寄生蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑的研究進(jìn)展

王澤祥，孫曉林

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

20世紀(jì)60年代，美國加利福尼亞大學(xué)的學(xué)者從雞蛋清中首次分離出半胱氨酸蛋白酶抑制劑，隨著研究的不斷深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶抑制劑是一類在進(jìn)化相關(guān)的蛋白質(zhì)，能夠抑制C1家族蛋白、C13家族蛋白、木瓜蛋白酶類的半胱氨酸蛋白酶[1]。1991年，Lustigman等人首次在寄生蟲—旋盤尾線蟲中發(fā)現(xiàn)了半胱氨酸蛋白酶抑制劑的存在，并對(duì)其進(jìn)行成功克隆和鑒定[2]。隨后的數(shù)十年間，吸蟲、絳蟲、線蟲和原蟲的半胱氨酸蛋白酶抑制劑不斷被發(fā)現(xiàn)，其類型、結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能的研究也逐漸深入。本文對(duì)吸蟲、絳蟲、線蟲和原蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑研究的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 寄生蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑的分類與結(jié)構(gòu)

1.1 分類和結(jié)構(gòu)

適用于半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族的分類方式有兩種，第一種分類方式是根據(jù)半胱氨酸蛋白酶抑制樣特征的有無進(jìn)行分類（如二硫鍵、半胱氨酸蛋白酶抑制樣元素的數(shù)目），第二種分類方式是根據(jù)氨基酸序列和一級(jí)結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分類[3]，是目前半胱氨酸蛋白酶抑制劑常用的分類方式[4]。依據(jù)第二種分類方式，將半胱氨酸蛋白酶抑制劑分為四個(gè)亞家族，分別是stefins家族、cystatins家族、kininogens家族和fetuin家族[5]。

Stefins家族亦稱為胱抑蛋白，是一條約100個(gè)氨基酸的多肽鏈，分子量大約11 kDa，無信號(hào)肽序列、二硫鍵和糖基。該家族蛋白主要存在于細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞外液中有少量存在。Stefins家族包括stefin A和stefin B兩個(gè)成員，stefin A主要分布在各種上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中，而stefin B則在各類細(xì)胞和組織中普遍分布[6，7]。

Cystatins家族蛋白的多肽鏈約包含120個(gè)氨基酸，分子量大約為13～15 kDa，有一個(gè)信號(hào)肽序列和2個(gè)二硫鍵位于多肽鏈的N端。除此之外，在cystatins的N端有一個(gè)保守的甘氨酸、殘基和QxVxG基序，而在C端則有保守的PW序列，這三者形成的疏水性契形結(jié)構(gòu)形成了cystatin抑制半胱氨酸蛋白酶的活性部位。部分cystatins還有一個(gè)SND/S保守序列位于N端甘氨酸和QxVxG之間，可能是這類cystatins抑制豆莢蛋白水解酶的活性部位。Cystatins家族蛋白是分泌型蛋白，主要分布于動(dòng)物的體液中[8，9]。

Kininogens家族蛋白是單鏈蛋白質(zhì)，分子量較大，60～120 kDa之間均有分布，有信號(hào)肽序列、多個(gè)糖基化位點(diǎn)和二硫鍵，序列中含有串聯(lián)的cystatins樣的結(jié)構(gòu)域。Kininogens家族包括H-Kininogen、L-Kininogen和T-Kininogen 3個(gè)成員。H-Kininogen分子量最大，約120 kDa，而L-Kininogen和T-Kininogen分子量相近，均為68kDa左右。Kininogens家族成員氨基酸單鏈N端結(jié)構(gòu)均比較保守，而C端結(jié)構(gòu)差別較大。H-Kininogen、L-Kininogen和T-Kininogen均含有數(shù)目不等的蛋白酶敏感的結(jié)構(gòu)域，H-Kininogen和L-Kininogen在N端有3個(gè)蛋白酶敏感的結(jié)構(gòu)域，而T-Kininogen中，除了在N端有3個(gè)蛋白酶敏感的結(jié)構(gòu)域，在C端也有一個(gè)蛋白酶敏感的結(jié)構(gòu)域。Kininogens家族多分布于體液中，主要是血漿和分泌液中[10-12]。

fetuin家族只有部分成員具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，該家族蛋白由Elzanowski等人于1988年發(fā)現(xiàn)，因其具有cystatin樣的結(jié)構(gòu)域，故將其與cystatin家族聯(lián)系在一起，歸類為第四家族。該家族蛋白亦是分泌蛋白，屬于I25C亞家族[13-15]。

1.2 功能

在宿主特異性T 細(xì)胞免疫應(yīng)答的抗原降解和抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體的形成兩步催化反應(yīng)過程中，半胱氨酸蛋白酶發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，一方面參與抗原提呈細(xì)胞（APC）核內(nèi)體-溶酶體內(nèi)抗原的處理，另一方面水解與MHC-Ⅱ分子結(jié)合的恒定鏈，以形成與MHC-Ⅱ分子結(jié)合的恒定鏈肽段，從而便于MHC-Ⅱ分子的肽結(jié)合凹槽暴露，助于處理的抗原多肽與MHC-Ⅱ分子的結(jié)合。寄生蟲的半胱氨酸蛋白酶抑制劑能夠抑制宿主的半胱氨酸蛋白酶，干擾抗原的處理，阻斷肽段與MHC-Ⅱ分子的結(jié)合，以降低APC抗原提呈的功能[5,16-19]。

