馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交研究進(jìn)展

趙小強(qiáng) 鹿金穎 陳瑜 李華盛

摘要：馬鈴薯是最早成功進(jìn)行離體培養(yǎng)并獲得體細(xì)胞雜種植株的農(nóng)作物之一。原生質(zhì)體培養(yǎng)及再生是體細(xì)胞雜交的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，體細(xì)胞雜交技術(shù)可以避免馬鈴薯因倍性水平和胚乳平衡數(shù)造成在常規(guī)育種上的難點(diǎn)。本文在介紹馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)影響因素和體細(xì)胞雜交技術(shù)及其在馬鈴薯遺傳育種應(yīng)用的基礎(chǔ)上，主要分析了影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的重要因素，包括基因型、外植體、預(yù)處理、分離技術(shù)和培養(yǎng)方法等，并且總結(jié)了體細(xì)胞雜交技術(shù)在馬鈴薯遺傳育種中的應(yīng)用，同時(shí)針對(duì)存在的問(wèn)題提出建議與相應(yīng)對(duì)策并進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯;原生質(zhì)體培養(yǎng);體細(xì)胞雜交;遺傳育種;建議;研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)： S532.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）22-0006-09

作者簡(jiǎn)介：趙小強(qiáng)（1985—），男，甘肅武山人，博士，工程師，從事空間植物育種研究。E-mail：wushan2002zxq@126.com。

通信作者：鹿金穎，博士，研究員，從事空間生物學(xué)研究。E-mail：lujinying2001@sina.com。

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）屬茄科茄屬植物[1]，是繼小麥、水稻和玉米之后第四大栽培作物[2]。馬鈴薯是未來(lái)保障全球人口糧食資源的重要作物，預(yù)計(jì)到2050年全球人口將增至97億[3]。我國(guó)馬鈴薯的種植面積位居世界第一，主要分布在西南山區(qū)、西北和東北等地區(qū)。同時(shí)，各航天大國(guó)進(jìn)行了空間生物再生生命保障系統(tǒng)（BLSS）中候選植物物種的篩選，馬鈴薯因營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、空間占用體積小、繁殖容易、園藝操作簡(jiǎn)單、株高相對(duì)矮等特點(diǎn)被作為BLSS的候選植物物種[4]。

馬鈴薯是多倍體，在自然界中存在不同倍性的種質(zhì)資源，其中二倍體占74.4%，包括絕大多數(shù)的原始栽培種和野生種，它們是馬鈴薯抗病、抗蟲(chóng)和抗逆等優(yōu)良性狀選育的重要種質(zhì)資源[5]。馬鈴薯栽培種的遺傳背景較狹窄[6]，生產(chǎn)上應(yīng)用的普通馬鈴薯基本為四倍體，但野生種為二倍體，由于倍性水平和胚乳平衡數(shù)的差異[7]，許多野生資源的優(yōu)質(zhì)基因難以通過(guò)傳統(tǒng)育種轉(zhuǎn)移到普通馬鈴薯上。為了充分利用野生種質(zhì)資源，拓寬栽培馬鈴薯狹窄的遺傳基礎(chǔ)，研究人員付出了巨大的努力。體細(xì)胞雜交技術(shù)的利用，可以有效克服馬鈴薯栽培種和野生種因倍性差異引起的生殖隔離，將野生種的優(yōu)質(zhì)基因轉(zhuǎn)移至栽培種用來(lái)選擇改良品種[8]，同時(shí)可以避免與轉(zhuǎn)基因相關(guān)的生物安全監(jiān)管問(wèn)題。隨著體細(xì)胞雜交技術(shù)的發(fā)展，研究人員展開(kāi)了大量馬鈴薯原生質(zhì)體融合的研究。本文綜述了馬鈴薯體原生質(zhì)培養(yǎng)、體細(xì)胞雜交的研究進(jìn)展及其在遺傳育種中的研究應(yīng)用，同時(shí)針對(duì)存在的問(wèn)題提出建議和意見(jiàn)并進(jìn)行了討論和展望。

1 原生質(zhì)體的培養(yǎng)

1960年Cocking首次用酶解法制備獲得了煙草大量的原生質(zhì)體[9]。10年后，Takebe等成功獲得經(jīng)煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株[10]。Lorenzini最早開(kāi)展馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究，他通過(guò)游離四倍體馬鈴薯莖塊原生質(zhì)體，試驗(yàn)只獲得了原生質(zhì)體來(lái)源的愈傷組織[11]。隨后，Butenko等對(duì)普通栽培種Chacoense葉片原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)得到了植株，但植株染色體數(shù)目有缺失[12]。同年，Shepard等通過(guò)改進(jìn)培養(yǎng)方法，獲得了商業(yè)品種布爾班克葉片原生質(zhì)體來(lái)源形態(tài)完整的再生植株[13]。馬鈴薯是最早成功進(jìn)行離體培養(yǎng)并獲得體細(xì)胞雜種植株的農(nóng)作物之一[14]。目前，關(guān)于馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)的報(bào)道較多，但其采用的試驗(yàn)材料和培養(yǎng)方法存在較大的差異。影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素較多，主要包括基因型、外植體、預(yù)處理、分離技術(shù)和培養(yǎng)方法等。

1.1 原生質(zhì)體的游離

1.1.1 基因型和外植體的類型

研究表明，基因型是影響茄科茄屬植物原生質(zhì)體再生的重要因素之一[15-16]。不同基因型的馬鈴薯在原生質(zhì)體培養(yǎng)時(shí)，可以觀察到從原生質(zhì)體開(kāi)始培養(yǎng)到肉眼可見(jiàn)的愈傷組織整個(gè)階段無(wú)顯著差異，但形成的愈傷組織在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)分化效率存在顯著差異[17]，這表明不同基因型在愈傷組織分化階段對(duì)培養(yǎng)基的成分存在敏感性差異。

用來(lái)酶解馬鈴薯原生質(zhì)體的外植體較為廣泛，包括塊莖[18]、根尖[19]、芽[15，20]、葉片[21-28]、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞[27，29-32]、實(shí)生苗子葉及下胚軸[33-34]和花粉[35-36]等。在上述材料中，葉片酶解后可獲得在生理和遺傳特性上較一致的原生質(zhì)體，同時(shí)植株的培養(yǎng)條件和苗齡等因素對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力有較大的影響，因此無(wú)菌試管苗被選為獲得高質(zhì)量原生質(zhì)體的最佳材料。

