PD模型大鼠紋狀體中等多棘神經(jīng)元樹突棘運動依賴可塑性研究

陳 平，劉曉莉，馬婧，喬德才

（1.北京師范大學 體育與運動學院，北京 100875；2.吉首大學 體育科學學院，湖南 吉首 416000；3.國家體育總局體育科學研究所，北京 100061）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是由于黑質致密部（substantia nigra pars compacta，SNc）多巴胺（dopamine，DA）能投射嚴重丟失，導致基底神經(jīng)節(jié)（basal ganglia，BG）運動調節(jié)功能紊亂而引發(fā)的一種緩慢進展性神經(jīng)系統(tǒng)退變疾?。˙astide et al.，2015），該疾病的主要臨床表現(xiàn)為運動功能障礙。目前臨床尚無治愈PD的有效療法，患者隨病情加重會完全喪失自主行為能力，直接影響了老年人的日常生活。近年來，學者開始關注運動對PD的防治效果，發(fā)現(xiàn)身體活動水平與PD發(fā)病間存在一定關聯(lián)（Hou et al.，2017），適當?shù)纳眢w活動可顯著改善PD患者的步態(tài)、平衡、協(xié)調等行為功能（Herman et al.，2007）。本實驗室的前期研究也證實，中等強度運動干預對PD模型大鼠行為功能障礙有明顯改善作用，其神經(jīng)機制與運動促進內源性大麻素（endocannabinoids，eCB）配體合成，減輕紋狀體神經(jīng)元胞外谷氨酸（glutamine，Glu）過度增高引起的興奮性毒作用（林湘明 等，2017），抑制皮層-紋狀體Glu能突觸傳遞效能（陳巍等，2015b），糾正基底神經(jīng)節(jié)直接通路與間接通路的功能失衡有關（趙剛等，2020）。此外還發(fā)現(xiàn)，DA耗竭導致PD模型大鼠紋狀體中等多棘神經(jīng)元（medium spiny neurons，MSNs）樹突棘脫落與運動功能障礙出現(xiàn)具有相關性，中等強度運動干預可使PD模型大鼠紋狀體MSNs樹突棘密度顯著增加，并伴隨著運動功能障礙的顯著改善，推測紋狀體MSNs形態(tài)可塑性可能在運動改善PD模型大鼠運動功能障礙中起重要作用（陳巍等，2015a）。MSNs約占紋狀體神經(jīng)元的95%，由于受體表達的特異性可分為2種亞型：表達多巴胺I型受體（do‐pamine1type receptors，D1R）的D1-MSNs和表達多巴胺型II受體（dopamine 2 type receptors，D2R）的D2-MSNs，它們分別調控基底神經(jīng)節(jié)直接通路與間接通路的功能。PD狀態(tài)下，DA耗竭引起紋狀體D2-MSNs過度激活，被認為是導致基底神經(jīng)節(jié)功能紊亂的主要原因之一；那么，紋狀體MSNs樹突棘運動依賴可塑性是否也可能選擇性地發(fā)生在D2-MSNs，尚缺乏直接的實驗證據(jù)。為此，本研究試圖采用逆行神經(jīng)示蹤的方法，分別用熒光標記D1-MSNs和D2-MSNs，證實PD模型大鼠紋狀體MSNs樹突棘運動依賴可塑性發(fā)生的可能細胞靶點。

1 實驗對象和方法

1.1 實驗對象與分組

健康雄性清潔級SD大鼠，體重240±10 g（8周齡），購自北京華阜康生物科技股份有限公司［生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2009-0007］。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由進食和飲水，12/12 h晝夜循環(huán)，動物房內溫度控制在20℃～25℃，相對濕度為50%±10%。所有動物實驗操作均經(jīng)北京師范大學動物倫理委員會批準，還按照實驗動物使用的3R原則，對實驗動物給予人道主義關懷。大鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為假手術安靜組（Con組，n=12）、模型組（n=32）；模型組經(jīng)鑒定符合PD模型的大鼠隨機分為PD組和PD運動組（PD＋Ex組）；各組再分為2個亞組，即D1-MSNs/D2-MSNs標記的安靜對照組（Con＋D1-MSNs組）/（Con＋D2-MSNs組），D1-MSNs/D2-MSNs標記的6-羥基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）安靜組（PD＋D1-MSNs組）/（PD＋D2-MSNs組），D1-MSNs/D2-MSNs標記的6-OHDA運動組（PD＋Ex＋D1-MSNs組）/（PD＋Ex＋D2-MSNs組）。

