軟骨細(xì)胞去分化的分子機制的研究進(jìn)展

林陽洋

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院整形七科，北京市 100000，電子郵箱：183139934@qq.com)

【提要】 軟骨組織工程的發(fā)展為整形外科耳再造、鼻整形及骨科關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)等提供了新的思路。但是體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞出現(xiàn)去分化現(xiàn)象極大地限制了該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。多種機制參與軟骨細(xì)胞去分化過程，包括表觀遺傳學(xué)及相關(guān)基因通路等。本文就軟骨細(xì)胞去分化及其相關(guān)分子機制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

耳整形、鼻整形及關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)中的軟骨來源一直是再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的難題，軟骨組織工程的發(fā)展為解決這一難題提供了新思路，使軟骨組織的替代修復(fù)成為可能。然而，軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)中的去分化現(xiàn)象是限制這一技術(shù)發(fā)展的瓶頸。深入了解軟骨細(xì)胞去分化的機制，尋找干預(yù)細(xì)胞去分化的基因靶點，促進(jìn)去分化軟骨細(xì)胞再分化，是軟骨組織工程的研究熱點和難點。本文就軟骨細(xì)胞去分化及其相關(guān)分子機制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 軟骨細(xì)胞去分化程度的標(biāo)志物

體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞存在去分化現(xiàn)象，即隨著傳代次數(shù)及培養(yǎng)時間的增加，軟骨細(xì)胞失去原有表型，由多角形或圓形向成纖維細(xì)胞樣梭形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞基因表達(dá)譜也發(fā)生變化，如Ⅱ型膠原(collagen type Ⅱ，ColⅡ)、軟骨特異性蛋白多糖核心蛋白和Y染色體性別決定結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(Sox-9)基因表達(dá)下降，Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ，ColⅠ)基因表達(dá)增加[1]。因此，既往把這些分子作為軟骨細(xì)胞去分化程度的標(biāo)志物。

近年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些新的分子指標(biāo)也可以描述軟骨細(xì)胞去分化狀態(tài)。其中，Shin等[2]認(rèn)為每個傳代細(xì)胞的運動距離可以作為去分化程度的判斷指標(biāo)。Runx3基因單個CpG位點的甲基化用于體外鑒定軟骨細(xì)胞的去分化階段，可更好地描述軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的階段[3]。表面抗原CD63和CD166可以用于描述再分化過程[4]。S100A1和S100B蛋白屬于高酸性鈣結(jié)合蛋白S100蛋白家族成員，與軟骨細(xì)胞表型有關(guān)，是軟骨形成能力的標(biāo)志物[5]。應(yīng)用基于細(xì)胞的酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測上述S100A1和S100B蛋白可準(zhǔn)確地判斷軟骨細(xì)胞的分化狀態(tài)，識別軟骨源性刺激，并可同時監(jiān)測不良肥大表型[6]。上述研究結(jié)果豐富了軟骨細(xì)胞去分化程度的標(biāo)志物的類型。

2 軟骨細(xì)胞去分化的表觀遺傳學(xué)

2.1 甲基化與軟骨細(xì)胞去分化的關(guān)系 近年來，DNA甲基化與軟骨細(xì)胞去分化的關(guān)系引起了廣泛關(guān)注。研究DNA甲基化的第一步是評估甲基化水平。亞硫酸氫鹽基因組測序是目前應(yīng)用最廣泛的DNA甲基化分析技術(shù)，但是亞硫酸氫鹽的轉(zhuǎn)化會導(dǎo)致DNA降解，相關(guān)實驗必須消耗大量的軟骨細(xì)胞樣品。Jia等[7]采用斑點雜交法測定不同傳代次數(shù)的軟骨細(xì)胞5-甲基胞嘧啶的含量，確定了去分化狀態(tài)與5-甲基胞嘧啶水平之間的關(guān)系。雖然該方法不能精確定量DNA甲基化水平或確定特定DNA序列的CpG甲基化狀態(tài)，但也是一種可靠、簡單、快速檢測DNA甲基化水平的方法，可以避免大量消耗軟骨細(xì)胞樣本。