1.1.2 外植體的預(yù)處理

提高原生質(zhì)體對(duì)不利因素的耐受力可獲得產(chǎn)量和活力較高的馬鈴薯原生質(zhì)體。研究者通常在酶解前或者在酶解過(guò)程中對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理，通過(guò)改變細(xì)胞和細(xì)胞壁的生理狀態(tài)來(lái)提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。預(yù)處理的方法有：（1）低溫處理。李世君等將25 ℃下培養(yǎng)28 d的馬鈴薯無(wú)菌苗于4 ℃下過(guò)夜，發(fā)現(xiàn)低溫處理可以有效提高原生質(zhì)體的活力[37]。（2）抽真空處理。戴朝曦等將試驗(yàn)材料剪碎后連同酶解液一起置于真空抽氣瓶中，在0.05 MPa壓力條件下抽氣10 min，由于壓力有效提高了材料原生質(zhì)體釋放的速度及原生質(zhì)體的產(chǎn)量，同時(shí)由于減少了材料在酶解液中的時(shí)間，原生質(zhì)體的活力也有大幅度提高[38]。吳旺澤等將材料在酶解前進(jìn)行低溫處理并對(duì)組織和酶液進(jìn)行真空滲透處理，預(yù)處理顯著提高了原生質(zhì)體游離速度和原生質(zhì)體產(chǎn)量[39]。（3）弱光短周期處理。Shepard等將材料游離原生質(zhì)體前進(jìn)行弱光短光照周期處理，發(fā)現(xiàn)此處理可顯著提高馬鈴薯原生質(zhì)體產(chǎn)量[13]。（4）葉片離體培養(yǎng)。劉文萍等將馬鈴薯葉片在MS液體培養(yǎng)基4 ℃下處理或者在FM液體培養(yǎng)基中20 ℃下黑暗處理48 h后轉(zhuǎn)入CM培養(yǎng)基中4 ℃下持續(xù)24 h，此處理可顯著提高原生質(zhì)體質(zhì)量且較多細(xì)胞進(jìn)行分裂[40]。（5）藥物處理。在馬鈴薯植株培養(yǎng)基中添加乙烯拮抗劑AgNO3[41]和H2S2O3[42-43]可促進(jìn)馬鈴薯原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)。因此，選擇適宜的預(yù)處理方法是獲得高質(zhì)量馬鈴薯原生質(zhì)體的重要因子。

1.1.3 外源影響因子 影響原生質(zhì)體酶解的外源因子主要有酶制劑的類型、酶解液的滲透壓、酶解溫度、酶解時(shí)間和酶解液的pH值等。

用于游離原生質(zhì)體的酶制劑主要有纖維素酶、果膠酶和離析酶。酶制劑的不同組合及濃度是影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的重要因素，具體應(yīng)根據(jù)材料類型和酶制劑活力而選擇。對(duì)去細(xì)胞壁相對(duì)容易的材料如幼嫩葉片和下胚軸等，應(yīng)選擇相對(duì)溫和的酶和較低的濃度;而以愈傷組織細(xì)胞懸浮系為材料時(shí)，應(yīng)選用活性較高的酶。酶為生物活性物質(zhì)，同一類型的酶因不同廠商甚至批次的差異會(huì)影響酶的活力，所以應(yīng)根據(jù)多次試驗(yàn)確定[44]。

酶解液的滲透壓是影響原生質(zhì)體能否成功離解的另一個(gè)因素，植物細(xì)胞酶解后需適宜的滲透壓來(lái)維持細(xì)胞生長(zhǎng)的正常狀態(tài)，否則會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。李韜等研究證明，以蔗糖作為滲透壓調(diào)節(jié)劑時(shí)可以減小原生質(zhì)體的損傷并提高其活力，其效果優(yōu)于選用甘露醇或葡萄糖+甘露醇[45]。孫海宏等研究證明，用0.3 mol/L甘露醇作為滲透壓調(diào)節(jié)劑可獲得產(chǎn)量和活力較高的馬鈴薯葉片原生質(zhì)體[28]，而一些研究者在培養(yǎng)馬鈴薯原生質(zhì)體時(shí)采用0.4～0.6 mol/L甘露醇來(lái)維持滲透壓[26]。[JP2]趙小強(qiáng)等在進(jìn)行草地早熟禾原生質(zhì)體培養(yǎng)時(shí)采用0.4 mol/L[JP]甘露醇來(lái)維持滲透壓，并且發(fā)現(xiàn)在原生質(zhì)體培養(yǎng)過(guò)程中逐步降低滲透壓的濃度有利于愈傷組織的形成[46]。

游離原生質(zhì)體酶解液的溫度為25～30 ℃。陳鵬認(rèn)為，酶解溫度受所用酶的活性和材料類型的影響，馬鈴薯葉片原生質(zhì)體酶解的最佳溫度為 28 ℃[31]。孫海宏等研究證明，雖然28 ℃時(shí)可獲得最高產(chǎn)量的原生質(zhì)體，但此時(shí)原生質(zhì)體狀態(tài)差于（25±1） ℃ 時(shí)獲得的原生質(zhì)體，因此建議最佳的酶解溫度為（25±1） ℃[28]。

酶的活性與pH值也較為密切。酶解液的pH值常被調(diào)節(jié)在4.7～6.0之間。常用的Onozuka纖維素酶R-10和離析酶R-10最佳的pH值范圍分別為50～6.0和4.0～5.0[47]。

酶的類型和濃度是影響酶解原生質(zhì)體的時(shí)間和產(chǎn)量的關(guān)鍵的因素;酶解液滲透壓是影響獲得高質(zhì)量原生質(zhì)體并形成愈傷組織的重要因素;酶解溫度及pH值對(duì)馬鈴薯原生質(zhì)體的解離和質(zhì)量也有重要的影響，因此在實(shí)際操作過(guò)程中必須綜合考慮這些重要因子[48]。

1.2 原生質(zhì)體的再生

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

常用于馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)的培養(yǎng)基有MS[49]、B5[50]、KM[51]、VKM[52]和SKM[15]等培養(yǎng)基。游離獲得的原生質(zhì)體從愈傷組織形成到愈傷組織進(jìn)一步分化所用培養(yǎng)基及組成與組織器官培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基類似[53-54]。馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)基中加入甘氨酸、聚乙烯吡咯烷酮和維生素C等可有效防止原生質(zhì)體再生細(xì)胞團(tuán)的褐化現(xiàn)象[47];在培養(yǎng)基中添加適量的活性炭可促進(jìn)原生質(zhì)體細(xì)胞的分裂[55]。進(jìn)行單個(gè)原生質(zhì)體培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)基中添加1.2%馬鈴薯塊莖浸提液可顯著提高細(xì)胞分裂的頻率[45]。

原生質(zhì)體培養(yǎng)在形成大量的愈傷組織之前應(yīng)置于黑暗或者弱光下培養(yǎng)，這是因?yàn)閺?qiáng)光會(huì)造成原生質(zhì)體葉綠素分解而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在（24±1） ℃黑暗條件下培養(yǎng)的馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)1 d后，在顯微鏡下可觀察到其體積增大并伴隨細(xì)胞壁的再生，培養(yǎng)3～5 d后細(xì)胞發(fā)生第1次和第2次分裂，但在（28±1） ℃條件下培養(yǎng)時(shí)，原生質(zhì)體能再生出細(xì)胞壁但不能進(jìn)一步分裂[56]。因此，基于不同的試驗(yàn)材料，選擇適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的核心技術(shù)。

1.2.2 原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法

原生質(zhì)體培養(yǎng)方法主要有固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)以及由固液培養(yǎng)方法衍生出的一系列培養(yǎng)方法。各種培養(yǎng)方法在馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)中均有使用，其中液體淺層培養(yǎng)法是最常用且效果最佳的培養(yǎng)基，其次是海藻酸鈉薄層固液雙層培養(yǎng)法[31]。馬鈴薯在進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)觀察到有愈傷組織形成時(shí)即可迅速轉(zhuǎn)移至除去維持滲透壓的固體培養(yǎng)基中進(jìn)一步進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代1～2次后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)。

