m icroRNAs在肝纖維化形成中的作用

王 軍，李光明

上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科，上海200092

肝纖維化是由多種病因所致肝內(nèi)彌漫性細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度沉積的病理生理過程［1］。肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，各種損肝因素引發(fā)肝細胞凋亡壞死、炎性細胞浸潤，促使炎性細胞因子、氧化應激產(chǎn)物釋放，可通過不同機制激活HSC。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類由20～24個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶mRNA完全或不完全配對形成沉默復合體，miRNAs可誘發(fā)靶mRNA降解或抑制靶mRNA翻譯，從而在轉錄后水平對基因轉錄進行負調控［2］。已證實人類超過三分之一的基因受miRNAs調控［3］。自1993年miRNA家族成員lin-4和let-7首次被發(fā)現(xiàn)以來，迄今已在193個物種發(fā)現(xiàn)了 25141種 miRNAs(ftp://mirbase．org/pub/mirbase/CURRENT/README)［4］。日益增加的證據(jù)顯示:miRNAs不僅可調控肝臟對損傷因素的修復反應，而且可作為評估肝損傷程度的一類新型分子標志物。深入研究miRNAs在肝纖維化形成中的作用及機制將有助于為肝纖維化防治提供新的干預靶點。

1 m iRNAs對肝損傷反應的調控作用

新近研究顯示慢性肝損傷期間可出現(xiàn)miRNAs表達異常，這些異常表達的miRNA可調控肝臟對損傷刺激的反應。Lee等［5］探討了miR-199-3p在慢性肝損傷中的作用。研究發(fā)現(xiàn)重度肝纖維化患者肝組織miR-199-3p表達水平明顯上調;miR-199-3p可通過下調靶蛋白肝臟激酶B1(liver kinase B1，LKB1)誘發(fā)肝細胞線粒體功能障礙及氧化應激，加重肝損傷反應。因此，下調miR-199-3p可能減輕肝損傷反應的一個治療靶點。Hou等［6］將let-7b/c表達載體轉染Huh-7(人類肝癌細胞株)，發(fā)現(xiàn)let-7可保護Huh-7細胞抵御氧化乙酸誘導的肝損傷，機制與let-7上調亞鐵血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HMOX1)表達有關。Sarma等［7］探討了miR-449a在慢性丙肝發(fā)病機制中的作用，研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染者肝組織miR-449a表達明顯下調;miR-449a可通過上調靶蛋白NOTCH1抑制腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)表達，進而減輕HCV感染誘發(fā)的肝損傷反應。因此，慢性肝損傷期間出現(xiàn)的miRNAs差異表達既是一種客觀現(xiàn)象，更是一種調節(jié)肝損傷修復反應的機制。

2 m iRNAs對肝損傷修復反應的調控作用

肝纖維化是肝臟對各種慢性肝損傷的一種修復反應，HSC是肝纖維化形成中的一種關鍵效應細胞。日益增加的證據(jù)顯示:差異性表達的miRNAs可通過影響促纖維化信號通路及HSC活化遷移、增殖和凋亡，調控肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程。

2．1 m iRNAs對HSC激活的調控作用 Chen等［8］應用基因本體論及基因本體圖譜網(wǎng)絡分析技術證實miRNAs可以促使定居于肝臟Disse間隙的HSC遷移至炎癥部位并活化為能分泌ECM的肌成纖維細胞;并發(fā)現(xiàn)HSC活化及遷移與HSC內(nèi)miR-335下調顯著相關。進一步研究揭示miR-335調控HSC活化及遷移的機制與其下調靶基因細胞黏合素(tenascin，TN)C表達有關。Noetel等［9］報道在大鼠原代HSC自發(fā)激活過程中，miR-9、miR-125b及miR-128表達明顯上調;應用miRNAs芯片技術，作者證實miR-9、miR-125b及miR-128可通過與趨化因子及受體家族mRNA結合，參與調控HSC自發(fā)活化過程。Li等［10］探討了miR-122在肝纖維化中的作用，研究發(fā)現(xiàn)活化HSCs及實驗性肝纖維化小鼠肝組織miR-122表達明顯減少;并證實miR-122可通過下調4-脯氨基脫氫酶亞單位α1抑制HSC激活。