軟骨細(xì)胞單層培養(yǎng)容易發(fā)生去分化改變，細(xì)胞的甲基化水平也相應(yīng)地發(fā)生不同程度的變化。用DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷(5-aza cytidine,5-AzaC)處理，可降低總體甲基化水平，減慢軟骨細(xì)胞去分化，有助于維持細(xì)胞表型，因此，調(diào)節(jié)甲基化水平可能是一種對抗軟骨細(xì)胞去分化的有效策略[8]。通路富集分析結(jié)果顯示，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)通路參與了單層培養(yǎng)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞去分化；PI3K分別通過Akt和p70S6激酶的下游信號誘導(dǎo)細(xì)胞存活和蛋白合成，采用5-AzaC處理可降低PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因的總體DNA甲基化水平[8]。此外，細(xì)胞松弛素D可破壞肌動蛋白細(xì)胞骨架，激活PI3K/Akt和p38激酶，從而逆轉(zhuǎn)小檗堿誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞去分化[9]。改善軟骨細(xì)胞在傳代培養(yǎng)中的形態(tài)(主要是細(xì)胞骨架的變化)與維持軟骨細(xì)胞表型密切相關(guān)[10-11]。此外，在5-AzaC處理后Sox-9表達(dá)上調(diào)，ColⅡa1基因的甲基化水平和表達(dá)水平?jīng)]有變化，而ColⅠa1的甲基化水平升高，ColⅠa1啟動子活性和mRNA表達(dá)水平持續(xù)下降，提示Sox-9的DNA甲基化可能是調(diào)節(jié)Sox-9表達(dá)水平的關(guān)鍵因素，提高ColⅠa1啟動子的甲基化水平可能可以減緩軟骨細(xì)胞的去分化，因此，位點特異性啟動子甲基化或去甲基化必須得到優(yōu)化[8]。上述研究提示甲基化、PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞骨架變化和軟骨細(xì)胞去分化過程中相互影響，共同促進(jìn)軟骨細(xì)胞去分化改變，但甲基化與細(xì)胞骨架變化之間的關(guān)系，仍有待進(jìn)一步研究探討。

2.2 微小RNA與軟骨細(xì)胞去分化的關(guān)系 軟骨細(xì)胞去分化時，微小RNA(microRNA，miRNA)在調(diào)節(jié)基因表達(dá)上起著重要作用，其中miRNA-138高度保守，可參與細(xì)胞凋亡、脂肪細(xì)胞分化和成骨過程。研究顯示，miRNA-138在完整軟骨中維持相對較低的表達(dá)水平，但在軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程中，隨著細(xì)胞表型差異的逐步消失，miRNA-138成為表達(dá)水平上調(diào)最明顯的miRNA之一； miRNA-138可直接靶向作用于Sp-1和缺氧誘導(dǎo)因子2a，抑制ColⅡa1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其中Sp-1可與ColⅡa1啟動子區(qū)域結(jié)合以促進(jìn)ColⅡa1的表達(dá)，缺氧誘導(dǎo)因子2a可與軟骨主要調(diào)節(jié)基因Sox-9的啟動子/增強子元件結(jié)合，是介導(dǎo)軟骨細(xì)胞特異性基因低氧誘導(dǎo)表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子；此外，miRNA-138在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞表型中具有關(guān)鍵的去分化作用，抑制miRNA-138表達(dá)有利于維持軟骨穩(wěn)態(tài)[12]。miRNA-138還間接影響miRNA-140和miRNA-675-5′表達(dá)水平，從而影響軟骨細(xì)胞的表型變化。miRNA-675-5′可調(diào)控ColⅡa1的表達(dá)，而miRNA-140可通過抑制ADAMTS-5(一種聚蛋白多糖酶)的表達(dá)來維持軟骨內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。由于這兩種miRNA的表達(dá)都依賴于Sox-9，所以這兩種miRNA很可能是由miRNA-138通過靶向缺氧誘導(dǎo)因子2a來調(diào)節(jié)的，而缺氧誘導(dǎo)因子2a反過來與Sox-9結(jié)合并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄[13]。此外，有研究顯示miRNA-29b在去分化軟骨細(xì)胞中呈過表達(dá)，可選擇性靶向抑制ColⅡa1，導(dǎo)致與異常軟骨細(xì)胞表型相關(guān)的膠原失衡[14]。因此，miRNA和轉(zhuǎn)錄因子之間復(fù)雜的相互作用是調(diào)節(jié)組織特異性基因表達(dá)的核心。表觀遺傳圖譜和生物信息學(xué)分析可能是識別區(qū)域特異性DNA甲基化的有力策略，而這對維持軟骨細(xì)胞表型至關(guān)重要。

