視網(wǎng)膜色素變性的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

蔣鵬飛，彭 俊，歐 晨，姚 震，田 野，王 英，彭清華,

0引言

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一種遺傳性視網(wǎng)膜病，遺傳方式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳及性連鎖隱性遺傳等，其特征是雙眼發(fā)病，慢性進(jìn)行性視力損害并伴有眼底色素變化[1]。影響全世界約250萬(wàn)人，我國(guó)人群發(fā)病率約為1/4000，男女比例約3∶2[2]。其特征在于視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的逐漸喪失，由此導(dǎo)致嚴(yán)重的視覺(jué)功能障礙和雙眼最終失明。除了來(lái)自約70個(gè)基因的超過(guò)3 000個(gè)基因突變點(diǎn)之外，已經(jīng)報(bào)道了RP與其他類(lèi)型的視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的廣泛遺傳重疊[3]。這種遺傳病理生理學(xué)的多樣性使得治療極具挑戰(zhàn)性。雖然已經(jīng)使用各種藥理學(xué)試劑(神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、抗氧化劑和抗凋亡劑)進(jìn)行了嘗試治療，但大多數(shù)并未針對(duì)RP的根本原因，并且其臨床療效尚未得到明確證實(shí)[4]。目前正在進(jìn)行或已完成的臨床試驗(yàn)中RP的治療包括基因治療、細(xì)胞治療和視網(wǎng)膜假體等[5]。眼科學(xué)者對(duì)視網(wǎng)膜色素變性進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)研究，取得了一定進(jìn)展，本文對(duì)近年來(lái)視網(wǎng)膜色素變性的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行了綜述，并對(duì)其未來(lái)研究方向進(jìn)行了展望。

1藥物治療

1.1中藥RP的特征在于視桿細(xì)胞的死亡，隨后是視錐細(xì)胞的死亡，逐漸導(dǎo)致部分或完全失明。所有能延緩視網(wǎng)膜感光細(xì)胞死亡的藥物均能在一定程度上治療RP。對(duì)4、12、24周齡的視網(wǎng)膜色素變性小鼠灌胃中藥復(fù)方夜明顆粒(由熟地10g，枸杞子10g，黃芪15g，丹參15g，當(dāng)歸10g，制首烏10g，山萸肉10g，靈芝6g，白芍10g，枳殼6g等組成)，給藥28d后發(fā)現(xiàn)不同周齡的視網(wǎng)膜色素變性小鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞層數(shù)均多于空白組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明夜明顆粒能延緩視網(wǎng)膜感光細(xì)胞死亡[6]。視網(wǎng)膜色素變性皇家外科學(xué)院(Royal College Surgeons，RCS)大鼠是一種較成熟的視網(wǎng)膜退化的動(dòng)物模型，與人類(lèi)RP有許多相似之處[7]。對(duì)RCS大鼠灌胃中藥復(fù)方益氣明目丸(由黨參10g，黃芪15g，白術(shù)10g，菟絲子15g，山藥10g，茯苓10g，黃精15g，北柴胡10g，葛根10g，丹參15g，當(dāng)歸10g等組成)懸濁溶液，30d后，HE染色觀察RCS大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各組視網(wǎng)膜組織中Bax、Caspase-3表達(dá)，Western Blot法測(cè)定各組視網(wǎng)膜組織中Bax、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)益氣明目丸組大鼠視網(wǎng)膜厚度明顯較模型組大鼠視網(wǎng)膜增厚，光感受器細(xì)胞核數(shù)目較模型組多，且益氣明目丸組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)較模型組清晰；益氣明目丸組視網(wǎng)膜凋亡因子Bax、Caspase-3平均光密度值均較模型組減少(P<0.01)[8-9]，說(shuō)明益氣明目丸可有效緩解視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的凋亡，從而對(duì)RP起到治療作用。

夜明顆粒與益氣明目丸均含有中藥丹參，宋厚盼等[10]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法分析了丹參治療RP的分子機(jī)制，篩選丹參的入血活性成分和作用靶點(diǎn)，得到與丹參相關(guān)的化學(xué)成分202個(gè)，篩得活性成分65個(gè)，其中入血活性成分13個(gè)，包括隱丹參酮、木犀草素、丹參酮ⅡA等；得到這些成分可能作用的靶點(diǎn)117個(gè)；得到85個(gè)丹參影響RP病理過(guò)程的特征性基因，這些基因主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、凋亡信號(hào)通路調(diào)控、DNA核內(nèi)復(fù)制調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程[10-11]。劉家琪等[12]從實(shí)驗(yàn)研究方面證實(shí)了中藥枸杞子-丹參對(duì)RCS大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)有改善作用，還可升高αB多肽(alpha B-crystalline，CRYAB)的表達(dá)，而CRYAB能抑制凋亡下游基因Caspase-3的激活。

