P值<0.05、FDR值<0.05。從谷子基因組數(shù)據(jù)庫(Phytozome V12.1, https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中獲取谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因的染色體位置信息，利用Tbtools[20]工具對(duì)谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因的染色體定位進(jìn)行可視化分析。

1.2 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因基本信息和理化性質(zhì)分析

利用谷子基因組數(shù)據(jù)庫(Phytozome V12.1)查找抗旱相關(guān)蛋白激酶基因的基本信息，并利用ExPASY-ProtParam在線工具(https://web.expasy.org/protparam/)分析谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶的等電點(diǎn)和分子量。

1.3 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶家族系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用Clustal X2軟件對(duì)谷子蛋白激酶基因的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，并通過鄰位相連法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，BootStrap參數(shù)設(shè)置為1 000，其它參數(shù)選擇默認(rèn)。

1.4 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶家族基因結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件Gene Structure Display Server(GSDS, http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶家族基因的外顯子-內(nèi)含子(exon-intron)結(jié)構(gòu)。

1.5 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶保守基序及保守結(jié)構(gòu)域分析

利用MEME在線軟件(http://meme-suite.org/tools/meme)對(duì)谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶進(jìn)行保守基序分析，利用TBtools工具繪制谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因的motif示意圖，分析谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶氨基酸序列的保守性。將谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因的氨基酸序列提交至NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)，并利用TBtools工具繪制谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶保守結(jié)構(gòu)域。

1.6 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因啟動(dòng)子分析

選取谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因起始密碼子上游1 500 bp序列作為啟動(dòng)子區(qū)域，將序列提交到PlantCARE(http://bioinformatics.psb.gent.e/eboolslantcare/html)數(shù)據(jù)庫，分析啟動(dòng)子順式作用元件。

1.7 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因表達(dá)分析

基于干旱條件下勾勾母雞咀和晉汾16的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因進(jìn)行基因表達(dá)分析。從Phytozome數(shù)據(jù)庫(V12.1) 下載谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，分析其組織表達(dá)特異性。利用TBtools工具繪制基因表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因鑒定及染色體定位

對(duì)干旱條件下勾勾母雞(GG)和晉汾16(JF16)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，得到1 300個(gè)表達(dá)差異性顯著的基因,通過功能注釋鑒定出35個(gè)谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因。上述基因的染色體分布情況如圖1所示，根據(jù)基因在染色體上的位置，將谷子35個(gè)蛋白激酶基因分別命為SiPK1～SiPK35。谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因分布在8條不同染色體上，5號(hào)染色體上最多(9個(gè))，7號(hào)染色體上最少(2個(gè))，6號(hào)染色體沒有分布。

2.2 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因基本信息及理化性質(zhì)

35個(gè)谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因基本信息及理化性質(zhì)見表1。谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因長(zhǎng)度在732～12 356 bp之間，其中SiPK10的CDS序列最長(zhǎng)(4 890 bp)，SiPK11的CDS序列最短(261 bp)；SiPK12外顯子數(shù)目最多(20個(gè))，SiPK2、SiPK16、SiPK30外顯子數(shù)目最少(僅有1個(gè))；氨基酸序列的平均長(zhǎng)度為580 aa；蛋白質(zhì)等電點(diǎn)介于4.50(SiPK15)和9.68(SiPK3)之間，其中有13個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)呈酸性，22個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)顯堿性；蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量范圍37 114～178 473 Da，平均值為63 605 Da。

圖1 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因染色體定位Fig.1 Chromosomal location of protein kinase genes related to drought resistance in foxtail millet

表1 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因基本信息及理化性質(zhì)Table 1 Basic information of protein kinase genes related to drought resistance in foxtail millet

續(xù)表1

2.3 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶系統(tǒng)進(jìn)化及基因結(jié)構(gòu)分析

基于谷子蛋白激酶基因的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2左)。谷子35個(gè)蛋白激酶可以劃分為4個(gè)亞族，同一亞族內(nèi)成員親緣關(guān)系較近。亞族間外顯子數(shù)目差異較大，第Ⅰ組外顯子數(shù)目最多，第Ⅳ組外顯子數(shù)目相對(duì)較少，而亞族內(nèi)成員基因結(jié)構(gòu)差異較小(圖2右)。由圖1可知，親緣關(guān)系較近的蛋白激酶的基因結(jié)構(gòu)也較為相近，SiPK6、SiPK34基因親緣關(guān)系較近，外顯子數(shù)目相同；SiPK23、SiPK29基因親緣關(guān)系較近，外顯子數(shù)目也相同。