3 參與軟骨去分化的基因和通路

3.1 轉(zhuǎn)化生長因子β家族 軟骨細(xì)胞活動受轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β家族的調(diào)節(jié)，家族成員包括TGF-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)等。

3.1.1 TGF-β：TGF-β是軟骨細(xì)胞分子和生理特征的主要調(diào)節(jié)因素，有3種亞型，其中TGF-β1在軟骨細(xì)胞中的研究最為廣泛。TGF-β1信號通路中，兩個Ⅰ型受體[激活素受體激酶(activin receptor-like kinase，ALK)]和兩個Ⅱ型受體(TβR-Ⅱ)組成四聚體復(fù)合物，當(dāng)二聚TGF-β分子結(jié)合到這個四聚體復(fù)合物時，ALK被TβR-Ⅱ磷酸化，可進(jìn)一步誘導(dǎo)Smad2/3的磷酸化[15]。通過慢病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)去分化軟骨細(xì)胞Klf4的表達(dá)，可以激活A(yù)LK和TβR-Ⅱ，促進(jìn)馬軟骨細(xì)胞的增殖和成軟骨分化[6]。

TGF-β1可促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成，抑制金屬蛋白酶的活性，有助于維持軟骨細(xì)胞的特征[16]。TGF-β1可通過β-連環(huán)蛋白通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，并通過激活Sox9、Smad3及Smad2和Smad4的復(fù)合物來促進(jìn)ColⅡ合成，保持軟骨細(xì)胞表型，Smad2/3信號通路也與體外培養(yǎng)過程中軟骨細(xì)胞的成熟和肥大有關(guān)[17]。缺乏Smad3的突變小鼠可出現(xiàn)軟骨退行性疾病，而TGF-β1不足的小鼠可出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎[1]。神經(jīng)白細(xì)胞介素(interleukin,IL)及其受體共同上調(diào)磷酸化Akt和磷酸化Smad2/3并下調(diào)磷酸化Smad1/5，通過多種途徑協(xié)同促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和維持軟骨細(xì)胞表型[17]。紅景天甙等一些中藥成分也可提高TGF、Smad3和軟骨特定基因的表達(dá)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和基質(zhì)合成，下調(diào)ColⅠ表達(dá)[18]。

