補(bǔ)體激活與自噬在年齡相關(guān)性黃斑變性中的研究進(jìn)展

劉雨露，徐新榮

0引言

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)通常也稱為老年性黃斑變性，是導(dǎo)致全世界老年人視力減退甚至喪失的最主要原因之一[1]，目前全世界成年人的患病率大約在3%左右，預(yù)估到2040年將會(huì)影響全球近2.88億人[2]。ARMD可分為干性和濕性兩種，與濕性ARMD相比，干性ARMD的發(fā)病機(jī)制更為復(fù)雜，其形成與脂質(zhì)代謝和運(yùn)輸調(diào)節(jié)、細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)、細(xì)胞粘附、細(xì)胞毒性、細(xì)胞死亡和血管生成有關(guān)，特別是與炎癥密切相關(guān)，而補(bǔ)體系統(tǒng)異常激活容易引起免疫炎癥。近年研究表明，自噬功能異常與干性ARMD的發(fā)展也密不可分。補(bǔ)體激活與自噬失調(diào)相互影響，加速視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)ARMD的發(fā)生、發(fā)展。本文就補(bǔ)體激活與自噬過(guò)程在ARMD發(fā)展中的作用作一綜述。

1補(bǔ)體激活及自噬的概念

1.1補(bǔ)體系統(tǒng)及補(bǔ)體激活補(bǔ)體是存在于人和動(dòng)物的體液中以及細(xì)胞表面，經(jīng)活化后具有生物活性，能夠介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)的蛋白，也稱為補(bǔ)體系統(tǒng)，包括30余種可溶性蛋白和膜結(jié)合蛋白。補(bǔ)體系統(tǒng)幾乎參與了機(jī)體中所發(fā)生的特異性及非特異性免疫機(jī)制。它在防御病原、清除免疫復(fù)合物和凋亡細(xì)胞及適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。補(bǔ)體系統(tǒng)的激活途徑主要有3種，即經(jīng)典、替代(旁路)和凝集素(MBL)途徑。3條激活途徑均可產(chǎn)生C3轉(zhuǎn)化酶，進(jìn)而導(dǎo)致C5b-9(膜攻擊復(fù)合物MAC)生成，使細(xì)胞溶解從而產(chǎn)生免疫學(xué)作用。補(bǔ)體系統(tǒng)過(guò)度激活產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng)，能使自身組織遭到破壞。

1.2自噬自噬是細(xì)胞通過(guò)溶酶體途徑，將細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)降解小分子或氨基酸，對(duì)某些蛋白質(zhì)和氨基酸再回收、再利用的過(guò)程[3]。以細(xì)胞內(nèi)底物進(jìn)入溶酶體途徑的不同為依據(jù)，自噬主要分為3種：巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)，其中巨自噬又可分為選擇性自噬以及非選擇性自噬[4]。自噬過(guò)程由起始階段、分隔膜形成階段、自噬體形成階段、自噬溶酶體形成及降解階段4個(gè)階段組成。自噬信號(hào)調(diào)控的準(zhǔn)確性對(duì)于細(xì)胞的存活以及應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激尤為重要，其調(diào)控機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜。目前的研究表明，泛素樣蛋白系統(tǒng)、mTOR、磷酸腺苷活化蛋白激酶及PI3K途徑對(duì)于調(diào)控自噬起到重要作用[5]。

