僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的優(yōu)化提取及其指紋圖譜研究

王立勇 黃佳瀅 朱銳靈 徐悅 湯建 聞崇煒

摘要：為優(yōu)化僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的提取工藝，并建立相應(yīng)的SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）、HPLC（高效液相色譜）、FTIR（傅里葉變換紅外光譜）指紋圖譜。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法，以提取率為響應(yīng)值建立數(shù)學(xué)模型，獲得最佳工藝，用SDS-PAGE、HPLC、FTIR建立僵蠶醇溶蛋白質(zhì)指紋圖譜。通過單因素試驗考察乙醇濃度、料液比、溫度、提取時間對僵蠶醇溶蛋白質(zhì)提取率的影響，進而用Box-Behnken法設(shè)計4因素3水平試驗，進行響應(yīng)面回歸分析。結(jié)果表明，僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的最佳提取工藝條件為料液比1g∶24.22mL，乙醇濃度38.73%，溫度35℃，提取時間3.94h，此時的提取率為0.5402%。用SDS-PAGE、HPLC、FTIR法建立僵蠶醇溶蛋白質(zhì)指紋圖譜，SDS-PAGE分析結(jié)果表明，僵蠶醇溶蛋白質(zhì)分子量集中在16.7～36.2ku;HPLC分析結(jié)果表明，主要僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的保留時間為2.048min與3.354min，其含量分別占總蛋白量的31.23%與32.93%;FTIR分析結(jié)果表明，僵蠶醇溶蛋白質(zhì)在2927.71、1631.71、1457.24、1310.71cm-1處有主要吸收峰。研究并建立了僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的優(yōu)化提取條件，并獲得了蛋白質(zhì)的SDS-PAGE、HPLC、FTIR指紋圖譜。

關(guān)鍵詞：僵蠶;醇溶蛋白質(zhì);響應(yīng)面法;FTIR指紋圖譜;SDS-PAGE;HPLC

中圖分類號：R284.2文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）22-0196-06

作者簡介：王立勇（1994—），男，福建福州人，碩士研究生，研究方向為分子生藥學(xué)。E-mail：1395996384@qq.com。

通信作者：聞崇煒，博士，副教授，研究方向為分子生藥學(xué)。E-mail：wenchw@ujs.edu.cn。

早在秦漢年間，《神農(nóng)本草經(jīng)》就收載僵蠶為祛風(fēng)定驚、化痰散結(jié)的中品藥材[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，僵蠶具有抗癌、降血糖、抗菌、鎮(zhèn)靜催眠、抗凝血、神經(jīng)營養(yǎng)及保護等多種作用[2-7]。目前研究認(rèn)為，僵蠶富含的草酸銨是其抗驚厥、抗凝血的主要藥理成分，槲皮素是其祛痰、止咳的藥理成分。程鎖明等利用反復(fù)硅膠柱色譜、十八烷基硅烷鍵合硅膠填料柱、液相色譜等方法進一步從僵蠶中分離得到（3α，6β）-3-芐基-6-異丙基-4-甲基-2，5-嗎啡啉二酮等12個化合物[8]。殷志琦等應(yīng)用硅膠柱層析和重結(jié)晶方法首次從僵蠶中分離得到6個化合物[9]。郭曉恒等從僵蠶的三氯甲烷部位分離鑒定出6，9-氧橋-麥角甾-7，22-雙烯-3-醇、β-谷甾醇等多種化學(xué)成分[10]。但是，目前對僵蠶中含量最豐富的蛋白質(zhì)還缺乏深入研究。