抑制TGF-β1表達(dá)可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞衰老和去分化。氨基酰轉(zhuǎn)運RNA合成酶復(fù)合酶相互作用多功能蛋白質(zhì)1(aminoacyl-tRNA synthetase-interacting multi-functional protein 1,AIMP1)是TGF-β信號負(fù)反饋循環(huán)中的成分之一，AIMP1的胞內(nèi)定位可能與維持軟骨細(xì)胞特性的信號傳導(dǎo)有關(guān)，其過表達(dá)可在胞質(zhì)抑制TGF-β介導(dǎo)的Smad2/3磷酸化和核轉(zhuǎn)移[17]。綜合應(yīng)用AIMP1小干擾RNA 和TGF-β可明顯地增加胞核Smad2/3信號的磷酸化水平，促進(jìn)體內(nèi)軟骨形成，減輕細(xì)胞肥大化[19]。細(xì)胞遷移誘導(dǎo)和透明蛋白(cell migration-inducing and hyaluronan-binding protein,CEMIP)在去分化軟骨細(xì)胞中呈高表達(dá)，可降低TGF-β的表達(dá)水平，誘導(dǎo)纖維化樣過程[20]。CEMIP可改變軟骨細(xì)胞的膠原表達(dá)譜(高表達(dá)CEMIP的軟骨細(xì)胞，其Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)增高，而Ⅱ、Ⅵ、Ⅸ和Ⅺ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)降低)，表明CEMIP可以促使軟骨細(xì)胞表型向成纖維細(xì)胞樣表型轉(zhuǎn)換，促進(jìn)軟骨細(xì)胞去分化[18]。CEMIP可調(diào)節(jié)編碼PAI-1的SERPINE1基因，而PAI-1是TGF-β信號中的磷酸化Smad2/3通路的下游調(diào)節(jié)因子，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化；此外CEMIP缺失還可誘導(dǎo)周蛋白合成和分泌降低，在骨關(guān)節(jié)炎中，周蛋白可強化炎癥反應(yīng)并增加金屬蛋白酶產(chǎn)生[21]。

3.1.2 BMP：BMP信號通路也是軟骨形成的重要調(diào)控和誘導(dǎo)因子。與TGF-β1相似，BMP-2可通過復(fù)雜的下游信號傳導(dǎo)機制激活目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)前列腺素合成，修復(fù)受損的軟骨；BMP-2可激活BMP受體1A(或ALK3)、BMP受體1B(或ALK6)和各種Smad通路，對維持軟骨細(xì)胞形態(tài)和生長發(fā)育至關(guān)重要；BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9和BMP-13也有助于維持軟骨細(xì)胞的分化狀態(tài)，并在體外實驗中誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨形成[1]。BMP-2/BMP-4的同源物已經(jīng)在軟體動物的殼中得到鑒定，其中一種蛋白具有egf樣結(jié)構(gòu)域，因此推測軟體動物殼來源的一種或多種蛋白具有類似BMP的功能[22]。從大菱角扇貝殼中提取的水溶性基質(zhì)存在BMP樣效應(yīng)，可以增加聚蛋白多糖和ColⅡ的表達(dá)，但不提高ColⅠ的表達(dá)[22]。與BMP結(jié)構(gòu)相似，激活素也是TGF-β超家族的成員。激活素A對其Ⅱ型受體表現(xiàn)出很高的親和力，可激活Smad2/3轉(zhuǎn)錄因子，而BMP-2對這些受體的親和力較低，但對其Ⅰ型受體的親和力較高，可激活Smad1/5/8轉(zhuǎn)錄因子[23]。有研究通過部分嵌合體和異構(gòu)體的隨機組合(random assembly of segmental chimera and heteromers，RASCH)構(gòu)建了一系列BMP-2和激活素A序列的系統(tǒng)交換嵌合配體，其中AB235嵌合配體可以明顯地促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化[24]，并誘導(dǎo)去分化的軟骨細(xì)胞再分化，效果優(yōu)于單獨使用BMP-2[25]。通過開發(fā)新型TGF-β嵌合配體獲得的RASCH策略有助于擴(kuò)展TGF-β超家族配體功能庫，充分開發(fā)TGF-β超家族的多種生物作用[26]。然而，由于各研究所使用的模型系統(tǒng)和培養(yǎng)條件不同，關(guān)于BMP的相對效力仍存在爭議。