2補(bǔ)體激活及自噬與ARMD

2.1補(bǔ)體激活與ARMD實(shí)驗(yàn)表明補(bǔ)體系統(tǒng)與ARMD關(guān)系密切[6]。補(bǔ)體失調(diào)參與了ARMD的發(fā)病過(guò)程，尤其是補(bǔ)體旁路系統(tǒng)的失調(diào)。補(bǔ)體旁路系統(tǒng)作為補(bǔ)體系統(tǒng)的一部分，能夠產(chǎn)生與ARMD相關(guān)的多種蛋白質(zhì)。隨年齡增長(zhǎng)，視網(wǎng)膜處理高代謝產(chǎn)物的能力也隨之下降，導(dǎo)致脂質(zhì)、補(bǔ)體(如C3、C3a)以及其他免疫物質(zhì)在視網(wǎng)膜下堆積，導(dǎo)致補(bǔ)體系統(tǒng)激活，形成玻璃膜疣[7]。玻璃膜疣是視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)和Bruch膜之間的疣狀沉積物，與光感受器細(xì)胞和RPE細(xì)胞的變性有關(guān)，它是ARMD的臨床標(biāo)志，是ARMD發(fā)病的重要因素[8-10]，隨著疾病的發(fā)展，其大小和數(shù)量也在逐漸增加。玻璃膜疣的形成是導(dǎo)致嚴(yán)重的不可逆性中心性盲的主要原因，嚴(yán)重影響人們的日常生活[9]。不同補(bǔ)體成分，包括C3、C5b-9、CFB和CFH，在drusen和ARMD病變[11]中均有發(fā)現(xiàn)。研究還顯示，ARMD患者血漿中C3a、C3d和C5a水平升高[12-13]。β-淀粉樣蛋白(amyloid-β-protein,Aβ)是玻璃膜疣的重要組成成分之一。Zhao等[14]在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠年齡增長(zhǎng)，Aβ在RPE層的表達(dá)增多，隨之誘導(dǎo)膜攻擊復(fù)合物(MAC)表達(dá)增多，介導(dǎo)固有免疫系統(tǒng)引起炎癥反應(yīng)。叢生蛋白也是玻璃膜疣的主要蛋白成分之一，研究表明，ARMD患者眼中叢生蛋白的含量遠(yuǎn)大于正常人眼組織中的含量[15]。叢生蛋白可以通過(guò)調(diào)節(jié)補(bǔ)體系統(tǒng)而參與炎癥反應(yīng)過(guò)程，并且與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。Johnson等[16]將RPE細(xì)胞用富含補(bǔ)體成分的血清孵育后建立了一種模擬ARMD的體外模型,這種模型模擬了ARMD形成過(guò)程中一些關(guān)鍵特征,包括RPE下沉積物的聚集,即玻璃膜疣的成分和補(bǔ)體系統(tǒng)終末激活物以及大量的叢生蛋白沉積,由此推斷叢生蛋白與補(bǔ)體經(jīng)典途徑的激活有關(guān)。

曾在2005年，同時(shí)發(fā)表在Science雜志上的3篇文章均與ARMD的遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究有關(guān)，這些研究均提示補(bǔ)體因子H(CFH)的多態(tài)性與ARMD有密切聯(lián)系[17-19]。ARMD發(fā)生的主要預(yù)報(bào)因子是補(bǔ)體因子H基因常見的變異體Y402H[20]，該變異體能夠?qū)ζ湔{(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)方面起到抑制作用，從而過(guò)度激活補(bǔ)體，形成玻璃膜疣，損壞Bruch膜，引發(fā)濕性ARMD。Hageman等[21]報(bào)告顯示影響ARMD敏感性的不僅是Y402H單一基因變異，而且是CFH不同區(qū)域組成的半倍體型變異。這提示多樣的補(bǔ)體因子H的變異會(huì)導(dǎo)致ARMD風(fēng)險(xiǎn)上升或下降。