2 體細(xì)胞雜交

體細(xì)胞技術(shù)可以克服有性雜交不親和性的障礙，實(shí)現(xiàn)在近緣的種內(nèi)或種間，遠(yuǎn)緣的屬間甚至科之間形成雜種細(xì)胞，擴(kuò)大遺傳變異的重組范圍，創(chuàng)造出常規(guī)育種技術(shù)不能獲得的新品種（系），并且原生質(zhì)體融合不涉及DNA的體外重組，無(wú)潛在的安全性問(wèn)題。1980年，Butenko等首次對(duì)普通四倍體栽培種與二倍體野生種S.chacoense進(jìn)行細(xì)胞融合，獲得了抗Y病毒（PVY）的體細(xì)胞雜種植株[57]。隨后研究人員進(jìn)行了較多馬鈴薯融合研究，產(chǎn)生了幾百個(gè)馬鈴薯體細(xì)胞雜種，Tiwari等對(duì)近40年馬鈴薯體細(xì)胞雜交做了匯總[58]。

2.1 原生質(zhì)體的融合方法

馬鈴薯原生質(zhì)體融合常用的方法有電融合法和聚乙二醇法（polyethlene glycol，PEG）。在研究初期，PEG化學(xué)誘導(dǎo)方法被廣泛使用，但隨著電融合方法的不斷改進(jìn)完善，利用電融合方法獲得馬鈴薯雜種植株的報(bào)道越來(lái)越多。這可能是和PEG法相比較，電融合法具有操作簡(jiǎn)單，參數(shù)易于控制，并且不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用等優(yōu)點(diǎn)。在糧食作物中，馬鈴薯是最先使用電融合技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合的作物[59]。

2.2 雜種細(xì)胞的篩選與鑒定

原生質(zhì)體融合后的產(chǎn)物包括自身融合的同核體、異源融合的異核體和未發(fā)生融合的雙親本的原生質(zhì)體，而異核體是要選擇進(jìn)一步培養(yǎng)的細(xì)胞，因此，要采用特定的方法對(duì)雜種細(xì)胞進(jìn)行篩選和鑒定。

2.2.1 雜種細(xì)胞的篩選 雜種細(xì)胞篩選常用的方法有物理選擇法、互補(bǔ)選擇法和生長(zhǎng)差異選擇法。

物理選擇法是根據(jù)親本天然顏色不同，選擇具有雙親顏色的異核體，如王清等利用子葉原生質(zhì)體葉綠體含量多但下胚軸原生質(zhì)體含量少為標(biāo)記，對(duì)馬鈴薯雜種細(xì)胞進(jìn)行挑選[60]。

互補(bǔ)選擇法是通過(guò)轉(zhuǎn)抗性標(biāo)記植株、雙突變體和營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體對(duì)異核體進(jìn)行選擇。Teruo利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將卡那霉素抗性和潮霉素抗性轉(zhuǎn)移至2個(gè)供試品種，融合后利用同時(shí)含有卡那霉素和潮霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，最終獲得雜種植株[61]。

生長(zhǎng)差異選擇法是在篩選培養(yǎng)基上只適合雜種細(xì)胞正常生長(zhǎng)而其他細(xì)胞不能正常生長(zhǎng)的篩選方法。

2.2.2 體細(xì)胞雜種植株的鑒定 通過(guò)培養(yǎng)獲得雜種細(xì)胞再生植株后，為了檢測(cè)是否為目標(biāo)融合體須要對(duì)植株進(jìn)行鑒定。目前，篩選鑒定主要從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和生化及分子生物學(xué)等方面進(jìn)行鑒定。

形態(tài)學(xué)特征大多由多基因控制，但經(jīng)常會(huì)發(fā)生一些異常的改變，所以僅憑形態(tài)學(xué)特征具有一定的缺陷，故選用其他方法鑒定。

生物化學(xué)方法鑒定是通過(guò)分析同工酶對(duì)體細(xì)胞雜種進(jìn)行鑒定。同工酶常采用過(guò)氧化物酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，雜種的同工酶譜帶常表現(xiàn)為融合雙親譜帶之和，有時(shí)部分親本帶會(huì)丟失，有時(shí)雜種甚至出現(xiàn)新的譜帶。司懷軍等對(duì)融合而來(lái)的馬鈴薯雜種植株進(jìn)行過(guò)氧化物同工酶譜分析，結(jié)果雜種植株過(guò)氧化物同工酶表現(xiàn)為雙親酶譜譜帶總和[62]。

分子生物學(xué)方法鑒定是一種對(duì)雜種高效鑒定的方法。常用的分子標(biāo)記技術(shù)為隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性（RAPD）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）、限制性內(nèi)切酶片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）和擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）等。Szczerbakowa等利用RAPD技術(shù)分析S. nigrum（+） S. tuberosum雜種植株，雜種植株表現(xiàn)出具有雙親特征條帶[63]。李鳳云等利用RAPD技術(shù)分析抗晚疫病的馬鈴薯二倍體野生種S. chacoense與感晚疫病的四倍體材料DY4-5-10雜種植株，有8個(gè)引物擴(kuò)增出兩親本的差異帶，在101個(gè)再生植株中94個(gè)為雜種[64]。Fock等利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)S. stenotomum （+） S. tuberosum雜種植株進(jìn)行了分析鑒定并獲得雜種植株[24];李朋等對(duì)青枯病抗性的體細(xì)胞雜種與栽培種雜交產(chǎn)的后代利用SSR分子標(biāo)記分析鑒定，最終獲得3個(gè)標(biāo)記可以明確鑒定抗感基因型[65]。Liu等利用特定親本SSR標(biāo)記對(duì)不對(duì)稱雜交后代的基因組成進(jìn)行了標(biāo)記[66]。Helgeson等利用細(xì)胞融合技術(shù)將S. tuberosum （+） S. bulbocastanum融合，獲得的植株經(jīng)RAPD和RFLP鑒定，從而獲得了雜種植株[67]。Rakosy-Tican等通過(guò)對(duì)雜種后代利用SSR和AFLP標(biāo)記，認(rèn)為雜種植株對(duì)稱或者不對(duì)稱雜交的比例取決于馬鈴薯的品種[68]。Tiwari 等利用AFLP和MSAP分子標(biāo)記法對(duì)S. tuberosum （+） S. etuberosum雜種植株進(jìn)行遺傳和表觀變化分析，結(jié)果表明，雜種植株和其母本相比較，再生植株在組織培養(yǎng)過(guò)程中的表觀遺傳變異最?。?%～6%）[69]。此外，分子標(biāo)記技術(shù)還可對(duì)細(xì)胞質(zhì)基因組（葉綠體和線粒體基因組）來(lái)源進(jìn)行鑒定，Chandel等對(duì)S.tuberosum （+） S. cardiophyllum雜種后代通過(guò)RAPD、內(nèi)部簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性（ISSR）、SSR、AFLP分子鑒定和細(xì)胞質(zhì)基因組進(jìn)行鑒定，確定了抗晚疫病的雜種植株[70]。Fock等對(duì)10個(gè)馬鈴薯S. tuberosum （+） S. phureja體細(xì)胞雜種植株用細(xì)胞質(zhì)特異SSR引物進(jìn)行鑒定，其中8株具有S. phureja葉綠體DNA，其余2株具有S. tuberosum葉綠體DNA[71]。蔡興奎等用葉綠體SSR引物篩選鑒定了馬鈴薯栽培種S. tuberosum和二倍體野生種S. chacoense雜種葉綠體的組成，觀察到體細(xì)胞雜種中同時(shí)具有單親本類型和雙親本的重組類型[72]。