以補(bǔ)腎益精方藥液灌胃RCS大鼠，分別于給藥7、28d時(shí)以TUNEL法檢測(cè)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡情況，與蒸餾水組相比，補(bǔ)腎益精方組視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡均有所減少(P<0.05)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示給藥7、28d時(shí)補(bǔ)腎益精方組視網(wǎng)膜睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)均較蒸餾水組增加(P<0.05)[13]。補(bǔ)腎益精方抑制RCS大鼠感光細(xì)胞凋亡的作用可能與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的增加有關(guān)。

1.2抗氧化劑視網(wǎng)膜感光細(xì)胞是除了腦細(xì)胞以外氧耗量最多的細(xì)胞，隨著RP的進(jìn)展，視桿細(xì)胞死亡，聚集在視網(wǎng)膜的氧無(wú)法被消耗，引起視網(wǎng)膜細(xì)胞氧化損傷[14]。Sulforaphane(SFN)已被證實(shí)是治療許多疾病的有效抗氧化劑，視網(wǎng)膜色素變性小鼠和野生型(wild type，WT)小鼠分別用SFN和生理鹽水處理，檢測(cè)其視網(wǎng)膜電圖及視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況，與生理鹽水組相比，SFN治療組視網(wǎng)膜電圖a波和b波振幅明顯增高，視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡基因下調(diào)，光感受器細(xì)胞死亡率降低[15]。表明抗氧化劑SFN對(duì)視網(wǎng)膜色素變性有一定的治療效果。

1.3抗凋亡劑補(bǔ)體激活被認(rèn)為可抑制視網(wǎng)膜病變中的神經(jīng)變性[16]，多種補(bǔ)體成分在人與rd10小鼠中光感受器變性時(shí)顯著上調(diào)，C3表達(dá)的增加激活了視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞可清除凋亡光感受器，如果C3缺乏，會(huì)減少凋亡光感受器的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用并增加對(duì)光感受器的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)毒性。CR3是C3激活產(chǎn)物iC3b的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的受體，增加其表達(dá)可有效減少小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)毒性，增加凋亡感光細(xì)胞清除率[17]。

1.4神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3,4-二羥基苯甲酸甲酯(methyl 3,4-dihydroxybenzoate，MDHB)是一種在體外發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的小分子，有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用和減少反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生的能力，可用于治療視網(wǎng)膜的退行性疾病，而RP存在視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的退化，在機(jī)制上MDHB可以治療RP。視網(wǎng)膜色素變性rd10小鼠從出生后第12d直到第26d，每天在rd10小鼠腹膜內(nèi)注射MDHB或等體積的載體。與未處理的動(dòng)物相比，MDHB處理顯著促進(jìn)視網(wǎng)膜光感受器存活并保持錐體形態(tài)；在MDHB處理的rd10小鼠中，視覺(jué)行為和ERG反應(yīng)也大大增強(qiáng)；MDHB還可抑制rd10小鼠視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細(xì)胞激活和Müller細(xì)胞膠質(zhì)增生；使用拮抗劑ANA-12可以阻斷MDHB對(duì)光感受器存活和結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用，證明MDHB確實(shí)可用于RP的治療[18]。

殷曉貝等[19]以不同劑量腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子玻璃體腔注射治療RP小鼠，發(fā)現(xiàn)劑量越高，RP小鼠視網(wǎng)膜抗凋亡蛋白表達(dá)越高。證明神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)RP有治療作用。在出生10d的RP小鼠玻璃體腔內(nèi)注射睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在14、18、22、30d的視網(wǎng)膜電圖a波和b波波幅均高于空白對(duì)照組，說(shuō)明在玻璃體腔內(nèi)注射睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能有效延緩RP小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的凋亡[20]。

2細(xì)胞移植

細(xì)胞移植是將細(xì)胞引入患者眼內(nèi)產(chǎn)生健康細(xì)胞，以期能夠替代無(wú)功能的細(xì)胞并與剩余的視網(wǎng)膜細(xì)胞連接。多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells，PSCs)，包括胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，在分子上與功能上都具備與體內(nèi)的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)細(xì)胞相同的分化潛能，相較于PSCs，人類(lèi)胚胎干細(xì)胞(human embroynic stem cells，hESCs)來(lái)源的RPE細(xì)胞移植更能有效挽救感光細(xì)胞[21]。