1.2 PD模型的制備與評價方法

1.2.1 PD模型大鼠的制備

大鼠禁食24 h，自由飲水。腹腔注射10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）麻醉大鼠。俯臥位將頭固定于可調節(jié)的大鼠腦立體定位儀上，并用控溫加熱墊保持大鼠體溫（37℃），充分暴露前后囟使之保持在同一水平面上。參照Paxionos等（1997）大鼠腦定位圖譜確定右腦內側前腦束（medial forebrain bundle，MFB）坐標（AP：-4.3 mm，R：1.5 mm，H：7.6～7.8 mm）作為6-OHDA注射點，將6-OH‐DA 溶于含 0.02% 抗壞血酸生理鹽水中（2 μg/μL），以1 μL/min 勻速給藥，藥物總量為 8 μg/4 μL，注射完畢留針5～10 min，緩慢退針。Con組大鼠在相同注射點給予等量含0.02%抗壞血酸的生理鹽水。手術完成待清醒后放置籠內單籠飼養(yǎng)。

1.2.2 PD模型大鼠的評價方法

藥物誘導的旋轉行為實驗在6-OHDA注射后第7天實施，分別對各組大鼠頸部皮下注射阿撲嗎啡（apomor‐phine，APO，0.5 mg/kg）誘導旋轉行為實驗，記錄30 min內大鼠旋轉圈數(shù)。本研究篩選凈旋轉圈數(shù)（向損傷側旋轉圈數(shù)與向健側旋轉圈數(shù)）的差值＞100 r/30 min作為PD大鼠模型制備成功的標準（Jia et al.，2009），剔除不符合標準的大鼠。

1.2.3 黑質、紋狀體酪氨酸羥化酶表達水平檢測

所有實驗結束后24 h，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100g）麻醉，依次經(jīng)心臟灌注預冷的生理鹽水（250 mL）和多聚甲醛（4 g/L，300 mL），斷頭取腦組織放入固定液中固定24 h，轉入30%的蔗糖溶液至沉底，修塊，包埋。參照Paxionos等（1997）大鼠腦立體定位圖譜確定紋狀體和黑質位置，連續(xù)冠狀切片，每隔3張選取1張切片在0.01 M的PBS（PH 7.4）中漂洗后，室溫下置于0.3% Triton X-100的PBS中破膜30 min，3% H2O2中孵育10 min，PBS漂洗；腦片轉入5%山羊血清的PBS中室溫孵育1 h，鼠抗TH單抗隆抗體（1∶3 000）（Sigma，USA）孵育過夜；PBS漂洗3次后，室溫下生物素化兔抗孵育1 h，親和素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC-Elitekit，Vector Laborato‐ries，USA）孵育1 h，PBS漂洗3次，DAB溶液中顯色10～20 s。采用Olympus-DP72型顯微鏡拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計分析酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxxylase，TH）平均光密度，判斷DA能神經(jīng)元的損毀情況。

1.3 D1-MSNs/D2-MSNs胞體逆行示蹤

6-OHDA注射完畢后，參照Paxionos等（1997）確定蒼白球內側部（globus pallidum internus，GPi）（BP：2.3 mm，R：2.8 mm，H：8.0 mm）、蒼白球外側部（globus pallidum ex‐ternal segment，GPe）（BP：1.3 mm，R：3.2 mm，H：6.5 mm）坐標，牙科鉆鉆孔，用微量注射泵將Retro-beads（注射計量為 500 nL，速度 50 nL/min）分別注入 GPi和 GPe（圖 1）。注射完畢后均留針10 min，緩慢退針。用生物硅膠填充顱骨孔，醫(yī)用碘伏和明膠海綿消毒止血后，縫合傷口，并用青霉素敷于傷口表面預防感染；待清醒后放置籠內，單籠飼養(yǎng)。