在上述幾類鑒定方法中，因分子標(biāo)記法僅需少量材料即可對(duì)雜種植株的核基因組和胞質(zhì)基因組[73-74]進(jìn)行快速分析鑒定，因此被科研工作者廣泛采用。近年來(lái)，基于綠色熒光蛋白標(biāo)記的方法可被用來(lái)鑒定雜種植株[75]。因此，選擇一種快速、簡(jiǎn)單、低成本且可靠的方法來(lái)鑒定雜種植株顯得尤為重要。

3 體細(xì)胞雜交技術(shù)在馬鈴薯遺傳改良中的應(yīng)用

3.1 獲得抗病新種質(zhì)

體細(xì)胞雜交技術(shù)可有效克服馬鈴薯野生種與栽培種的生殖障礙，通過(guò)此技術(shù)可以將野生種抗真菌基因、抗細(xì)菌基因、抗病毒基因和優(yōu)良農(nóng)藝性狀基因等轉(zhuǎn)移至普通栽培種中，從而提高栽培品種的整體特性。

3.1.1 抗真菌新種質(zhì)的獲得

栽培種容易感染的真菌病害有晚疫病、早疫病和黃萎病等病害。[JP2]Helgeson等利用細(xì)胞融合技術(shù)獲得S. tuberosum （+）[JP] S. bulbocastanum的雜種植株，經(jīng)鑒定雜種植株具有抗晚疫病的特性[67]。Luthra等通過(guò)對(duì)馬鈴薯種間S. tuberosum （+） S. cardiophyllum融合雜種植株cph-hybrids分析，雜種植株對(duì)晚疫病表現(xiàn)出良好的抗性，同時(shí)干物質(zhì)的含量和品質(zhì)均高于親本[76]。Smyda-Dajmund利用細(xì)胞融合技術(shù)獲得S. michoacanum （+） S. tuberosum的雜種植株后再與S. michoacanum回交，最終獲得抗晚疫病的雜種馬鈴薯植株[77]。Luthra等對(duì)S. tuberosum （+） S. pinnatisectum 雜種植株在大田進(jìn)行分析，雜種植株較對(duì)照對(duì)晚疫病表現(xiàn)出明顯的抗性，并且品質(zhì)性狀也優(yōu)于對(duì)照[78]。龍葵（S. nigrum）和馬鈴薯（S. tuberosum）經(jīng)細(xì)胞融合后，獲得倍性變異幅度較大的雜種植株，經(jīng)鑒定，雜種整株對(duì)晚疫病的抗性與S. nigrum相當(dāng)，并且部分雜種植株離體葉片抗性高于S. nigrum[63]。Tek等利用體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得S. tuberosum （+） S. brevidens雜種植株，部分雜種植株對(duì)馬鈴薯早疫病具有良好的抗性[25]。Jadari等利用電融合技術(shù)獲得S.tuberosum （+） S. torvum雜種植株，所得雜種植株均對(duì)黃萎病產(chǎn)生抗性，說(shuō)明大麗輪枝菌病原菌（Verticillium dahliae）抗性轉(zhuǎn)移至馬鈴薯，從而抑制了馬鈴薯黃萎病的發(fā)生[79]。

3.1.2 抗細(xì)菌新種質(zhì)的獲得 栽培種在種植時(shí)容易感染軟腐病、青枯病和環(huán)腐病等細(xì)菌性病害。Austin等利用S. tuberosum （+） S. brevidens可育的體細(xì)胞雜種與馬鈴薯四倍體栽培種回交，獲得抗軟腐病的馬鈴薯[80]。McGrath等對(duì)S. tuberosum （+） S. brevidens細(xì)胞融合的雜種株系分析，發(fā)現(xiàn)抗軟腐病的基因穩(wěn)定導(dǎo)入馬鈴薯雜種植株中[81]。Fock等利用電融合技術(shù)對(duì)栽培種S. tuberosum和野生種S. stenotomum進(jìn)行細(xì)胞的融合，獲得抗青枯病與S. stenotomum相當(dāng)?shù)碾s種植株[24]。Ahn等通過(guò)分析由S. brevidens （+） S. tuberosum細(xì)胞融合而來(lái)的雜種株系，觀察到雜種株系抗青枯病的能力要強(qiáng)于親本，為進(jìn)一步獲得新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)[82]。2003年，蔡興奎利用中薯無(wú)性系3#和8#與野生種S. chacoense融合，在我國(guó)首次創(chuàng)造出具有青枯病抗性的體細(xì)胞雜種[22]，3年之后他們對(duì)這些雜合體進(jìn)行倍性檢測(cè)，觀察到融合后的六倍體后代穩(wěn)定保持[83];2016年，他們課題組通過(guò)不對(duì)稱融合技術(shù)又獲得抗青枯病的雜種植株[66]，這為培育抗青枯病的新品種（系）奠定了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)。Laurila等通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)獲得了S. tuberosum （+） S. acaule雜種植株，雜種植株根據(jù)核基因來(lái)源于S. acaule所占比例，呈現(xiàn)出對(duì)環(huán)腐病不同程度的抗性[84]。Tek等利用體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得S. tuberosum和S. brevidens體細(xì)胞雜種植株，經(jīng)檢測(cè)部分雜種品系表現(xiàn)出對(duì)馬鈴薯軟腐病良好的抗性[25]。Yu等通過(guò)電融合獲得S. melongena （+） S. tuberosum的雜種后代，后代表現(xiàn)出抗青枯病，說(shuō)明抗青枯病的特性從茄子成功轉(zhuǎn)移至馬鈴薯，這為培育抗青枯病馬鈴薯奠定了基礎(chǔ)[85]。

3.1.3 抗病毒病新種質(zhì)的獲得

野生種S. brevidens對(duì)馬鈴薯卷葉?。≒LRV）、X病毒（PVX）和Y病毒（PVY）都具有顯著的抗性，利用細(xì)胞融合技術(shù)將該品種的抗病毒性轉(zhuǎn)移到不同馬鈴薯品種中，獲得抗病毒病的株系。Rokka等通過(guò)培養(yǎng)體細(xì)胞雜種S. tuberosum （+） S. brevidens三倍體植株花藥獲得單倍體，該單倍體植株對(duì)PLRV具有良好的抗性[86]。Gillen等通過(guò)對(duì)S. etuberosum （+） S. tuberosum雜種后代分析，雜種植株表現(xiàn)出對(duì)PLRV具有較強(qiáng)的抗性[87]。Nouri-Ellouz等利用電融合技術(shù)獲得馬鈴薯2個(gè)二倍體雜種植株，在大棚接種馬鈴薯Y病毒，一些雜種植株的癥狀延遲出現(xiàn)并且感染率降低，其中1株表現(xiàn)完全抗馬鈴薯Y病毒[88]。Nouri-Ellouz等通過(guò)細(xì)胞融合獲得的馬鈴薯體細(xì)胞雜種S. berthaultii （+） S. tuberosum對(duì)土傳真菌和馬鈴薯Y病毒表現(xiàn)出部分抗性[89]。