總之，TGF-β家族成員是軟骨細(xì)胞去分化過程中的重要成分。軟骨中的信號傳導(dǎo)既依賴于Smad通路，也可不依賴于Smad而發(fā)揮作用。然而，老化細(xì)胞如何影響細(xì)胞環(huán)境，如何調(diào)節(jié)TGF-β和BMP軟骨信號，目前仍未完全闡明。Tseng等[27]采用低劑量的堿性成纖維生長因子實現(xiàn)了500倍以上的耳郭軟骨細(xì)胞擴(kuò)增(在第3代培養(yǎng)時)，但是ColⅡ的表達(dá)下降，產(chǎn)生去分化現(xiàn)象；在三維培養(yǎng)中聯(lián)合應(yīng)用BMP-2與堿性成纖維生長因子可顯著提高ColⅡ和聚蛋白多糖的表達(dá)，而在單層培養(yǎng)時其對ColⅡ和聚蛋白多糖則沒有影響。因此，進(jìn)一步研究TGF-β超家族成員在軟骨細(xì)胞去分化中的分子機制有助于了解軟骨細(xì)胞去分化的進(jìn)展。

3.2 Wnt信號通路 Wnt是軟骨發(fā)育、間充質(zhì)細(xì)胞軟骨分化、軟骨細(xì)胞增殖成熟和軟骨分解代謝的重要通路?！敖?jīng)典”和“非經(jīng)典”Wnt通路的交聯(lián)和協(xié)同作用為理解這些通路在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞表型中的作用和復(fù)雜性提供更多的方向。

3.2.1 經(jīng)典的Wnt信號通路：經(jīng)典的Wnt信號通路中，Wnt蛋白與卷曲蛋白-低密度脂蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合受體5/6受體復(fù)合物結(jié)合，磷酸化激活胞質(zhì)內(nèi)散亂蛋白，散亂蛋白能切斷β-連環(huán)蛋白降解途徑，使降解復(fù)合體糖原合酶激酶-3β、軸蛋白、結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白、酪蛋白激酶1解散，β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中積累而進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴樣增強因子相互作用，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)[11]。經(jīng)典Wnt信號通路對軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)取決于培養(yǎng)環(huán)境和Rho的活性。?ztürk等[11]研究了RhoA和經(jīng)典Wnt信號通路交聯(lián)在軟骨細(xì)胞表型中的作用，結(jié)果顯示，在Rho激活的狀態(tài)下，使用氯化鋰激活Wnt信號通路可導(dǎo)致ColⅡ表達(dá)降低，聚蛋白多糖減少，而在Rho未激活的狀態(tài)下，氯化鋰則可引起軟骨細(xì)胞再分化。

RhoA是研究最廣泛的Rho鳥苷三磷酸酶，可調(diào)節(jié)大量的細(xì)胞過程，其亞細(xì)胞定位是調(diào)節(jié)不同信號通路的重要因素[28]。軟骨細(xì)胞去分化伴有RhoA的表達(dá)上調(diào)和核轉(zhuǎn)移，抑制Rho通路可以抑制RhoA核轉(zhuǎn)移，發(fā)生軟骨基質(zhì)積累[11]。這種核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象可能參與心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其血清應(yīng)答因子誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞去分化標(biāo)志物上調(diào)，也可能參與心肌蛋白介導(dǎo)的Sox-9活性抑制和軟骨基因表達(dá)下降。在Rho鳥苷三磷酸酶的支配下，β-連環(huán)蛋白、Yes 相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)及含有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ)受細(xì)胞外基質(zhì)動力學(xué)和細(xì)胞形狀調(diào)節(jié)，是軟骨細(xì)胞力學(xué)信號的重要傳遞者；在Rho影響下，YAP/TAZ受到機械刺激而發(fā)生核轉(zhuǎn)移，進(jìn)而抑制軟骨形成[11]。心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其血清應(yīng)答因子通路可以與YAP/TAZ共同作用，激活Rho介導(dǎo)的CTGF、ANKRD1等靶基因的轉(zhuǎn)錄[29]。在軟骨細(xì)胞去分化的過程中，RhoA核轉(zhuǎn)移與經(jīng)典的Wnt信號通路正常、β-連環(huán)蛋白累積以依賴于Rho的模式伴隨發(fā)生。值得注意的是，隨著軟骨細(xì)胞去分化、RhoA核轉(zhuǎn)移以及β-連環(huán)蛋白激活，軸蛋白2表達(dá)顯著降低，并出現(xiàn)核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，這提示軸蛋白2的表達(dá)可能受軸蛋白2自身核轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)[11]。軸蛋白2基因是β-連環(huán)蛋白/T細(xì)胞因子/淋巴樣增強因子復(fù)合體的靶基因，可以增強TGF-β信號，介導(dǎo)TGF-β和Wnt/β-連環(huán)蛋白之間的交聯(lián)[30]。敲除軸蛋白2基因的小鼠軟骨細(xì)胞ColⅡ表達(dá)降低，ColⅩ表達(dá)增高，并出現(xiàn)軟骨細(xì)胞肥大化現(xiàn)象[31]。對這種交聯(lián)和協(xié)同作用的研究將為理解這些通路在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞表型中的作用和復(fù)雜性開辟更多的方向。