圖1 D1-MSNs/D2-MSNs胞體逆行標記病毒注射位點（Gerfen et al.，2010）Figure 1.Virus Injection Sites of D1-MSNs/D2-MSNs Soma Retrograde Tracing

1.4 行為學測試

采用爬桿實驗（pole test）評價大鼠四肢運動的協(xié)調性（Tajiri et al.，2010）。爬桿（高60 cm，直徑0.7 cm）用醫(yī)用紗布纏好，保證有足夠的摩擦力；將大鼠頭端朝下置于桿頂，記錄大鼠從桿頂爬至桿底平面所需時間。每只大鼠測試3次，每次間隔5 s，取平均值。測試前引導每只大鼠自桿頂爬至桿底面，進行2次適應性訓練。

1.5 運動干預方案

術后1周，采用Tajiri等（2010）建立的運動方案，對PD＋Ex組大鼠進行跑臺運動干預。訓練方案為：11 m/min，30 min/d，5 d/w，共4周（周六、日休息）。運動干預時間為訓練日下午16∶00—18∶00。Con組與PD組大鼠在相同時間段置于跑臺內，但不進行跑臺運動，使其處于自然安靜狀態(tài)。

1.6 D1-MSNs/D2-MSNs的熒光標記

大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）麻醉后處死，迅速取腦，振動切片（300 μm），腦片放入34.5℃的人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中孵育1 h；在膜片鉗顯微鏡的紫外光激發(fā)下可以觀察到被Retro‐beads逆行標記的紋狀體蒼白球內側部或紋狀體蒼白球外側部（Str-GPi或Str-GPe）神經(jīng)元的胞體（圖2）。用加入biocytin的電極內液鉗制Retrobeads標記的神經(jīng)元胞體，約patch 15～30 min，撤出電極，將腦片在含有4%PFA的PBS溶液中固定過夜（4℃），PBS洗10 min×3，0.5%triton破膜30 min，5%BSA 1 h，加入Avidin 555室溫孵育2 h，PBS洗10 min×3；激光共聚焦掃描顯微鏡下拍照。

圖2 D1-MSNs或D2-MSNs胞體逆行示蹤標記Figure 2.D1-MSNs or D2-MSNs Cytosolic Retrograde Tracing

1.7 免疫印跡（Western blot）檢測PSD-95和Syn蛋白

大鼠禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，斷頭取腦，迅速于冰面上剝離雙側紋狀體。加入適量組織裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）超聲裂解，提取總蛋白；用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度后，加入5×SDS上樣緩沖液，于沸水中煮5 min，冰上冷卻，置于-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩Ｈ〉鞍讟颖?0 μg經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，經(jīng)電轉膜儀轉運蛋白至硝化纖維素膜上，室溫下封閉1 h后，使用以下主要抗體對PSD-95和Syn進行檢測：鼠 anti-PSD-95 IgG（1∶10 000，EMD Milli‐pore，Billerica，MA），兔 anti-Syn IgG（1∶5 000，Vector Lab‐oratory，Inc.，Burlingame，CA）。主要抗體用含有 2% 的NGS和0.05%TX進行稀釋。組織在抗體溶液中4℃環(huán)境下孵育過夜后，TBS清洗3次。辣根過氧化物酶標記的兔抗 抗 體（1∶2 000；Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）作為二抗，37℃孵育過夜；洗后再轉移到ECL化學發(fā)光顯色液中，曝光后顯影、定影，最后掃描并圖像分析；計算目的條帶PSD-95和Syn蛋白的吸光度值。為減少個體差異，以該大鼠損傷側吸光度值/未損傷側吸光度值的比值表示PSD-95和Syn蛋白表達的相對水平。

1.8 樹突棘密度分析

用于分析的MSNs入選標準為：胞體為圓形或卵圓形，有3～8個1級樹突。在Olympus激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察MSNs樹突棘的密度，由于各級樹突上樹突棘的分布不均勻，因此，從神經(jīng)元胞體發(fā)出樹突的第1次分支開始，計算30～60 μm長度范圍內樹突棘的個數(shù)，再計算其樹突棘的密度（每10 μm長度范圍內樹突棘個數(shù)）。