外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析顯示，多數(shù)基因包含有外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)斷裂基因特征，其中以SiPK12基因尤為明顯，含有20個(gè)外顯子；而SiPK11基因只含有2個(gè)外顯子；SiPK2、SiPK16、SiPK30基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，外顯子數(shù)目最少，僅有1個(gè)外顯子，沒有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

2.4 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶保守基序及保守結(jié)構(gòu)域

對(duì)谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶的氨基酸序列進(jìn)行保守基序分析(圖3)。谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶家族共包含8種保守基序，將其分別命名為motif 1～8，結(jié)果顯示絕大多數(shù)谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶含有這8種保守基序，表明谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶中的保守基序具有較強(qiáng)的保守性。值得一提的是，13個(gè)谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶都含有相同的基序并且排列順序一致，基序的保守性表明這些蛋白激酶很可能具有功能上的相似性。

保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果(圖4)顯示，谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶共包含14個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，所有蛋白激酶都含有PKc結(jié)構(gòu)域。13個(gè)抗旱相關(guān)蛋白激酶基因至少含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中SiPK10具有5個(gè)結(jié)構(gòu)域，即2個(gè)ANK、1個(gè)PKc、1個(gè)RING_Ubox和1個(gè)Ank_2保守結(jié)構(gòu)域，表明該基因可能具有多種功能。SiPK16、SiPK19含有相同的保守域，即都含有1個(gè)PKc和1個(gè)AMPKA_C保守結(jié)構(gòu)域，且其位置較為相似，它們可能具有相似的生物學(xué)功能。

2.5 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因啟動(dòng)子順式作用元件

啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果(表2、表3)顯示，谷子35個(gè)抗旱相關(guān)蛋白激酶基因啟動(dòng)子中與干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件主要有：ABA響應(yīng)元件(ABRE)、MeJA響應(yīng)元件(CGTCA-motif、TGACG-motif)、干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件(MBS)以及 MYB結(jié)合位點(diǎn)元件(MRE、CCAAT-box)等。除SiPK13、SiPK14基因以外，其他33個(gè)谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因啟動(dòng)子區(qū)域都含有ABA響應(yīng)元件，其中SiPK21基因含有ABA響應(yīng)元件的數(shù)目最多，高達(dá)19個(gè)。多數(shù)基因都含有干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件(MBS)，其中SiPK1、SiPK24基因含有干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件(MBS)的數(shù)目最多，同時(shí)SiPK24基因含有MYB結(jié)合位點(diǎn)(MRE)數(shù)量也最多，表明它們可能參與調(diào)控谷子干旱脅迫響應(yīng)。此外，不同基因的調(diào)控元件種類、數(shù)目也不同，SiPK21基因的順式調(diào)控元件最多，高達(dá)44個(gè)，SiPK27基因最少，僅含有5個(gè)；一些基因還具有赤霉素(GA)、水楊酸(SA)、生長(zhǎng)素(auxin)、低溫、脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件。

圖2 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因系統(tǒng)進(jìn)化及外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Phylogenetic and exon-intron structure analyses of protein kinase genes related to drought resistance in foxtail millet

2.6 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因表達(dá)分析

谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因在干旱脅迫條件下的表達(dá)情況如圖5A所示，SiPK4、SiPK20、SiPK27等基因在不同品種和處理間的表達(dá)量都較高；SiPK25、SiPK30等基因在不同品種和處理間都有表達(dá)，但表達(dá)量較低。在同一品種勾勾母雞咀中，SiPK1、SiPK4、SiPK5、SiPK27基因在干旱處理后表達(dá)量明顯上調(diào)，說明該基因可能參與谷子干旱脅迫響應(yīng)。