3.2 獲得抗蟲(chóng)新種質(zhì)

馬鈴薯在生長(zhǎng)過(guò)程中，易遭受蚜蟲(chóng)、甲蟲(chóng)和線蟲(chóng)等蟲(chóng)害的危害。Novy等通過(guò)對(duì)S. etuberosum （+） S. tuberosum雜種后代在大田中研究，發(fā)現(xiàn)大田中馬鈴薯桃蚜的生殖力及成蟲(chóng)大小均減小，同時(shí)后代表現(xiàn)出對(duì)馬鈴薯桃蚜、PLRV和PVY具有多重抗性[90]。Thieme等通過(guò)電融合獲得S. cardiophyllum （+） S. tuberosum的雜種植株，經(jīng)鑒定野生種的cph基因成功轉(zhuǎn)移至商業(yè)品種中，雜種植株表現(xiàn)出對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)的抗性，同時(shí)對(duì)PVY也表現(xiàn)出一定的抗性[91]。Jeffrey等將融合獲得的S. tuberosum （+） S. bulbocastanum雜種植株再與栽培種回交，在篩選出的63個(gè)品系中有9個(gè)品系表現(xiàn)出對(duì)綠桃蚜蟲(chóng)的抗性，有5個(gè)品系表現(xiàn)出對(duì)馬鈴薯蚜蟲(chóng)的抗性[92]。Cooper-Bland等對(duì)馬鈴薯的2個(gè)二倍體進(jìn)行電融合，獲得的雜種植株對(duì)馬鈴薯胞囊線蟲(chóng)表現(xiàn)出一定的抗性[93]。

3.3 獲得抗霜凍新種質(zhì)

馬鈴薯易受冷、熱和霜等不同類型的非生物脅迫，還面臨著全球變暖導(dǎo)致水的限制。馬鈴薯栽培品種不耐低溫，在-3.5 ℃時(shí)很快死亡，而野生種S. commersonii能在-4.5 ℃條件下存活，最低耐-11.5 ℃[94]，Cardi等利用體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得了S. tuberosum （+） S. commersonii雜種植株，雜種植株表現(xiàn)出抗霜凍性高于親本S. tuberosum的特性[95]。Nyman等也利用體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得了S. tuberosum （+） S. commersonii的體細(xì)胞雜種，雜種植株具有抗霜凍特性，說(shuō)明野生種抗凍基因已轉(zhuǎn)移到栽培種上[96]。

3.4 獲得雄性不育新種質(zhì)

在預(yù)防馬鈴薯病害的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)種子可以避免一些病害的傳播，因此可以利用細(xì)胞融合技術(shù)培育新的雄性不育系，以應(yīng)用于實(shí)生種子生產(chǎn)。Perl等融合了碘乙酰胺處理的馬鈴薯和γ輻射的原生質(zhì)體（含有S. stoloniferum胞質(zhì)），雜種植株呈現(xiàn)出雄性不育的特性，從而阻斷了通過(guò)實(shí)生種子傳播的病害[97]。

3.5 獲得耐鹽新種質(zhì)

Trabelsi等利用PEG融合法獲得了S. tuberosum （+） S. verne 雜種植株，通過(guò)耐鹽性試驗(yàn)檢測(cè)，雜種植株對(duì)鹽的耐受性增強(qiáng)[98]。Bidani等通過(guò)分析S. tuberosum （+） S. berthaultii的3個(gè)雜種株系STBa、STBc和STBd，結(jié)果證明雜交種系耐鹽性要高于親本BF15[99]，同時(shí)STBc和STBd株系表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性，而STBa株系的耐鹽性處于中間狀態(tài)[100]。

4 問(wèn)題及展望

4.1 建立不同試驗(yàn)材料高效原生質(zhì)體培養(yǎng)體系

由于馬鈴薯遺傳背景的復(fù)雜性，商業(yè)栽培種大多為四倍體，而原始栽培種和野生種大多為二倍體;同時(shí)，由于基因型的差異很難建立一套應(yīng)用于所有馬鈴薯品種的高效原生質(zhì)體培養(yǎng)體系。因此，要在具體工作中建立不同試驗(yàn)材料高效原生質(zhì)體培養(yǎng)再生體系。

4.2 融合方法的創(chuàng)新

傳統(tǒng)的細(xì)胞融合方法主要是電融合和聚乙二醇融合[101]。而在微重力環(huán)境條件下，微重力可以改變細(xì)胞融合液體的存在狀態(tài)，從而有效提高細(xì)胞融合效率?！吧裰菟奶?hào)”飛船中通過(guò)電融合獲得煙草融合細(xì)胞，[JP2]其融合細(xì)胞再生愈傷組織的頻率是地面對(duì)照的3倍多[102]。因此，可以在模擬微重力條件下探究不同的融合方法對(duì)馬鈴薯原生質(zhì)體融合效率的研究，為獲得更多的馬鈴薯雜種植株奠定基礎(chǔ)。

4.3 種質(zhì)資源的創(chuàng)新

馬鈴薯易受冷、熱和霜等不同類型的非生物脅迫，并且栽培種均不耐低溫霜凍且馬鈴薯栽培種種內(nèi)幾乎沒(méi)有遺傳變異[103]，同時(shí)還面臨著全球氣溫升高導(dǎo)致缺水的影響。在降水不規(guī)律、水資源短缺的地區(qū)，馬鈴薯種植可能會(huì)面臨嚴(yán)峻的考驗(yàn)。干旱脅迫已經(jīng)在一定程度上對(duì)馬鈴薯作物造成了嚴(yán)重且持續(xù)的負(fù)面影響[104-105]。Beddington研究發(fā)現(xiàn)，將近40%的馬鈴薯?yè)p失是由病蟲(chóng)害引起的。作為保障全球人口糧食資源的重要作物，利用細(xì)胞融合技術(shù)培育抗生物和非生物耐脅迫馬鈴薯新品種迫在眉睫[106]。

4.4 中國(guó)空間站種植品種的選育

BLSS是為航天員生命活動(dòng)提供物質(zhì)保障的獨(dú)立、完整和復(fù)雜的系統(tǒng)，高等植物是該系統(tǒng)中最為關(guān)鍵的生物部件，它通過(guò)自身的光合作用和蒸騰作用為航天員提供食物、飲用水和氧氣。因生長(zhǎng)環(huán)境的制約，各航天大國(guó)結(jié)合本國(guó)的特點(diǎn)進(jìn)行了BLSS中候選植物物種的篩選，馬鈴薯因生產(chǎn)力高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、園藝操作簡(jiǎn)單和株高相對(duì)矮等特點(diǎn)被各國(guó)作為BLSS的候選植物物種[4]。中國(guó)空間站將于2022年前后建成，結(jié)合BLSS系統(tǒng)對(duì)植物物種的需求，為了滿足中國(guó)空間站馬鈴薯的順利種植，利用體細(xì)胞雜交技術(shù)培育早熟、生長(zhǎng)周期短、植株矮、產(chǎn)量相對(duì)較高、抗病蟲(chóng)害、逆性強(qiáng)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的馬鈴薯新品勢(shì)在必行。同時(shí)，收集具有這些特性的馬鈴薯種質(zhì)建立中國(guó)空間站馬鈴薯種質(zhì)資源庫(kù)也顯得尤為重要。

參考文獻(xiàn)：

[1]Sarbesh D D，Abdellah B，Jennifer S，et al. Genome editing of potato using CRISPR technologies：current development and future prospective[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2019，139（2）：403-416.