2.2自噬與ARMD自噬在視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞的功能中起著關(guān)鍵作用[22-24]。RPE細(xì)胞是有絲分裂后非自我更新的吞噬細(xì)胞，這些細(xì)胞內(nèi)成分的自噬對(duì)維持正常細(xì)胞功能至關(guān)重要。最近研究發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠的視網(wǎng)膜，特別是RPE和光感受器的自噬水平維持在一個(gè)較高的基線水平，而光照會(huì)引起自噬反應(yīng)[25]。在ARMD初期，為了補(bǔ)償損壞的細(xì)胞器和氧化應(yīng)激的結(jié)果，自噬水平增長(zhǎng)。在人體ARMD樣本和小鼠ARMD模型中，RPE和視網(wǎng)膜層中LC3、ATG9、ATG7水平升高[26]。然而，在來(lái)自晚期ARMD的樣本中，LC3、ATG9和ATG7水平下降，我們認(rèn)為缺乏自噬活性導(dǎo)致了ARMD的惡化。N-視黃醇胺(N-retinylidene-N-retinylethanolamine,A2E)存在于老年患者的RPE細(xì)胞中，是一種主要的毒性脂褐素成分。Zhang等[27]發(fā)現(xiàn)，在ARMD早期，A2E可觸發(fā)RPE細(xì)胞自噬，RPE細(xì)胞自噬水平升高，通過(guò)減少炎癥細(xì)胞因子和VEGF的分泌，保護(hù)細(xì)胞免受A2E的有害影響。自噬水平的降低使RPE細(xì)胞容易受到各種應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡，包括營(yíng)養(yǎng)耗竭和線粒體氧化損傷。p62是自噬降解的一種選擇性底物蛋白，具有靶向?qū)?、信?hào)調(diào)節(jié)、組裝蛋白質(zhì)復(fù)合物和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等作用[28]；p62還可影響由keap1/Nrf2通路調(diào)節(jié)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。研究表明，通過(guò)自噬清除不溶性蛋白質(zhì)及Nrf2信號(hào)通路的激活從而發(fā)揮抗氧化功能，p62為RPE提供雙重保護(hù)[29]。內(nèi)源性p62的耗盡通過(guò)下調(diào)自噬相關(guān)基因Atg1，降低自噬活性，進(jìn)而使RPE更容易受到氧化損傷，即在疾病狀態(tài)下自噬活性被抑制，導(dǎo)致p62堆積，從而加重ARMD的進(jìn)展[30]。

3補(bǔ)體激活與自噬相互影響

3.1自噬調(diào)節(jié)免疫炎癥補(bǔ)體系統(tǒng)異常激活導(dǎo)致免疫炎癥反應(yīng)，破壞自身組織；而自噬作為一種自我保護(hù)機(jī)制，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要途徑，在調(diào)解免疫炎癥方面起到重要作用。在關(guān)于巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，Shi等[31]研究發(fā)現(xiàn)自噬可以減輕免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生，其過(guò)程是通過(guò)降解炎癥小體的組成成分以抑制NLRP3炎癥小體的激活。有研究表明，ARMD病程中可能與自噬代謝累積物p62的沉積相關(guān)，其毒性反應(yīng)對(duì)RPE細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用[32]。在ARMD患者的黃斑組織中也出現(xiàn)自噬體及NLRP3等炎性因子累積[33]。說(shuō)明自噬功能失調(diào)可加重免疫炎癥反應(yīng)。

3.2補(bǔ)體激活與自噬對(duì)RPE細(xì)胞的影響膜攻擊復(fù)合物(MAC)是補(bǔ)體激活的終產(chǎn)物，它已被發(fā)現(xiàn)存在于ARMD患者的黃斑區(qū)及玻璃膜疣中，以攻擊RPE細(xì)胞為目標(biāo)，并可促進(jìn)跨膜通道的形成，進(jìn)而導(dǎo)致RPE細(xì)胞的死亡[34]，而抗氧化、抑制補(bǔ)體激活能減輕RPE細(xì)胞損傷[34-35]。在如缺氧、炎癥、氧化應(yīng)激或非折疊蛋白反應(yīng)等應(yīng)激環(huán)境中，RPE細(xì)胞的自噬可以被激活[36-37]。Lee等[38]通過(guò)研究觀察到線粒體膜中PINK1的積聚,并綜合電鏡等的檢查結(jié)果證實(shí)了RPE細(xì)胞的損傷能夠?qū)е戮€粒體自噬增加,并保護(hù)細(xì)胞,以及預(yù)防RPE細(xì)胞的損失。Wang等[39]在實(shí)驗(yàn)中觀察到由線粒體鐵蛋白(FTMT)過(guò)表達(dá)的ARPE-19細(xì)胞線粒體分裂增強(qiáng),引起線粒體自噬的觸發(fā),促進(jìn)保護(hù)機(jī)制的形成以應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激和與應(yīng)激相關(guān)的其他損失。以上研究表明，補(bǔ)體激活導(dǎo)致RPE細(xì)胞死亡，而自噬則對(duì)RPE細(xì)胞起保護(hù)作用。