1.9 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析，結果以均值±標準差（M±SD）表示，采用GraphPad Prism 6軟件作圖。組間均值的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），選擇LSD檢驗對組間均值進行差異性比較；采用重復測量雙因素方差分析（Repeated measure two-way ANOVA）比較組內各指標隨時間變化；采用卡方檢驗比較組間百分比指標的差異性；以P＜0.05視為有統(tǒng)計學意義。

2 研究結果

2.1 PD大鼠模型可靠性評價

6-OHDA注射后第7天對大鼠進行APO誘導的旋轉行為檢測，結果表明，6-OHDA損毀大鼠共32只，旋轉次數(shù)＞100 r/30 min（167.68±16.23 r/30 min）的共計24只，成模率75%，未達到模型評價標準的大鼠剔除（圖3）。

圖3 APO誘導旋轉試驗測試結果及PD大鼠成模率Figure 3.Results of Apo-Induced Rotation Test and PD Molding Rate

最后1周行為學測試結束后，對紋狀體和黑質進行取材并做免疫組織化學染色。結果顯示，Con組雙側黑質TH免疫陽性細胞表達均勻且對稱分布，雙側紋狀體TH免疫陽性纖維終末含量均勻、密集、對稱；PD組損毀側黑質（右側）TH免疫陽性細胞數(shù)量及損毀側紋狀體（右側）TH免疫陽性纖維終末含量均出現(xiàn)嚴重丟失，雙側黑質、紋狀體TH免疫陽性細胞表達、免疫陽性纖維終末含量均呈現(xiàn)明顯的不對稱性。與Con相比，PD組大鼠黑質TH免疫陽性細胞數(shù)量、紋狀體TH免疫陽性纖維終末含量均顯著降低（P＜0.01）；與PD組相比，PD＋Ex組大鼠黑質TH免疫陽性細胞數(shù)量、紋狀體TH免疫陽性纖維終末含量均無顯著改變（P＞0.05）（圖4）。

圖4 黑質與紋狀體TH免疫組織化學檢測結果Figure 4.Results of TH Immunostaining in SNc and Striatum

2.2 各組大鼠四肢協(xié)調能力的比較

爬桿實驗結果顯示，Con組大鼠爬桿過程中四肢并用，動作協(xié)調，能夠一次性順利從桿頂爬下；PD組大鼠爬桿過程中表現(xiàn)為笨拙、恐懼、抓桿不能，甚至有掉落現(xiàn)象，從桿頂爬至桿底的延遲時間較Con組顯著延長（P＜0.01）；PD＋Ex組大鼠爬桿過程中表現(xiàn)為螺旋向下爬行，四肢抱緊桿，有間歇停頓現(xiàn)象，自桿頂爬至桿底的延遲時間較PD組顯著縮短（P＜0.05）（圖5B）。

對各組大鼠各周四肢協(xié)調能力進行比較，結果表明，與第0周相比，Con組大鼠各周爬桿延遲時間無顯著變化（P＞0.05）；PD組大鼠各周爬桿延遲時間隨著6-OHDA毒素損傷時間的延長而顯著增加（P＜0.01）；PD＋Ex組大鼠各周爬桿延遲時間也表現(xiàn)出增加的趨勢，自第2周開始均低于PD組，第4周時呈現(xiàn)顯著降低（P＜0.05），第5周時降低更加顯著（P＜0.01），存在明顯的時序性變化（圖5C）。

圖5 各組大鼠四肢協(xié)調能力的比較Figure 5.The Comparision of Movement Coordination in Each Group

2.3 各組大鼠紋狀體MSNs樹突棘密度的比較

激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察紋狀體MSNs樹突棘密度發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，PD組和PD＋Ex組大鼠D1-MSNs樹突棘密度無顯著改變（P＞0.05）；與Con組相比，PD組D2-MSNs大鼠樹突棘密度顯著降低（P＜0.01）。與PD組相比，PD＋Ex組D2-MSNs樹突棘密度顯著增加（P＜0.05）（圖6）。

圖6 各組大鼠紋狀體MSNs樹突棘密度的比較Figure 6.Effect of Exercise Intervention on the Density of Msns Dendritic Spines of Triatum