蛋白質(zhì)具有重要的生物學(xué)功能，是生命活動的執(zhí)行者。在稀鹽、緩沖系統(tǒng)的水溶液作用下，蛋白質(zhì)的溶解度大、穩(wěn)定性好，因此它們是蛋白質(zhì)提取的常用溶劑。乙醇溶液可用于提取植物中的醇溶性蛋白質(zhì)[11-13]，但能否用于提取僵蠶中的醇溶性蛋白質(zhì)至今尚未見報道。響應(yīng)面法可基于數(shù)學(xué)建模確定試驗因素間的相互作用并進行工藝優(yōu)化[14]，目前已在蛋白質(zhì)提取工藝的優(yōu)化中得到廣泛應(yīng)用[15-18]。本研究旨在利用響應(yīng)面法優(yōu)化僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的提取工藝，并對其進行SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）、HPLC（高效液相色譜）、FTIR（傅里葉變換紅外光譜）指紋圖譜分析，旨在為其后續(xù)功能研究及開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

主要試驗材料為僵蠶，購自亳州中藥材市場，經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院歐陽臻教授鑒定為蠶蛾科昆蟲家蠶4～5齡的幼蟲感染白僵菌后的致死干燥體。

主要試劑有蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品，購自賽默飛世爾科技有限公司;考馬斯亮藍R-250，購自北京中生瑞泰科技有限公司;溴酚藍，購自Amresco公司;無水乙醇、牛血清白蛋白、甲醇、乙腈、溴化鉀等試劑，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

主要設(shè)備有電子分析天平，購自Sartorius公司;酶標(biāo)儀，購自美國MolecularDevices公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋，購自江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;微量臺式離心機，購自美國ThermoScientific公司;冷凍干燥機，購自德國Marinchrist公司;Avatar-370型傅立葉變換紅外光譜儀，購自美國尼高力儀器公司;安捷倫LC1200液相色譜儀，購自美國普惠公司。

1.3試驗方法

1.3.1蛋白質(zhì)的提取將僵蠶粉碎并過70目篩備用。取適量僵蠶粉末，按預(yù)設(shè)的料液比加入預(yù)設(shè)濃度的乙醇溶液，在恒溫水浴箱中用預(yù)設(shè)溫度水浴振蕩提取醇溶蛋白質(zhì)。水浴結(jié)束后，將樣品于12000r/min離心10min，收集上清液備用。

1.3.2蛋白質(zhì)提取率的測定以考馬斯亮藍法進行蛋白質(zhì)定量，牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，測定595nm處樣品吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]。隨后分別取200μL“1.3.1”節(jié)所得樣品加入管A、管B中，A管加適量三氯乙酸，離心去除沉淀蛋白質(zhì);B管不作任何處理，根據(jù)A管及B管吸光度計算蛋白質(zhì)吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的蛋白質(zhì)含量，之后按下述公式計算蛋白質(zhì)提取率：

蛋白質(zhì)提取率=（mB-mA）/m×100%。

式中：mA為A管的蛋白質(zhì)含量;mB為B管的蛋白質(zhì)含量;m為提取用僵蠶粉末量。

1.3.3單因素試驗（1）乙醇濃度對蛋白質(zhì)提取率影響的試驗。乙醇濃度分別設(shè)為20%、30%、40%、50%、60%、70%，溫度為40℃，料液比為1g∶25mL，提取時間為4h。（2）料液比對蛋白質(zhì)提取率影響的試驗。料液比分別取1g∶10mL、1g∶15mL、1g∶20mL、1g∶25mL、1g∶30mL，提取溫度為40℃，乙醇濃度為40%，提取時間為4h。（3）提取溫度對蛋白質(zhì)提取率影響的試驗。提取溫度分別取30、35、40、45、50、55℃，乙醇溶液濃度為40%，提取時間為4h，料液比為1g∶25mL。（4）提取時間對蛋白質(zhì)提取率影響的試驗。提取時間分別取1、2、3、4、5、6、7h，提取溫度為40℃，乙醇濃度為40%，料液比為1g∶25mL。

1.3.4響應(yīng)面試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert8.0.6中的Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計響應(yīng)面試驗，以料液比、乙醇濃度、溫度、時間為自變量，以提取率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法對僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的提取工藝條件參數(shù)進行優(yōu)化，其各因素的編碼水平見表1。