2．2 m iRNAs對HSC增殖的調控作用 Wang等［11］研究了miR-181a/b對HSC T6增殖的影響。研究發(fā)現(xiàn)miR-181a/b(尤其是miR-181b)在經(jīng)轉化生長因子(transfer growth factor，TGF)β1處理的HSC T6中表達明顯上調;并證實miR-181b可通過調控細胞周期調節(jié)因子 p27促進HSC增殖。Iizuka等［12］探討了 miR-214-5p在肝纖維化中的作用，研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎肝硬化患者及肝纖維化大鼠肝組織中miR-214-5p表達明顯上調;并證實miR-214-5p過表達可激活TGF-β信號通路，其機制與上調轉錄因子Twist-1表達有關。He等［13］發(fā)現(xiàn)miR-146在TGF-β1誘導的HSC活化中表達下調;將miR-146轉染至活化HSC顯示:活化HSC α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達下調，HSC增殖減少、凋亡增加。生物信息學分析顯示:miR-146調控HSC活化、增殖及凋亡的機制可能與調節(jié)Smad4有關。Venugopal等［14］研究了miR-150和miR-194對HSC增殖的影響。研究發(fā)現(xiàn)與來自假手術組大鼠相比，來自肝纖維化大鼠HSC的miR-150及miR-194表達明顯減低;應用生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，miR-150和miR-194可分別通過下調C-myb和rac1表達抑制HSC增殖。Zheng等［15］發(fā)現(xiàn)活化HSC miR-150表達明顯減低;通過與Sp1和IV型膠原α4亞單位(Col4A4)結合，miR-150可抑制LX-2細胞I型膠原和IV膠原基因表達。

2．3 m iRNAs對HSC凋亡的調控作用 Guo等［16］對比研究了大鼠原代HSC與活化HSC miRNAs表達譜變化，發(fā)現(xiàn)在HSC活化過程中有12種miRNAs表達上調，9種miRNAs表達下調。應用Hoechst-33258、流式細胞技術，研究證實miR-15b和miR-16可通過抑制Bcl-2表達，激活caspases-3、8、9誘導HSCs凋亡。Wei等［17］探討了miR-21對HSC的調控機制。PTEN(hosphatase and tensin homologue，人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因)是miR-21的靶基因，是一種AKT激酶抑制劑，具有抑制HSC活化并誘導HSC凋亡的作用;研究發(fā)現(xiàn)促纖維化細胞因子血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)BB可誘導HSC miR-21表達上調;miR-21可通過抑制靶基因-PTEN表達，激活 AKT激酶，由此促進 HSC激活。

2．4 m iRNAs對肝纖維化形成的調控作用 Lakner等［18］研究miR-19b對HSC表型轉化的調控作用。研究發(fā)現(xiàn)來自大鼠及人的活化HSC miR-19b表達明顯下調;轉染miR-19b至活化HSCs可使HSC由活化狀態(tài)逆轉為靜息狀態(tài);miR-19調控HSC表型轉化的機制與其下調TGF-βⅡ受體及Smad3表達，抑制TGF-β信號通路有關。Li等［19］探討了miR-29及家族成員在肝纖維化中的作用。他們以人工合成的核受體FXR特異性激動劑(GW4064)處理活化HSCs，結果顯示miR-29a表達顯著上調，而包括I/Ⅲ型膠原基因、彈性蛋白及原纖蛋白在內(nèi)的ECM基因的mRNA表達明顯下調，提示miR-29a可抑制ECM基因mRNA的翻譯過程。miR-29b也可通過多種方式參與肝纖維化調控［20］。Kwiecinski等［21］發(fā)現(xiàn):經(jīng)肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)處理的大鼠活化HSCs miR-29a/b表達明顯上調，I型和IV型膠原表達下調; miR-29a/b可調控HSC由活化表型轉變?yōu)殪o息表型。上述研究結果表明miR-29及家族成員對肝纖維化形成具有重要的調控作用。