2.4 各組大鼠D1-MSNs/D2-MSNs形態(tài)學參數(shù)分析

Sholl分析結果顯示，PD組與Con組相比、PD＋Ex組與PD組相比，大鼠D1-MSNs和D2-MSNs一級樹突分支數(shù)量、胞體面積、樹突總分支數(shù)量和樹突分支總長度均無顯著改變（P＞0.05，P＞0.05）（圖7、圖8）。

圖7 紋狀體MSNs Sholl分析模式圖Figure 7.Pattern MSNs Sholl Analysis of Striatum

圖8 各組大鼠紋狀體MSNs樹突分支、樹突分支總長度及胞體面積比較Figure 8.Analysis of The Branch of Dendrite，Total Length and Cell Area of the MSNs in Striatum of Rats

2.5 各組大鼠紋狀體PSD-95、Syn蛋白表達水平比較

免疫印跡結果顯示，與Con組相比，PD組大鼠紋狀體PSD-95表達水平顯著下調（P＜0.01）；與PD組相比，PD＋Ex組大鼠紋狀體PSD-95表達水平顯著上調（P＜0.05）。與Con組相比，PD組大鼠紋狀體Syn表達水平顯著下調（P＜0.01）；與PD組相比，PD＋Ex組大鼠紋狀體Syn表達水平顯著上調（P＜0.05）（圖9）。

圖9 各組大鼠紋狀體PSD-95、Syn蛋白表達水平比較Figure 9.Expression of PSD-95 and Syn Protein in the Striatum of Rats

3 討論

樹突棘是構成記憶存儲和突觸傳遞的解剖學基礎，具有很強的可塑性。在生命的整個周期中，哺乳動物大腦中神經(jīng)元樹突棘的數(shù)量和密度會隨著發(fā)育的進展出現(xiàn)動態(tài)變化。多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病或豐富環(huán)境均可能引起樹突棘形態(tài)結構的改變，并影響突觸的可塑性。