1.3.5SDS-PAGE檢測取適量蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，沸水浴處理10min，得電泳樣品。按照常規(guī)方法進行SDS-PAGE分析，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，于80V恒壓電泳2h，當(dāng)溴酚藍指示劑距膠板底部邊緣1～2cm時結(jié)束電泳，取下凝膠后進行染色、脫色[20]。

1.3.6凝膠分析用凝膠成像系統(tǒng)采集SDS-PAGE凝膠圖像，用QuantityOne軟件定量各條帶的遷移率及灰度值，按如下公式計算各蛋白質(zhì)的比例：

蛋白質(zhì)比例=待測蛋白質(zhì)灰度值/蛋白質(zhì)總灰度值×100%。

1.3.7HPLC檢測采用安捷倫LC1200液相色譜儀進行檢測，色譜柱為EclipsePlusC18（100mm×4.6mmID），流動相為10%乙腈溶液，流速為0.5mL/min，進樣量為20μL，檢測波長為270nm。取適量凍干后的僵蠶蛋白質(zhì)粉末溶解于適量流動相，再按照上述檢測條件進行HPLC檢測。

1.3.8FTIR檢測取適量凍干后的僵蠶蛋白質(zhì)粉末，加入適量溴化鉀（KBr）粉末研磨混勻，壓片后置于傅立葉紅外光譜儀下，于4000～400cm-1范圍內(nèi)進行掃描。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果分析

由圖1-A可知，當(dāng)乙醇濃度達到40%前，提取率隨著乙醇濃度的增加呈上升趨勢;當(dāng)乙醇濃度為40%時，提取率達到峰值為0.531%;之后繼續(xù)提高乙醇濃度，提取率逐漸降低。這可能是因為乙醇濃度過高時，提取液的極性變小，使得蛋白質(zhì)在提取液中的溶解度降低。因此，本研究選擇乙醇提取濃度為40%。由圖1-B可知，當(dāng)料液比小于1g∶25mL時，隨著料液比的增加，提取率呈明顯上升的趨勢;當(dāng)料液比為1g∶25mL時，具有最大提取率，為0.532%;繼續(xù)增加料液比，提取率沒有顯著變化。理論上說，料液比越大，提取液的黏度就越低，蛋白質(zhì)就越容易溶出。當(dāng)料液比達到1g∶25mL后，蛋白質(zhì)的溶出趨于平衡，料液比的增加不再使提取率升高，過多的提取液反而會造成資源浪費和后續(xù)處理的困難。綜合考慮，選擇料液比為1g∶25mL。由圖1-C可知，當(dāng)溫度低于40℃時，隨著溫度的上升，提取率逐漸升高，在溫度為40℃時達到峰值，為0.519%;當(dāng)溫度繼續(xù)提高時，提取率反而降低，這可能是因為隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)會發(fā)生變性，進而形成凝膠，從而增加了提取液的黏度，導(dǎo)致分離困難，并且過高的溫度也會造成能耗的增加。綜合考慮，選擇提取溫度為40℃。由圖1-D可知，當(dāng)提取時間小于4h時，提取率隨著提取時間的增加而升高;當(dāng)提取時間為4h時，提取率達到最大值，為0.532%，此時蛋白質(zhì)的溶出率達到了動態(tài)平衡;當(dāng)提取時間超過4h時，若繼續(xù)增加提取時間，提取率反而下降，因此選擇提取時間為4h。

2.2響應(yīng)面結(jié)果分析

響應(yīng)面法是一種結(jié)合數(shù)學(xué)方法與統(tǒng)計方法對所感興趣的響應(yīng)值受多個變量影響的問題進行建模和分析的數(shù)理統(tǒng)計方法，可以實現(xiàn)響應(yīng)值的優(yōu)化。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以蛋白質(zhì)提取率為效應(yīng)值，以料液比、乙醇濃度、溫度和提取時間為自變量進行響應(yīng)面設(shè)計試驗，結(jié)果見表2、表3。

從表3可看出，該模型P值顯著、失擬項不顯著，表明模型擬合得較好。另外，料液比、溫度、提取時間對乙醇溶液提取僵蠶蛋白質(zhì)的影響極顯著，其中交互項AC、BD對僵蠶醇溶蛋白質(zhì)提取率具有顯著或極顯著影響，結(jié)果如圖2所示。