Murakami等［22］研究了miR-199a/a*和miR-200a/ b在肝纖維化中的作用。研究發(fā)現(xiàn)這兩種miRNA在CCl4誘導實驗性肝纖維化小鼠及慢性丙型肝炎患者肝組織中表達明顯上調，且上調水平與肝纖維化進展明顯相關。應用基因芯片技術，證實靜止LX-2細胞和正常肝組織miR-199a/a*和miR-200a/b呈低表達;轉染miR-199a/a*和miR-200a/b至LX-2細胞，細胞內(nèi)促纖維化相關基因表達顯著上調。應用TGF-β處理LX-2細胞，發(fā)現(xiàn)miR-199a/a*和miR-200a/b表達明顯上調;研究結果表明miR-199a/a*和miR-200a/b參與了肝纖維化發(fā)生與發(fā)展過程。

3 血清m iRNAs水平變化與肝功能儲備的關系

臨床研究顯示:慢性肝病及肝硬化患者血清中存在miRNAs異常，這些異常的miRNA可能與肝功能儲備相關，因此，miRNAs可能是評估肝功能儲備的一類新型分子標志物。Gui等［23］研究了血清miR-885-5p水平變化對肝功能儲備的評估作用，并與臨床常用的肝功能生化指標ALT、AST、GGT進行比對分析。研究對象包括24例健康對照、17例非肝臟疾病對照患者(胃癌患者)、26例肝硬化患者、46例肝細胞癌患者以及23例慢性乙型肝炎患者;應用線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)miR-885-5p水平與肝功能儲備呈明顯正相關，miR-885-5p既不受血清ALT、AST及GGT影響，也與ALT、AST及GGT無相關性;提示血清miR-885-5p水平變化可作為評估肝功能儲備的獨立指標，是常用肝功能評價指標的有益補充。Waidmann等［24］研究了血清miR-122水平變化對肝硬化并發(fā)癥及死亡發(fā)生的預測效果。研究對象包括17例肝硬化代償期患者和90例失代償期患者，結果顯示血清miR-122在肝硬化失代償期患者明顯低于代償期患者;有腹水、自發(fā)性細菌性腹膜炎或肝腎綜合征等并發(fā)癥的患者明顯低于沒有并發(fā)癥的患者。應用Cox多元回歸分析顯示血清miR-122變化與Child-Pugh及MELD評分系統(tǒng)具有明顯的相關性。MELD常用于評估肝硬化患者3個月內(nèi)死亡的風險，也可用于預測急性出血、肝腎綜合征等并發(fā)癥的發(fā)生，以便評估哪些患者應該優(yōu)先分配肝源進行肝移植; Waidmann等［24］認為miR-122可作為MELD的有益補充，用于評估肝硬化并發(fā)癥發(fā)生風險及3個月以上的生存率。Roderburq等［25］探討了肝硬化患者血清miRNAs變化規(guī)律。研究對象為65例肝硬化患者，結果發(fā)現(xiàn)肝硬化患者血清miR-513-3p和miR-571水平明顯增加，而miR-652水平下降。以TGF-β處理分離的原代肝細胞和原代HSCs，發(fā)現(xiàn)這兩種細胞miR-571表達均明顯上調;提示肝硬化時血清中miR-571主要來源于肝細胞和HSCs，而miR-652水平下降可能與循環(huán)中單核細胞減少有關。血清 miR-513-3p、miR-571和miR-652改變在肝硬化發(fā)生發(fā)展中的作用仍有待進一步研究。

4 展望

miRNAs作為重要的轉錄后調控因子，已受到許多研究者的關注。慢性肝損傷期間出現(xiàn)的miRNAs表達異常既是一種客觀現(xiàn)象，更是一種調控肝損傷修復反應的機制。深入研究肝纖維化形成過程中差異性表達的miRNAs并探究其功能，不僅將為肝纖維化防治提供新的干預靶點，而且可獲得動態(tài)評估肝功能儲備的新型分子標志物。相信在不久的將來，監(jiān)測血清miRNAs變化可能成為評估肝纖維化程度及肝功能儲備的一種新方法，干預miRNA表達可能成為肝纖維化防治的一種新策略。

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