組織特異性表達(dá)結(jié)果如圖5B所示，SiPK8、SiPK28、SiPK29等基因在各組織中表達(dá)量較高，SiPK11、SiPK17、SiPK26等基因在各組織中表達(dá)量較低。SiPK20和SiPK25基因表現(xiàn)出顯著的組織特異性表達(dá)模式，SiPK20在葉(高光照、兩周一葉期)中表達(dá)量較高，SiPK25在根(尿素處理)中表達(dá)量較高。

圖3 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶氨基酸序列保守基序Fig.3 Conserved motifs in the amino acid sequences of protein kinases related to drought resistance in foxtail millet

圖4 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 Conserved domains of protein kinases related to drought resistance in foxtail millet

表2 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因啟動(dòng)子順式作用元件數(shù)目Table 2 The numbers of promoter cis-acting elements in protein kinase genes related to drought resistance in foxtail millet

3 討論與結(jié)論

谷子是禾本科狗尾草屬二倍體C4植物，有9條染色體[21]。谷子基因組測(cè)序于2012年完成[22]，其基因組較小，約510 Mb。谷子具有耐旱、耐瘠薄的特點(diǎn)，是理想的抗旱模式作物。

本研究鑒定了35個(gè)谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因，它們分布于除6號(hào)染色體外的其余8條染色體上。聚類分析顯示，它們可以分為4個(gè)亞家族，其中第Ⅰ亞家族成員最多?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，多數(shù)基因包含有外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。保守基序分析顯示，谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因家族成員共有8個(gè)保守基序。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶共包含14個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，所有蛋白激酶都含有PKc結(jié)構(gòu)域。上述結(jié)果表明，多數(shù)親緣關(guān)系較近的基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、保守基序、保守結(jié)構(gòu)域較為相似，它們可能具有功能上的相似性，如SiPK6、SiPK34親緣關(guān)系較近，在基因結(jié)構(gòu)、保守基序、保守結(jié)構(gòu)域都表現(xiàn)出較強(qiáng)的相似性，它們可能具有相似的生物學(xué)功能。

表3 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因啟動(dòng)子順式作用元件功能Table 3 Functions of promoter cis-acting elements in protein kinase genes related to drought resistance in foxtail millet

A：谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因在干旱脅迫條件下2個(gè)品種中的表達(dá)分析；B：谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因在不同處理?xiàng)l件下14個(gè)組織中的表達(dá)分析A:Experession analyses of protein kinase genes related to drought resistance in two varieties of foxtail millet under drought stress;B:Expression analyses of protein kinase genes related to drought resistance in 14 tissues of foxtail millet under different treatments圖5 谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因表達(dá)分析Fig.5 Expression analyses of protein kinase genes related to drought resistance in foxtail millet

基因表達(dá)分析顯示，在抗旱品種勾勾母雞咀(GG)中，干旱處理后SiPK1和SiPK4基因表達(dá)量顯著上升，并且SiPK1、SiPK4啟動(dòng)子區(qū)域都含有干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件(MBS)[SiPK1基因含有MBS的數(shù)目最多]，該元件是MYB結(jié)合位點(diǎn)并參與植物干旱誘導(dǎo)，說明SiPK1和SiPK4極有可能參與谷子干旱脅迫響應(yīng)。組織特異性表達(dá)分析顯示，SiPK4和SiPK25在各組織中均有表達(dá)，且在根中表達(dá)量較高，它們可能與根部發(fā)育密切相關(guān)，而根系在植物響應(yīng)干旱脅迫反應(yīng)中具有重要作用[23]，這表明SiPK4可能通過調(diào)控谷子根部發(fā)育參與根部對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。綜上，SiPK4基因很可能與谷子的干旱脅迫應(yīng)答密切相關(guān)，可作為抗旱相關(guān)的候選基因。

谷子是耐旱性極強(qiáng)的作物[24]，研究其抗旱機(jī)理對(duì)小麥、水稻等作物的抗旱改良具有極其重要的意義。本研究結(jié)果表明，谷子蛋白激酶基因SiPK4很可能參與干旱脅迫響應(yīng)，可作為谷子抗旱機(jī)制研究的候選基因。本研究為谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因的進(jìn)一步鑒定與功能研究奠定了理論基礎(chǔ)，為后續(xù)谷子抗旱機(jī)制的解析提供了思路。