用Design-Expert8.0.6軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行分析，擬合得回歸方程：

Y=0.530+0.680A+0.280B-0.580C-0.410D-0.025AB+1.200AC+0.300AD+0.330BC+0.500BD+0.330CD-1.600A2-0.260B2-0.076C2-0.070D2。

從該回歸方程可以看出，4個因素對僵蠶醇溶性蛋白質(zhì)提取率影響的排序為料液比>溫度>提取時間>乙醇濃度。通過軟件計算分析，得出最佳僵蠶醇溶蛋白質(zhì)提取工藝為料液比1g∶24.22mL，乙醇濃度38.73%，溫度35℃，提取時間3.94h，在此條件下獲得最佳僵蠶醇溶性蛋白質(zhì)的提取率為0.5402%。

2.3驗證試驗

取3份僵蠶粉末，按照最佳提取工藝條件進行試驗，重復(fù)3次，得到僵蠶醇溶蛋白質(zhì)平均提取率為0.5417%。該結(jié)果與理論最大值一致，說明本試驗的數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定可靠。

2.4SDS-PAGE指紋圖譜分析

按照“1.3.5”節(jié)與“1.3.6”節(jié)方法進行僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的SDS-PAGE指紋圖譜分析。由圖3可以看出，用40%乙醇溶液提取的蛋白質(zhì)樣品為多種中小分子量（16.7～36.2ku）蛋白質(zhì)形成的混合物，其中分子量較小（16.7～23.1ku）的蛋白質(zhì)占蛋白質(zhì)總量的74%，其遷移率為0.808～0.945;分子量較大（32.5～36.2ku）的蛋白質(zhì)占蛋白質(zhì)總量的24.8%，其遷移率為0.603～0.651。

2.5HPLC指紋圖譜分析

按照“1.3.7”節(jié)所述方法進行僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的HPLC指紋圖譜分析。如圖4所示，共形成保留時間介于1.630～6.115min的6個色譜峰，其中主要醇溶蛋白質(zhì)的保留時間分別為2.048、3.354min，其含量分別占總蛋白含量的31.23%、32.93%。

2.6FTIR指紋圖譜分析

按照“1.3.8”節(jié)所述進行僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的FTIR指紋圖譜分析。由圖5可見，用40%乙醇提取的僵蠶蛋白質(zhì)在4000～400cm-1范圍內(nèi)共有6個吸收峰，其中2927.71cm-1處為甲基、亞甲基的C—H伸縮振動峰，1631.71cm-1處為蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶的C[FY=，1]O的伸縮振動峰，1457.24、1310.71cm-1處為C—H的彎曲振動吸收峰。冀憲領(lǐng)等曾報道，僵蠶75%乙醇提取物的FTIR指紋圖譜的主要特征吸收峰為1723、1300、1210cm-1等[21]，將其研究結(jié)果與本研究結(jié)果相結(jié)合，可為基于FTIR技術(shù)鑒定僵蠶提供較好的試驗依據(jù)。

3結(jié)論與討論

植物中含有較多的醇溶蛋白質(zhì)，研究結(jié)果表

明，這些蛋白質(zhì)具有良好的生物相容性、利用度及可降解性，可用作多種支架材料、黏附材料及載體材料，在食品及醫(yī)藥方面有廣闊的應(yīng)用前景[22-25]。但是，動物來源的醇溶蛋白質(zhì)至今仍鮮有報道。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化了僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的提取工藝，結(jié)果表明，最佳提取條件為料液比1g∶24.22mL，乙醇濃度38.73%，溫度35℃，提取時間3.94h，蛋白質(zhì)的最優(yōu)提取率為0.5402%，建立了僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的SDS-PAGE、HPLC、FTIR指紋圖譜，為后續(xù)僵蠶醇溶蛋白質(zhì)的研究及開發(fā)利用創(chuàng)造了條件。

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