3.3均衡調(diào)節(jié)補(bǔ)體激活和自噬的作用keap1/Nrf2是人體最為重要的抗氧化應(yīng)激防御性通路。p62是自噬過(guò)程的重要調(diào)節(jié)蛋白。Hayashi等[40]研究發(fā)現(xiàn)，在聽覺細(xì)胞，自噬在氧化應(yīng)激時(shí)通過(guò)p62蛋白維持與Nrf2系統(tǒng)的信號(hào)串?dāng)_；Mizunoe等[41]研究結(jié)果顯示，海藻糖能誘導(dǎo)自噬，還可激活p62-keap1/Nrf2通路，有望用于治療氧化應(yīng)激和自噬功能障礙導(dǎo)致的許多慢性疾病。氧化損傷直接激活或者通過(guò)Nrf2通路激活均可導(dǎo)致補(bǔ)體系統(tǒng)的激活。因此，keap1/Nrf2通路與補(bǔ)體激活和細(xì)胞自噬過(guò)程關(guān)系密切。自噬對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，但過(guò)度上調(diào)也會(huì)加重細(xì)胞凋亡；而補(bǔ)體激活形成的膜攻擊復(fù)合物會(huì)裂解細(xì)胞，激活過(guò)程產(chǎn)生的活化片段可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引發(fā)各種病理生理改變，但抑制補(bǔ)體激活會(huì)導(dǎo)致免疫防御功能的下降，甚至使腫瘤細(xì)胞逃避攻擊。這啟示我們，單純上調(diào)自噬或抑制補(bǔ)體激活對(duì)氧化應(yīng)激誘發(fā)的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用是難以評(píng)估的，均衡調(diào)節(jié)補(bǔ)體激活和自噬是是防治ARMD的關(guān)鍵所在，而P62蛋白作為keap1/Nrf2通路的重要調(diào)控因子，可能作為補(bǔ)體激活和自噬活動(dòng)的調(diào)節(jié)者，為維護(hù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)起到關(guān)鍵作用。

4小結(jié)

補(bǔ)體系統(tǒng)保持低烈度激活和正常的自噬是機(jī)體應(yīng)對(duì)老化、變性、變異和各種有害物質(zhì)侵襲的重要途徑。雖然我們對(duì)補(bǔ)體激活及自噬與ARMD的關(guān)系的探索已取得一定進(jìn)展，但ARMD的發(fā)生受年齡、遺傳、吸煙、氧化應(yīng)激等諸多因素的影響，是多個(gè)機(jī)制共同作用的結(jié)果。發(fā)病機(jī)制的研究是臨床治療的理論基石。針對(duì)補(bǔ)體因子的生物制劑還處于研發(fā)當(dāng)中，尚未進(jìn)行大規(guī)模臨床應(yīng)用；對(duì)自噬程度的靶向調(diào)控還未取得全部突破，自噬過(guò)少影響細(xì)胞的正常功能，自噬過(guò)強(qiáng)則能導(dǎo)致自噬性死亡。因此，我們需進(jìn)一步明確各種補(bǔ)體、炎癥因子激活的誘導(dǎo)因子及各因子間相互作用機(jī)制，以平衡補(bǔ)體激活與自噬之間的關(guān)系；其次，基于P62蛋白的特有功能，我們需深入研究調(diào)控P62蛋白可能通過(guò)keap1/Nrf2通路調(diào)節(jié)補(bǔ)體激活和自噬活動(dòng)，為防治ARMD做好理論基礎(chǔ)和準(zhǔn)備。