上述研究結(jié)果提示，不同環(huán)境中軟骨細(xì)胞去分化存在差異性，未來的研究需要更深入地了解RhoA核轉(zhuǎn)移和經(jīng)典Wnt信號通路效應(yīng)物激活的機制，以及不同環(huán)境背景下，RhoA核轉(zhuǎn)移和經(jīng)典Wnt信號通路在軟骨細(xì)胞標(biāo)志物丟失中的作用。

3.2.2 非經(jīng)典的Wnt信號通路：與上述經(jīng)典的Wnt信號通路機制不同，非經(jīng)典的Wnt信號通路可激活卷曲蛋白6/散亂蛋白2/多配體蛋白聚糖4(Syndecan 4，SYND4)/鈣離子鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱα(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱα，CaMKⅡα)/B亞型Raf激酶(B-Raf)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)1/2級聯(lián)而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞去分化[32]。Wnt-3a是Wnt信號通路的重要激活蛋白[33]，在Wnt-3a的影響下，卷曲蛋白6觸發(fā)CaMKⅡα與SYND4、B-Raf及散亂蛋白2的對接，導(dǎo)致體內(nèi)外B-raf被CaMKⅡα磷酸化，激活ERK1/2，從而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞去分化[32]。該研究表明非經(jīng)典Wnt信號通路通過激活ERK1/2導(dǎo)致軟骨表型丟失，提示CaMKⅡα和B-Raf在軟骨細(xì)胞去分化中具有直接關(guān)系，通過激活CaMKⅡα的B-Raf/ERK1/2通路，卷曲蛋白6可介導(dǎo)Wnt-3a所致的軟骨表型丟失。新發(fā)現(xiàn)的軟骨表型調(diào)節(jié)因子卷曲蛋白6、SYND4和B-Raf或可作為對抗去分化的潛在靶點。