[2]Hameed A，Zaidi S S，Shakir S，et al. Applications of new breeding technologies for potato improvement[J]. Frontiers in Plant Science，2018，9：925.

[3]新華社. 聯(lián)合國(guó)報(bào)告：2050年世界人口將達(dá)97億[EB/OL]. （2019-06-18）[2020-01-08].https：//www.sohu.com/a/321369078_267106？_f=index_chan08travelnews_3.

[4]劉 紅. 生物再生生命保障系統(tǒng)理論與技術(shù)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2009.

[5]金黎平，楊宏福. 馬鈴薯遺傳育種中的染色體倍性操作[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1996，4（1）：70-74.

[6]Luthra S K，Gopal J，Sharma P C. Genetic divergence and its relationship with heterosis in potato[J]. Potato Journal，2005，32（1/2）：37-42.

[7]Spooner D M，Salas A. Structure，biosystematics，and genetic resources [M]//Gopal J，Paul K S M. Handbook of potato production，improvement and postharvest management. New York：Food Product Press，2006.

[8]Helgeson J P，Haberlach G T，Ehlenfeldt M K，et al. Fertile somatic hybrids of potato and wild Solanum species：potential for use in breeding programs[J]. American Journal of Potato Research，1993，70：437-452.

[9]Cocking E C. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles[J]. Nature，1960，187（4741）：962-963.[ZK）]

[10]Takebe I，Labib G，Melchers G. Regeneration of whole plants from isolated mesophyll protoplasts of tobacco[J]. Naturwissenschaften，1971，58（6）：318-320.

[11]Lorenzini M. Obtention de protoplasts de tubercule de Pomme de terre[J]. Compte Rendu Hebdomadaire des Séances de lAcadémie des Science Paris，1973，276：1839-1842.

[12]Butenko R G，Kuchko A A，Vitenko V A，et al. Production and cultivation of isolated protoplasts from mesophyll of leaves of Solanum tuberosum L. and Solanum chacoense Bitt[J]. Soviet Plant Physiology，1977，24（3）：541-546.

[13]Shepard J F，Totten R E. Mesophyll cell protoplasts of potato：isolation，proliferation，and plant regeneration[J]. Plant Physiology，1977，60（2）：313-316.

[14]Orczyk W，Przetakiewicz J，Nadolska-Orczyk A. Somatic hybrids of Solanum tuberosum-application to genetics and breeding[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2003，74（1）：1-13.

[15]Hunt G J，Helgeson J P. A medium and simplified procedure for growing single cells from Solanum species[J]. Plant Science，1989，60（2）：251-257.

[16]Coleman M，Davie P，Vessey J，et al. Intraclonal genetic variation for protoplast regenerative ability within Solanum tuberosum cv. record[J]. Annals of Botany，1991，67（4）：459-461.

[17]周宇波，柳 俊，謝從華，等. 馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)體系改良[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，20（5）：469-473.

[18]Jones H，Karp A，Jones M G. Isolation，culture，and regeneration of plants from potato protoplasts[J]. Plant Cell Reports，1989，8（5）：307-311.

[19]Laine E，Ducreux G. Plant regeneration from root apical protoplasts of Solanum tuberosum cv. BF15[J]. Journal of Plant Physiology，1987，126（4/5）：345-354.

[20]Bokelmann G S，Roest S. Plant regeneration from protoplasts of potato （Solarium tuberosum cv. Bintje）[J]. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie，1983，109（3）：259-265.

[21]何亞文，李耿光，張?zhí)m英. 馬鈴薯野生種葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)及其植株再生[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，1996，4（3）：72-74.

[22]蔡興奎，柳 俊，謝從華. 馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體電融合參數(shù)優(yōu)化及雜種植株再生[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，22（5）：494-498.

[23]Binding H，Nehls R，Schieder O，et al. Regeneration of mesophyll protoplasts isolated from dihaploid clones of Solanum tuberosum[J]. Physiologia Plantarum，1978，43（1）：52-54.

[24]Fock I，Collonnier C，Luisetti J，et al. Use of Solanum stenotomum for introduction of resistance to bacterial wilt in somatic hybrids of potato[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2001，39（10）：899-908.

[25]Tek A L，Stevenson W R，Helgeson J P，et al. Transfer of tuber soft rot and early blight resistances from Solanum brevidens into cultivated potato[J]. Theoretische und Angewandte Genetik，2004，109（2）：249-254.

[26]袁華玲，金黎平，黃三文，等. 二倍體馬鈴薯葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究[J]. 生物學(xué)雜志，2014，31（3）：55-59.

[27]Sadia B. Improved isolation and culture of protoplasts from S. chacoense and potato：morphological and cytological evaluation of protoplast-derived regenerants of potato cv. Desiree[J]. Pakistan Journal of Agriculture Sciences，2015，52（1）：51-61.

[28]孫海宏，周 云，賀苗苗，等. 二倍體野生種馬鈴薯Solanum pinnatisectmum原生質(zhì)體分離純化與培養(yǎng)的研究[J]. 分子植物育種，2018，16（1）：140-146.

[29]Szczerbakowa A，Borkowska M，Wielgat B. Plant regeneration from the protoplasts of Solanum tuberosum，S. nigrum and S. bulbocastanum[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2000，22（1）：3-10.

[30]祁 新，趙穎君，王艷秋，等. 馬鈴薯懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，22（1）：52-55.

[31]陳 鵬. 馬鈴薯葉片和懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[32]魏彩霞. 馬鈴薯“GSAP-H”懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合研究[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[33]戴朝曦，孫順娣. 馬鈴薯實(shí)生苗子葉及下胚軸原生質(zhì)體培養(yǎng)研究[J]. 植物學(xué)報(bào)，1994，36（9）：671-678.

[34]Dai C X，Mertz D，Lambeth V. Improved procedures for the isolation and culture of potato protoplasts[J]. Plant Science，1987，50（1）：79-84.

[35]王 蒂，司懷軍，王 清. 馬鈴薯花粉原生質(zhì)體分離的研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，1999，26（5）：323-326.

[36]Wang Y P，Cheng L X，Liang Y C，et al. Isolation and culture of pollen tetrad protoplasts from Solanum tuberosum[J]. American Journal of Potato Research，2017，94（4）：417-424.

[37]李世君，李向輝，孫勇如. 馬鈴薯無(wú)菌苗葉肉原生質(zhì)體再生植株[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，1989，5（1）：57-63.

[38]戴朝曦，孫順娣，李繼紅. 馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)及體細(xì)胞融合和雜交技術(shù)研究[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1995.

[39]吳旺澤，王 蒂，王 清，等.? 馬鈴薯原生質(zhì)體游離與培養(yǎng)體系的研究[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39（2）：146-149.

[40]劉文萍，劉建新，南相日，等. 二倍體馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)與植株再生[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（1）：6-9.

[41]李鳳云，蔡興奎，盛萬(wàn)民，等. 二倍體馬鈴薯試管苗的培養(yǎng)及對(duì)葉肉原生質(zhì)體融合的影響[J]. 中國(guó)馬鈴薯，2014，28（5）：257-263.