視網(wǎng)膜色素變性GTP酶調(diào)節(jié)劑(retinitis pigmentosa GTPase regulator，RPGR)的突變可導(dǎo)致X連鎖RP，RPGR定位于連接纖毛的感光器，未突變的RPGR與肌動(dòng)蛋白的凝溶膠蛋白相互作用并將其激活，凝溶膠蛋白可調(diào)節(jié)連接纖毛中的肌動(dòng)蛋白分解，從而促進(jìn)視紫紅質(zhì)(Rhodopsin，RHo)轉(zhuǎn)運(yùn)到光感受器外部區(qū)域。RPGR的突變擾亂了這種RPGR-凝溶膠蛋白相互作用，損害了凝溶膠蛋白的活化。RPGR和凝溶膠蛋白敲除小鼠均顯示光感受器中肌動(dòng)蛋白聚合和Rho錯(cuò)誤定位的異常。使用鼠和人誘導(dǎo)的PSCs模型可恢復(fù)光感受器中肌動(dòng)蛋白的聚合，最終阻止RP的進(jìn)展[22]。

3基因治療

基因療法是一種利用病毒或非病毒載體糾正遺傳缺陷的治療策略，有可能通過(guò)替換或沉默致病基因來(lái)實(shí)現(xiàn)最終治療，隱性遺傳或X連鎖突變的RP患者對(duì)基因治療更敏感。對(duì)已確定致病基因的RP來(lái)講，基因治療是目前最有潛力的治療方式。RP基因治療的相關(guān)研究日益增多，涉及多種RP相關(guān)基因。其中，RPE65是恢復(fù)視網(wǎng)膜色素上皮中感光細(xì)胞功能所必需視覺(jué)色素必需酶，目前已鑒定出60多種不同的RPE65基因突變。在遺傳性視網(wǎng)膜疾病基因治療的許多臨床試驗(yàn)中，voretigene neparvovec(AAV2-hRPE65v2，Luxturna)的3期臨床試驗(yàn)顯示對(duì)RPE65介導(dǎo)的遺傳性視網(wǎng)膜疾病有顯著療效，包括Leber先天性黑矇和RP。Luxturna即將被批準(zhǔn)作為第一個(gè)眼部基因治療生物制品[23]。

導(dǎo)致RP的基因突變點(diǎn)較多，近來(lái)發(fā)現(xiàn)p75NTR基因突變可導(dǎo)致RP，在rd10小鼠中，也發(fā)現(xiàn)了p75NTR基因，與WT小鼠相比，在感光細(xì)胞死亡峰值之前的早期退化階段，rd10小鼠視網(wǎng)膜中p75NTR的下游細(xì)胞因子proNGF水平增加；在光感受器細(xì)胞喪失期間，ProNGF也保持升高。對(duì)rd10小鼠單次玻璃體內(nèi)或結(jié)膜下注射p75NTR的拮抗劑THX-B，對(duì)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞有神經(jīng)保護(hù)作用[24]。

在Rho中超過(guò)150種不同的突變均可引起RP，Rho突變是常染色體顯性遺傳RP的最常見(jiàn)原因，常染色體隱性遺傳RP多與Rho功能喪失有關(guān)。以生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43慢病毒載體轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可提高視網(wǎng)膜外核層厚度，提高Rho蛋白表達(dá)，對(duì)視網(wǎng)膜色素變性具有較好的作用[25]。P23H是Rho基因中最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，CRISPR/Cas9組分可在視網(wǎng)膜P23H基因位點(diǎn)中呈現(xiàn)高速率切割，在WT型小鼠中Rho等位基因中則不切割，這種特異性破壞P23H突變體同時(shí)又保留WT功能性等位基因的方式有效地減緩了感光細(xì)胞變性。同時(shí)，該方法在P23H基因突變的人感光細(xì)胞中也成功翻譯[26-27]。雖然約45%的突變P23H等位基因在DNA水平上被編輯，但相對(duì)RNA表達(dá)在P23H突變小鼠中更加靈敏，WT小鼠Rho突變相對(duì)RNA表達(dá)是P23H突變小鼠Rho相對(duì)RNA表達(dá)的約2.8倍。利用SpCas9變體和截短RNA間隔介導(dǎo)的等位基因特異性敲除方法，可以實(shí)現(xiàn)P23H突變小鼠中相對(duì)RNA突變的有效區(qū)分，對(duì)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞變性的延遲更加顯著[28]。以基因消融聯(lián)合基因替換治療的方式破壞內(nèi)源性Rho基因的表達(dá)，治療后視網(wǎng)膜外核層厚度比單純AAV注射高17%～36%[29]，基因消融聯(lián)合基因替換可以治療由不同Rho突變引起的RP，而不單單針對(duì)某一基因突變位點(diǎn)，因此該種治療方式可用于治療眼科和其他領(lǐng)域中的多種遺傳性疾病。