3.3 IL-1β IL-1β可抑制軟骨細(xì)胞增殖，誘發(fā)去分化[16]。IL-4、白藜蘆醇、黃芩苷等可以減輕IL-1β造成的去分化，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，增加軟骨細(xì)胞的合成[34]。傳代培養(yǎng)的去分化軟骨細(xì)胞中，IL-1β水平升高，IL-1β可刺激B-Raf，促進(jìn)絲裂原活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(mitogen-activated extracellular signal regulated kinase,MEK)1/2和ERK1/2磷酸化并抑制軟骨細(xì)胞的增殖，但無法促進(jìn)Sox-9和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)；通過MEK1/2 和 ERK1/2通路，IL-1β可以激活蛋白聚糖酶分解聚蛋白多糖[1]。IL-1β還可激活蛋白聚糖酶，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的去分化過程[35]。在IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中，USP14去泛素化酶上調(diào)，這種上調(diào)過程依賴于核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)通路的激活，且反過來進(jìn)一步激活NF-κB通路，從功能上加劇IL-1β對軟骨細(xì)胞去分化的影響；NF-κB未激活時在胞質(zhì)中和NF-κB抑制蛋白相結(jié)合，被IL-1β等各種化學(xué)和機械信號激活后，NF-κB抑制蛋白激酶可磷酸化NF-κB抑制蛋白α，致其通過泛素蛋白酶系統(tǒng)降解，致使NF-κB轉(zhuǎn)移入核并導(dǎo)致一系列細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶等因子變化，參與骨關(guān)節(jié)炎病理過程；USP14可促進(jìn)上述NF-κB抑制蛋白α的去泛素化過程，加速了蛋白酶對其降解，抑制NF-κB則可以顯著逆轉(zhuǎn)這種去分化過程[36]。這一發(fā)現(xiàn)揭示了IL-1β或可通過影響USP14而改變NF-κB來對抗去分化。Varela-Eirín等[37]發(fā)現(xiàn)了一個連接蛋白43敏感循環(huán)，其可通過促進(jìn)Twist-1的核轉(zhuǎn)移導(dǎo)致軟骨細(xì)胞去分化，還可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞老化以及相關(guān)的p53/p16高表達(dá)、NF-κB核轉(zhuǎn)移，抑制連接蛋白43表達(dá)或阻斷縫隙連接通訊功能可以逆轉(zhuǎn)去分化過程，提高ColⅡa1的合成，揭示了一個軟骨細(xì)胞去分化調(diào)節(jié)的新模式，IL-1β可能是這一連接蛋白43循環(huán)的反饋促進(jìn)因子。

3.4 p38絲裂原活化蛋白激酶 p38是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的重要成員，可通過代謝改變和基質(zhì)降解來改變軟骨細(xì)胞的表型[38]。ERK和JNK是調(diào)節(jié)p38 MAPK的兩個上游信號因子。單層培養(yǎng)中抑制p38 MAPK可導(dǎo)致ColⅡ表達(dá)上調(diào)，ColⅠ表達(dá)下調(diào)[1]。哺乳動物的沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶類(sirtuins，SIRT)具有NAD+依賴性脫乙酰酶和ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，對α糖微管蛋白、組蛋白和叉頭蛋白等多種細(xì)胞骨架蛋白發(fā)揮去乙酰化作用。人類Sirtuin家族中公認(rèn)的成員有7個：SIRT1～SIRT7。Eo等[17]使用PEP-1多肽攜帶的SIRT2作用于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)環(huán)氧合酶2和前列腺素E2等炎性指標(biāo)升高；SIRT2可通過ERK通路增強軟骨細(xì)胞去分化，通過ERK和p38通路促進(jìn)炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步研究提示SIRT2磷酸化可激活ERK通路，促進(jìn)金屬蛋白酶1和金屬蛋白酶13表達(dá)[39]。谷氧還蛋白1(glutaredoxin 1，GRX-1)屬于氧化還原酶家族，是內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的組成部分。GRX-1可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴性ERK-1/2通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴性p38激酶通路和PI-3激酶通路誘導(dǎo)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞去分化[40]。GRX-1增加了Akt、ERK1/2和p38的磷酸化，軟骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)力相關(guān)蛋白GRP78和GRP94升高。然而，由于體外分析的局限性，軟骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激受GRX-1調(diào)控的確切機制尚不清楚。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡抑制因子1在去分化軟骨細(xì)胞中激活ERK-1/2，使p38激酶失活，通過抑制ColⅡ的表達(dá)和硫酸蛋白多糖的合成而導(dǎo)致去分化。MEK抑制劑消除凋亡抑制因子1誘導(dǎo)的ERK磷酸化，同時阻止凋亡抑制因子1誘導(dǎo)的ColⅡ表達(dá)的丟失[41]。此外，Ashraf等[42]還發(fā)現(xiàn)在大腦中富集的Ras同源基因可通過調(diào)節(jié)衰老、去分化和氧化應(yīng)激來維持軟骨細(xì)胞的固有特性，其機制可能與p38 MAPK有關(guān)。這些信息有助于了解軟骨細(xì)胞去分化的分子機制，幫助設(shè)計更多的對抗去分化的新方法。