[42]Xu Y S，Pehu E，Malone R，et al. Plant regeneration from protoplasts of Solanum species with potential agricultural value （S. hjertingii，S. polyadenium，S. capsicibaccatum）[J]. Plant Cell Reports，1991，9（9）：520-522.

[43]Sarkar D，Sud K C，Chzkrabarti S K，et al. Growing of potato microplants in the presence of alginate-silverthiosulfate capsules reduces ethylene-induced culture abnormalities during minimal growth conservation in vitro[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2002，68（1）：79-89.

[44]Aoyagi H. Development of a quantitative method for determination of the optimal conditions for protoplast isolation from cultured plant cells[J]. Biotechnology Letters，2006，28（20）：1687-1694.

[45]李 韜，戴朝曦. 提高馬鈴薯原生質(zhì)體細(xì)胞分裂頻率的研究[J]. 作物學(xué)報(bào)，2000，26（6）：953-958.

[46]趙小強(qiáng)，馬暉玲，林 棟，等. 草地早熟禾新格萊德胚性愈傷組織原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生的研究[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（2）：55-60.

[47]孫雪梅. 馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（1）：134-136.

[48]李炎林，蔡 柳，胡新喜，等. 馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)與再生技術(shù)研究進(jìn)展[C]//2017年中國(guó)馬鈴薯大會(huì). 畢節(jié)：中國(guó)作物協(xié)會(huì)馬鈴薯專業(yè)委員會(huì)，2017.

[49]Murashige T，Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures[J]. Physiologia Plantarum，1962，15（3）：473-497.

[50]Gamborg O L，Miller R A，Ojima K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells[J]. Experimental Cell Research，1968，50（1）：151-158.

[51]Kao K N，Michayluk M R. Nutritional requirements for growth of Vicia hajastana cells and protoplasts at a very low population density in liquid media[J]. Planta，1975，126（2）：105-110.

[52]Binding H，Nehls R. Regeneration of isolated protoplasts to plants in Solanum dulcamara L.[J]. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie，1977，85（3）：279-280.

[53]Hulme J S，Higgins E S，Shields R. An efficient genotype-independent method for regeneration of potato plants from leaf tissue[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1992，31（2）：161-167.

[54]Ovesna J，Burdova I，Krizkova L，et al. Modification of cultivar-specific regeneration capacity of potato expiants by phytohormones and by Agrobacterium oncogenes[J]. Biologia Plantarum，1993，35（2）：199-208.

[55]Carlberg I，Glimelius K，Eriksson T. Improved culture ability of potato protoplasts by use of activated charcoal[J]. Plant Cell Reports，1983，2（5）：223-225.

[56]劉慶昌，吳國(guó)良. 植物細(xì)胞組織培養(yǎng)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003.

[57]Butenko R，Kuchko A. Somatic hybridizations of S. tuberosum and S. chaciense by protoplast fusion[C]//Ferenvzy L，F(xiàn)arkas G L. Advance in protoplast research. Budapest：Akademiai Kiado Press，1980：293-300.

[58]Tiwari J K，Devi S，Ali N，et al. Progress in somatic hybridization research in potato during the past 40 years[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2017，132（2）：225-238.

[59]Puite K J，Roest S，Pijnacker L P. Somatic hybrid potato plants after electrofusion of diploid Solanum tuberosum and Solanum phureja[J]. Plant Cell Reports，1986，5（4）：262-265.

[60]王 清，黃惠英，李學(xué)才，等. 二倍體馬鈴薯體細(xì)胞電融合的研究[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，36（4）：394-399.

[61]Teruo I. Somatic cell fusion between diploid potato （Solanum tuberosum） lines using transformed antibiotic selection markers[J]. Plant Science，1995，112（2）：231-238.

[62]司懷軍，戴朝曦. 馬鈴薯種間體細(xì)胞雜種植株的細(xì)胞學(xué)觀察和過(guò)氧化物同工酶譜分析[J]. 中國(guó)馬鈴薯，1998，12（4）：195-199.

[63]Szczerbakowa A，Maciejewska U，Zimnoch-Guzowska E，et al. Somatic hybrids Solanum nigrum （+） S. tuberosum：morphological assessment and verification of hybridity[J]. Plant Cell Reports，2003，21（6）：577-584.

[64]李鳳云，蔡興奎，盛萬(wàn)民，等. 馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體融合創(chuàng)制抗晚疫病新種質(zhì)[C].//2016年中國(guó)馬鈴薯大會(huì). 張家口：中國(guó)作物學(xué)會(huì)馬鈴薯委員會(huì)，2016.

[65]李 朋，蔡興奎，陳 琳，等. 馬鈴薯體細(xì)胞雜種后代青枯病抗性鑒定及分子標(biāo)記檢測(cè)[J]. 中國(guó)馬鈴薯，2014，28（6）：321-327.

[66]Liu T，Yan Y，Cai X K，et al. Introgression of bacterial wilt resistance from Solanum melongena to S. tuberosum through asymmetric protoplast fusion[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2016，125（3）：433-443.

[67]Helgeson J P，Pohlman J D，Austin S，et al. Somatic hybrids between Solanum bulbocastanum and potato：a new source of resistance to late blight[J]. Theoretical and Applied Genetics，1998，96（6/7）：738-742.

[68]Rakosy-Tican E，Thieme R，Nachtigall M，et al. The recipient potato cultivar influences the genetic makeup of the somatic hybrids between five potato cultivars and one cloned accession of sexually incompatible species Solanum bulbocastanum Dun[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2015，122（2）：395-407.

[69]Tiwari J K，Saurabh S，Chandel P，et al. Analysis of genetic and epigenetic changes in potato somatic hybrids between Solanum tuberosum and S. etuberosum by AFLP and MSAP markers[J]. Agricultural Research，2015，4（4）：339-346.

[70]Chandel P，Tiwari J K，Ali N，et al. Interspecific potato somatic hybrids between Solanum tuberosum and S.cardiophyllum，potential sources of late blight resistance breeding[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2015，123（3）：579-589.

[71]Fock I I，Collonnier C，Purwito A，et al. Resistance to bacterial wilt in somatic hybrids between Solanum tuberosum and Solanum phureja[J]. Plant Science，2000，160（1）：165-176.

[72]蔡興奎，柳 俊，謝從華. 馬鈴薯栽培種與野生種葉肉細(xì)胞融合及體細(xì)胞雜種鑒定[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2004，31（5）：623-626.

[73]Tiwari J K，Chandel P，Singh B P，et al. Analysis of plastome and chondriome genome types in potato somatic hybrids from Solanum tuberosum×Solanum etuberosum[J]. Genome，2014，57（1）：29-35.

[74]Tiwari J K，Devi S，Chandel P，et al. Organelle genome analysis in somatic hybrids between Solanum tuberosum and S. pinnatisectum revealed diverse cytoplasm type in potato[J].Agricultural Research，2016，5（1）：22-28.

[75]Rakosy-Tican E，Aurori A. Green fluorescent protein （GFP） supports the selection based on callus vigorous growth in the somatic hybrids Solanum tuberosum L.+S. chacoense Bitt[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2015，37（10）：201.