3.1 PD狀態(tài)下紋狀體MSNs樹突棘丟失

McNeill等（1988）、Stephens等（2005）和 Zaja-Milatovic等（2005）對PD患者的腦組織進行尸檢結果發(fā)現(xiàn)，紋狀體MSNs樹突和樹突棘存在萎縮或丟失現(xiàn)象。Nishijima等（2013）采用免疫電鏡技術觀察發(fā)現(xiàn)，6-OHDA偏側損毀模型大鼠去DA神經(jīng)支配后紋狀體樹突棘的數(shù)量、密度顯著降低。Zhang等（2013）發(fā)現(xiàn)，6-OHDA偏側損毀模型大鼠紋狀體MSNs胞體遠端和近端樹突上的樹突棘大約丟失40%。Soderstrom等（2010）采用Golgi染色的方法也得到了類似的結果。Suarez等（2014）和Antzoulatos等（2011）采用Golgi染色和免疫電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PD模型小鼠紋狀體MNSs樹突長度、分枝數(shù)量及樹突棘數(shù)量、密度均顯著降低；Villalba等（2011）和Smith等（2009）利用Golgi染色技術結合3D電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，非人靈長類PD模型紋狀體MSNs樹突棘丟失30%～50%。此外，有研究采用免疫組織化學結合超微結構分析發(fā)現(xiàn)，皮層與紋狀體MSNs樹突棘相突觸的軸-棘突觸體積增大，Glu能突觸后致密區(qū)（PSD）厚度和穿通型突觸數(shù)量增加，突觸前Glu能軸突終端增大，這些形態(tài)變化是Glu能突觸傳遞增強的解剖學基礎，也代償MNSs樹突棘的丟失（Villalba，2009；Villalba et al.，2011）。然而，Day等（2006）利用細菌人工染色體（BACs）作為克隆載體，建立增強型綠色熒光蛋白（eGFP）標記多巴胺Ⅰ型受體（D1DR）和多巴胺Ⅱ型受體（D2DR）的轉基因小鼠模型，給予利魯平處理后發(fā)現(xiàn)，DA耗竭可使紋狀體D2-MSNs樹突棘數(shù)量明顯減少，而D1-MSNs樹突棘數(shù)量無顯著改變。本研究采用逆行神經(jīng)示蹤技術分別標記D1-MSNs和D2-MSNs，利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察到，PD模型大鼠紋狀體MSNs樹突棘脫落的部位主要發(fā)生在D2-MSNs，而D1-MSNs樹突棘密度未出現(xiàn)顯著減少這與Day等（2006）利用轉基因PD模型小鼠獲得的研究結果相同；通過Sholl分析發(fā)現(xiàn)，PD模型大鼠紋狀體D1-MSNs和D2-MSNs一級樹突分支數(shù)量、總樹突分支數(shù)量、樹突長度以及胞體面積均未顯著改變。Kim等（2013）采用Golgi染色及電鏡觀察樹突分支，發(fā)現(xiàn)PD模型小鼠紋狀體MSNs樹突分支長度和總樹突分支數(shù)量呈顯著降低。推測導致上述結果不一致的原因與研究方法不同有關，逆行神經(jīng)示蹤熒光標記方法能較好地保持神經(jīng)元活性，其結果較Golgi染色獲得的結果更真實可信。目前仍未完全闡明PD動物紋狀體MSNs樹突棘丟失的確切機制，有研究認為，可能與Glu興奮性毒性、氧化應激、神經(jīng)炎癥等諸多因素有關（Villalba et al.，2010）。DA替代療法不能阻止PD狀態(tài)下紋狀體MSNs樹突棘丟失，說明DA耗竭并不是導致紋狀體MSNs樹突棘形態(tài)改變的主要因素。Garcia等（2010）研究表明，用6-OHDA同時損毀黑質與皮層可顯著降低由DA去神經(jīng)支配導致的紋狀體MSNs樹突棘丟失。Neely等（2007）發(fā)現(xiàn)，給予mGluR2/3激動劑抑制皮層-紋狀體突觸前Glu釋放可阻止PD狀態(tài)下MSNs樹突棘脫落。Day等（2006）利用免疫電鏡觀察證實，抑制紋狀體D2-MSNs上L-型鈣通道蛋白Cav1.3α活性或基因敲除Cav1.3α亞單位后D2-MSNs樹突棘脫落現(xiàn)象消失。上述結果表明，PD狀態(tài)下紋狀體MSNs樹突棘數(shù)量和密度的選擇性丟失可能主要與皮層-紋狀體突觸前Glu過度釋放導致的興奮性毒作用有關。

3.2 運動選擇性降低PD模型大鼠紋狀體MSNs樹突棘丟失

樹突棘形態(tài)與結構具有運動環(huán)境依賴可塑性。Petz‐inger等（2007）發(fā)現(xiàn)，運動干預可增加PD模型小鼠紋狀體MSNs樹突分枝長度、數(shù)量以及樹突棘密度。Toy等（2014）采用轉基因PD小鼠研究發(fā)現(xiàn)，6周遞增跑臺訓練后紋狀體D1-MSNs和D2-MSNs樹突棘和樹突分支數(shù)量均顯著增加，PSD-95和Syn表達水平顯著上調。本實驗室前期研究表明，4周跑臺運動干預可使PD模型大鼠紋狀體MSNs樹突棘密度顯著增加，穿通型突觸數(shù)量顯著增多（陳巍等，2015a）。本研究利用神經(jīng)元逆行示蹤標記方法進一步研究證實，PD模型大鼠紋狀體樹突棘形態(tài)結構的運動依賴可塑性主要發(fā)生在D2-MSNs，支持了“PD模型大鼠紋狀體樹突棘形態(tài)運動依賴可塑性具有選擇性，作用的細胞靶點可能在D2-MSNs”的研究假設；也為本研究團隊基于在體或離體電生理學技術證實“跑臺運動干預降低皮層-紋狀體Glu通路的過度傳導并抑制D2-MSNs興奮性”的研究結論（趙剛 等，2019；Chen et al.，2017）提供了 新的形態(tài)學依據(jù)。