4 其他方面

除了上述基因方面外，支架材料、形態(tài)、黏附錨定等與軟骨細(xì)胞去分化的關(guān)系研究也取得了很多新進(jìn)展，軟骨細(xì)胞在去分化過程中的形態(tài)和黏附[43]改變也與其表型密切相關(guān)。一些新型支架材料可以通過改變軟骨細(xì)胞去分化過程中的形態(tài)變化[44]和黏附錨定方式[45-46]來改變軟骨細(xì)胞去分化表型。新型DNA納米材料DNA四面體結(jié)構(gòu)納米材料可通過調(diào)節(jié)微管和Notch信號通路來調(diào)控細(xì)胞功能[47]。代謝方面，軟骨細(xì)胞天然生活在缺乏血供的環(huán)境中，能很好地適應(yīng)低氧張力，線粒體質(zhì)量和氧需求較低，因此谷氨酰氨轉(zhuǎn)氨酶2的下調(diào)可通過促進(jìn)葡萄糖代謝，參與去分化軟骨細(xì)胞的再分化[48]。新型藥物方面，眼鏡蛇神經(jīng)肽[49]、原兒茶酸[50]、龍眼多糖[51]能有效地促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，維持人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表型。培養(yǎng)條件方面，通過改變溫度[52]和培養(yǎng)密度[53]，軟骨細(xì)胞能更好地維持軟骨表型。Rakic等[13]綜合應(yīng)用多種方法模擬軟骨微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)三維缺氧細(xì)胞培養(yǎng)、BMP-2和RNA干擾聯(lián)合作用，可使去分化的軟骨細(xì)胞有效再分化。

5 小 結(jié)

目前軟骨細(xì)胞去分化機制在各個方面的研究進(jìn)一步深入，軟骨細(xì)胞去分化標(biāo)志物的進(jìn)一步豐富，有助于我們從多角度、多層面理解和測定軟骨細(xì)胞去分化的狀態(tài)。甲基化[8]、乙?；痆17]等表觀遺傳學(xué)改變在軟骨細(xì)胞去分化中的作用被進(jìn)一步挖掘，抑制DNA甲基化是維持軟骨細(xì)胞表型的新方法，位點特異性啟動子甲基化或去甲基化必須得到優(yōu)化。表觀遺傳分析和生物信息學(xué)分析[8]是識別軟骨細(xì)胞去分化區(qū)域特異性DNA甲基化的有力策略。對經(jīng)典Wnt信號通路和Rho信號的交聯(lián)研究有助于進(jìn)一步明確軟骨細(xì)胞的骨架變化與去分化之間的關(guān)系。此外，非經(jīng)典的Wnt信號在軟骨細(xì)胞去分化中的作用得到挖掘并逐漸受到重視，更加豐富了Wnt信號通路在軟骨細(xì)胞去分化機制中的作用。IL-1β、p38 MAPK等是傳統(tǒng)的軟骨細(xì)胞去分化促進(jìn)因子，在關(guān)節(jié)炎等軟骨炎癥或傳代培養(yǎng)中嚴(yán)重影響軟骨細(xì)胞表型的維持，USP14前饋、連接蛋白43循環(huán)等有助于揭示促進(jìn)去分化的回路，以及進(jìn)一步理解軟骨細(xì)胞去分化的促進(jìn)過程，從而找到新的去分化機制以及對抗去分化的作用靶點。