[76]Luthra S K，Tiwari J K，Kumar V，et al. Evaluation of interspecific somatic hybrids of potato （Solanum tuberosum） and wild S.cardiophyllum for adaptability，tuber dry matter，keeping quality and late blight resistance[J]. Agriculture Research，2019，8（2）：158-164.

[77]Smyda-Dajmund P，S[DD（-1][HT6]'[DD）]liwka J，Wasilewicz-Flis I，et al. BC1 and F1 progeny from Solanum×michoacanum （+） S. tuberosum somatic hybrids，autofused 4× S. michoacanum and cultivated potato[J]. American Journal of Potato Research，2017，94（4）：323-333.

[78]Luthra S K，Tiwari J K，Lal M，et al. Breeding potential of potato somatic hybrids：evaluations for adaptability，tuber traits，late blight resistance，keeping quality and backcross（BC1）progenies[J]. Potato Research，2016，59（4）：375-391.

[79]Jadari R，Sihachakr D，Rossignol L，et al. Transfer of resistance to Verticillium dahliae Kleb. from Solanum torvum S.W. into potato （Solanum tuberosum L.） by protoplast electrofusion[J]. Euphytica，1992，64（1/2）：39-47.

[80]Austin S，Pohlman J D，Brown C R，et al. Interspecific somatic hybridization between Solanum tuberosum L. and S. bulbocastanum Dun. as a means of transferring nematode resistance[J]. American Potato Journal，1993，70（6）：485-495.

[81]Mcgrath J M，Christie E W，Geraldine T H，et al. Introgression and stabilization of erwinia tuber soft rot resistance into potato after somatic hybridization of Solanum tuberosum and S. brevidens[J]. American Journal of Potato Research，2002，79（1）：19-24.

[82]Ahn Y K，Park T H. Resistance to common scab developed by somatic hybrids between Solanum brevidens and Solanum tuberosum[J]. Acta Agriculturae Scandinavica，2013，63（7）：595-603.

[83]Guo X P，Xie C H，Cai X K，et al. Meiotic behavior of pollen mother cells in relation to ploidy level of somatic hybrids between Solanum tuberosum and S. chacoense[J]. Plant Cell Reports，2010，29（11）：1277-1285.

[84]Laurila J，Metzler M C，Ishimaru C A，et al. Infection of plant material derived from Solanum acaule with Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus：temperature as a determining factor in immunity of S.acaule to bacterial ring rot[J]. Plant Pathology，2003，52（4）：496-504.

[85]Yu Y，Ye W，He L，et al. Introgression of bacterial wilt resistance from eggplant to potato via protoplast fusion and genome components of the hybrids[J]. Plant Cell Reports，2013，32（11）：1687-1701.

[86]Rokka V M V J. Characterization of haploids derived from somatic hybrids between Solanum brevidens，S. Tuberosum through anther culture[J]. Plant Science，1995，112（1）：85-95.

[87]Gillen A M，Richard G N. Molecular characterization of the progeny of Solanum etuberosum identifies a genomic region associated with resistance to potato leafroll virus[J]. Euphytica，2007，155（3）：403-415.

[88]Nouri-Ellouz O，Gargouri-Bouzid R，Sihachakr D，et al. Production of potato intraspecific somatic hybrids with improved tolerance to PVY and Pythium aphanidermatum[J]. Journal of Plant Physiology，2006，163（12）：1321-1332.

[89]Nouri-Ellouz O，Mohamed A T，Jbir-Koubaa R，et al. Somatic hybrids between potato and S. berthaultii show partial resistance to soil-borne fungi and potato virus Y[J]. Journal of Phytopathology，2016，164（7/8）：485-496.

[90]Novy R G，Nasruddin A，Ragsdale D W，et al. Genetic resistances to potato leafroll virus，potato virus Y，and green peach aphid in progeny of Solanum etuberosum[J]. American Journal of Potato Research，2002，79（1）：9-18.

[91]Thieme R，Rakosy-Tican E，Nachtigall M，et al. Characterization of the multiple resistance traits of somatic hybrids between Solanum cardiophyllum L. and two commercial potato cultivars[J]. Plant Cell Reports，2010，29（10）：1187-1201.

[92]Jeffrey A D，Radcliffe E B，Christian A T，et al. Resistance to aphids，late blight and viruses in somatic fusions and crosses of Solanum tuberosum L. and Solanum bulbocastanum Dun[J]. American Journal of Potato Research，2012，89（6）：489-500.

[93]Cooper-Bland S，de Maine J，F(xiàn)leming M L M H，et al. Synthesis of intraspecific somatic hybrids of Solanum tuberosum：assessments of morphological，biochemical and nematode （Globodera pallida） resistance characteristics[J]. Journal of Experimental Botany，1994，45（9）：1319-1325.

[94]Chen H H，Li P H. Characteristics of cold acclimation and deacclimation in tuber-bearing Solanum species[J]. Plant Physiology，1980，65（6）：1146-1148.

[95]Cardi T，DAmbrosio E，Consoli D，et al. Production of somatic hybrids between frost-tolerant Solanum commersonii and S. tuberosum：characterization of hybrid plants[J]. Theoretical and Applied Genetics，1993，87（1/2）：193-200.

[96]Nyman M，Waara S. Characterisation of somatic hybrids between Solanum tuberosum and its frost-tolerant relative Solanum commersonil[J]. Theoretical and Applied Genetics，1997，95（7）：1127-1132.

[97]Perl A，Aviv D，Galun E. Protoplast-fusion-derived CMS potato cybrids：potential seed-parents for hybrid，true-potato-seeds[J]. Journal of Heredity，1990，81（6）：438-442.

[98]Trabelsi S，Gargouri-Bouzid R，Vedel F，et al. Somatic hybrids between potato Solanum tuberosum and wild species Solanum verne exhibit a recombination in the plastome[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2005，83：1-11.

[99]Bidani A，Nouri-Ellouz O，Lakhoua L，et al. Interspecific potato somatic hybrids between Solanum berthaultii and Solanum tuberosum L. showed recombinant plastome and improved tolerance to salinity[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2007，91（3）：179-189. [ZK）]

[100]Jbir-Koubaa R，Safa C，Ellouz W，et al. Investigation of the response to salinity and to oxidative stress of interspecific potato somatic hybrids grown in a greenhouse[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2015，120（3）：933-947.

[101]任春梅，楊柳，繆 倩，等. 小麥黃花葉病毒單克隆抗體的制備及ACP-ELISA檢測(cè)方法的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，34（1）：34-40.

[102]李秀根，陳愛(ài)地，王六發(fā)，等. 空間電融合的煙草原生質(zhì)體再生植株分析[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2007，33（5）：361-368.

[103]康 黎，彭曉君，陳 琳，等. 馬鈴薯抗寒種質(zhì)資源分類及其利用[J]. 中國(guó)馬鈴薯，2019，33（1）：43-50.

[104]FAOSTAT. FAO statistical databases[DS]. http：//faost at.fao.org/site/567/defau lt.aspxancor.

[105]Simelton E，F(xiàn)raser E G，Mette T，et al. The socioeconomics of food crop production and climate change vulnerability：a global scale quantitative analysis of how grain crops are sensitive to drought[J]. Food Security，2012，4（2）：163-179.

[106]Beddington J. Food security：contributions from science to a new and greener revolution[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society of London：Series B Biological Sciences，2010，365：61-71.