PSD-95是定位于突觸后致密區(qū)的一種結構錨定蛋白，參與突觸強度和突觸可塑性調節(jié)（Black et al.，1990）。Syn是定位于突觸前終端囊泡膜上的一種特異性膜蛋白（Takamatsu et al.，2010），是反映突觸類型、突觸數(shù)量的重要蛋白分子標記物（Hu et al.，2009）。Pagnussat等（2012）研究表明，體力活動和運動技能學習均可促進海馬腦區(qū)的突觸形成；Hu等（2009）研究表明，運動促進大鼠海馬神經(jīng)元突觸結構重塑與PSD-95蛋白表達上調有關。Ribeiro等（2013）研究表明，適度運動增加黑質和紋狀體腦區(qū)Syn表達和突觸后PSD厚度，促進突觸傳遞及突觸可塑性。本研究發(fā)現(xiàn)，運動通過上調紋狀體突觸連接蛋白PSD-95和Syn蛋白表達，增加D2-MSNs樹突棘數(shù)量和密度，這為紋狀體MSNs運動依賴可塑性發(fā)生，進而改善PD模型大鼠四肢協(xié)調性奠定了良好的解剖學基礎。

3.3 運動選擇性降低PD模型大鼠紋狀體D2-MSNs樹突棘丟失的可能機制

運動選擇性降低PD模型大鼠紋狀體D2-MSNs樹突棘丟失的可能機制與運動降低皮層-紋狀體Glu突觸傳遞效能有關。本研究團隊通過離體腦片膜片鉗場電記錄技術研究證實，運動或D2R激動劑干預均可抑制D2-Cre小鼠PD模型皮層-紋狀體Glu突觸傳遞異常增高現(xiàn)象，推測D2R在運動降低皮層-紋狀體Glu突觸傳遞中起重要作用（趙剛等，2019）。D2R為G蛋白偶聯(lián)受體，激活D2R引起Gi/o蛋白偶聯(lián)反應，降低腺苷酸環(huán)化酶活性，使細胞膜電位超極化，抑制D2-MSNs興奮性。此外，運動選擇性降低PD模型大鼠紋狀體D2-MSNs樹突棘丟失的可能機制與運動降低皮層-紋狀體Glu通路的興奮性毒作用有關。Glu為興奮性神經(jīng)遞質，PD狀態(tài)下皮層-紋狀體突觸前Glu大量釋放，激活突觸后膜D2-MSNs上受體門控和電壓門控鈣通道，引起Ca2＋內流，啟動胞內信號級聯(lián)反應，導致細胞骨架蛋白及D2-MSNs樹突棘的形態(tài)與數(shù)量改變（陳平等，2017）。4周跑臺運動干預通過上調紋狀體mGluR2/3表達，下調紋狀體MSNs膜上L-型電壓門控鈣通道Cav1.3亞基表達，降低了PD模型大鼠皮層-紋狀體Glu過度釋放介導的興奮性毒作用（Chen et al.，2017）。內源性大麻素系統(tǒng)（endocannabinoid system，eCBs）介導的長時程抑制（eCB-LTD）是皮層-紋狀體突觸可塑性的主要表現(xiàn)形式之一（Kluger et al.，2015），eCB-LTD僅特異性存在于D2-MSNs且受D2R調控（Lerner et al.，2012）。PD病理狀態(tài)下紋狀體D2-MSNs膜上D2R功能受損，引起下游G蛋白信號轉導調節(jié)子 4（regulator of G-protein signaling 4，RGS4）功能異常，從而抑制eCB配體合成，最終使eCB-LTD現(xiàn)象減弱或消失（Trusel et al.，2015）。4周跑臺運動通過上調紋狀體RGS4活性促進eCB配體（AEA/2-AG）合成，恢復皮層-紋狀體eCB-LTD突觸可塑性，調節(jié)突觸前Glu釋放水平，降低Glu的興奮性毒作用，這也是運動選擇性降低紋狀體D2-MSNs樹突棘丟失的又一因素（林湘明等，2017）。

4 結論

PD模型大鼠紋狀體D2-MSNs樹突棘丟失，跑臺運動干預可選擇性降低PD模型大鼠紋狀體D2-MSNs樹突棘丟失。運動通過上調突觸連接蛋白表達促進PD模型大鼠紋狀體MSNs形態(tài)結構重塑。紋狀體MSNs樹突棘發(fā)生運動依賴可塑性變化為PD模型大鼠運動功能障礙的改善提供了必要的解剖學基礎。