分離和培養(yǎng)人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUCMSCs)，以色素上皮衍生因子(pigment epithelial-derived factor，PEDF)重組慢病毒轉(zhuǎn)染hUCMSCs，攜帶PEDF基因的重組慢病毒載體，能高效感染hUCMSCs，感染后的hUCMSCs進(jìn)行傳代培養(yǎng)，慢病毒可延長(zhǎng)目的基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。將PEDF-hUCMSCs注射到RCS大鼠視網(wǎng)膜下，注射8wk后視網(wǎng)膜外核層厚度高于注射hUCMSCs組[30]，說(shuō)明基因治療較單純細(xì)胞移植有更好的治療作用。

許多X連鎖遺傳RP動(dòng)物模型中成功地建立了RPGR的基因替換腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)載體，RPGR富含嘌呤的區(qū)域因含有高度重復(fù)的核苷酸序列，其固有序列不穩(wěn)定，常導(dǎo)致病毒載體克隆過(guò)程中出現(xiàn)重組錯(cuò)誤，給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)較大難度。有研究指出[31]，病毒載體中重組錯(cuò)誤出現(xiàn)的主要原因是RPGR蛋白中的谷氨酰化模式與WT變體無(wú)法區(qū)分。以針對(duì)人X連鎖遺傳RP的AAV8載體是一種優(yōu)化的基因替代療法，該載體可一致地產(chǎn)生全長(zhǎng)正確的RPGR蛋白，通過(guò)AAV8載體遞送并由Rho激酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)時(shí)，密碼子優(yōu)化的RPGR在兩種RP動(dòng)物模型均表現(xiàn)出較好的療效，并且有良好的安全性，為臨床試驗(yàn)提供了治療基礎(chǔ)。在GRK1啟動(dòng)子控制下的RPGR突變體狗中使用密碼子優(yōu)化的人RPGR(hRPGRstb)和RPGR(hRPGRco)兩種基因，可抑制狗視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的退化，從而保持視力[32]。

磷酸二酯酶6-α(phosphodiesterase 6-alpha，PDE6A)基因的突變被廣泛認(rèn)為是人視網(wǎng)膜色素變性的原因，AAV-8的PDE6A在PDE6A突變狗視網(wǎng)膜中有快速的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，對(duì)10只PDE6A突變狗進(jìn)行視網(wǎng)膜下注射，與未治療的眼睛相比，治療眼視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層厚度得以保留，感光細(xì)胞也得以存活[33]，但是也存在一些副作用，如視網(wǎng)膜脫離等。多項(xiàng)研究[34-35]均將人類(lèi)RP的突變基因在動(dòng)物RP中進(jìn)行了基因增強(qiáng)，以往研究的基因突變動(dòng)物多為小鼠和大鼠，現(xiàn)在越來(lái)越多的基因突變動(dòng)物為大型動(dòng)物，如犬類(lèi)等，結(jié)果表明基因增強(qiáng)療法可提高視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的存活率，降低視網(wǎng)膜感光細(xì)胞死亡速度，從而挽救視力。

4展望

眼科學(xué)者對(duì)RP進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究，開(kāi)發(fā)出多種RP治療方法，本文對(duì)其進(jìn)行了一些總結(jié)。其中藥物治療與其它治療方式相比，無(wú)侵入性，且方便價(jià)廉，如能對(duì)藥物尤其是中藥的作用機(jī)制進(jìn)行更加深入的研究，將有利于研發(fā)出效高的新型藥物。自體干細(xì)胞植入被認(rèn)為是治療RP的一種有效方法，但也有報(bào)道稱自體干細(xì)胞移植會(huì)引起視網(wǎng)膜前膜及黃斑皺褶[36]，因此干細(xì)胞移植的安全性仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究論證?；蛑委熾m然存在一定的局限性，如靶基因過(guò)于單一，而導(dǎo)致RP的突變基因較多；給藥方式有侵入性，會(huì)有患者眼睛帶來(lái)?yè)p傷；臨床療效不確切等。但隨著基因編輯技術(shù)和新型基因遞送載體的發(fā)展，基因治療在未來(lái)會(huì)成為RP和其他遺傳性視網(wǎng)膜疾病最有希望的治療方式之一，但將實(shí)驗(yàn)研究成果運(yùn)用于臨床仍有很長(zhǎng)的道路要走。