宿主免疫反應(yīng)中會(huì)產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子、抗炎性細(xì)胞因子、NO等效應(yīng)分子調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)。寄生蟲的半胱氨酸蛋白酶抑制劑不但具有調(diào)節(jié)細(xì)胞因子生成量、誘導(dǎo)抗炎癥反應(yīng)、轉(zhuǎn)變無保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力，而且具有影響宿主NO釋放量的免疫調(diào)節(jié)功能[5,20-24]。

寄生蟲的免疫逃避是其在宿主體內(nèi)寄生、增殖的重要機(jī)制，寄生蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑的產(chǎn)生是寄生蟲適應(yīng)寄生蟲-宿主共進(jìn)化和逃避宿主免疫應(yīng)答的方式之一。這不但表現(xiàn)在一些寄生蟲的半胱氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)宿主蛋白酶的高特異性方面，而且表現(xiàn)在抑制蛋白酶活性、影響免疫細(xì)胞增生及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)量方面[5,22,25]。

2 寄生蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑研究現(xiàn)狀

2.1 吸蟲

肝片吸蟲的3種半胱氨酸蛋白酶抑制劑都屬于stefin亞家族，其中FhStf-1是經(jīng)典的stefin家族半胱氨酸蛋白酶抑制劑，由于FhStf-2和FhStf-3二者均包含不常見的信號(hào)肽序列，被歸類為stefin亞家族仍存在一定異議。研究發(fā)現(xiàn)，重組表達(dá)的肝片吸蟲的FhStf-1、FhStf-2和FhStf-3都能夠抑制肝片吸蟲的組織蛋白酶L，然而，三者抑制哺乳動(dòng)物組織蛋白酶B、L和C的能力則存在差異。FhStf-1主要分布在肝片吸蟲的生殖器官（如睪丸和卵巢）和成蟲腸腔薄膜表面，據(jù)此可以推斷FhStf-1可能調(diào)節(jié)肝片吸蟲生殖和消化相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶活性。此外，在肝片吸蟲的排泄分泌物中也發(fā)現(xiàn)了FhStf-1的分布，這表明FhStf-1是通過非經(jīng)典分泌途徑分泌的，而且其可能與宿主細(xì)胞溶酶體的半胱氨酸蛋白酶產(chǎn)生相互作用[26]。日本血吸蟲的半胱氨酸蛋白酶抑制劑與曼氏血吸蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑的序列相似性達(dá)到77%，生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)其無信號(hào)肽序列和二硫鍵，由此可以推斷它是屬于stefins家族。在日本血吸蟲蟲卵、童蟲和成蟲階段均有該半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因的表達(dá)，而且在蟲卵的毛蚴中、成蟲的腸道表皮和體表分布較多。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，重組日本血吸蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑可以進(jìn)入小鼠樹突狀細(xì)胞中，但是僅分布在樹突狀細(xì)胞的胞漿中，其能夠抑制小鼠樹突狀細(xì)胞的活性和代謝水平，繼而降低小鼠樹突狀細(xì)胞對(duì)抗原的遞呈作用。更重要的是，重組日本血吸蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑可以顯著提高感染小鼠體內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，由此可以得出：日本血吸蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑具有抑制抗原遞呈及誘導(dǎo)抑制性免疫反應(yīng)的功能，它可能在血吸蟲免疫逃避中發(fā)揮作用[27]。

2.2 絳蟲

目前發(fā)現(xiàn)的豬帶絳蟲的兩種半胱氨酸蛋白酶抑制劑分別屬于stefin和cystatin兩個(gè)亞家族成員，而且兩者在豬囊尾蚴和成蟲期都有轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而且成蟲期的表達(dá)量遠(yuǎn)高于豬囊尾蚴時(shí)期的表達(dá)量。李君君等人對(duì)豬帶絳蟲的半胱氨酸蛋白酶抑制劑Ts-stefin和Ts-cystatin進(jìn)行了可溶性原核表達(dá)和純化，酶活性抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示兩者對(duì)人源組織蛋白酶L和牛源組織蛋白酶B的活性均有明顯抑制功能[28]。制備Ts-cystatin多克隆抗體，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)Ts-cystatin在豬帶絳蟲成蟲成熟節(jié)片中的分布進(jìn)行了定位研究，發(fā)現(xiàn)Ts-cystatin主要分布在成熟節(jié)片的體壁、間質(zhì)和卵巢中。吳茂迪等人對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲的半胱氨酸蛋白酶抑制劑Eg-cystatin進(jìn)行了克隆和生物信息學(xué)分析，顯示Eg-cystatin含有cystatin結(jié)構(gòu)域、Q-X-V-X-G保守序列、甘氨酸殘基和PW發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，Eg-cystatin與豬帶絳蟲、牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲的cystatin序列相似性約為72.20%～75.91%，進(jìn)化樹上它們屬于同一分支。免疫熒光定位顯示原頭蚴Eg-cystatin的分布區(qū)域主要是表皮及頂突小鉤、生發(fā)層，而成蟲Eg-cystatin的分布區(qū)域主要是蟲體內(nèi)部和蟲卵[29]。

2.3 線蟲

許多線蟲的半胱氨酸蛋白酶抑制劑都得到了不同程度的研究，絲蟲、巴西日?qǐng)A線蟲和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的cystatin都被證明具有抑制宿主組織蛋白酶的活性。馬蘭絲蟲表達(dá)3個(gè)cystatins，而且它們進(jìn)行期特異性表達(dá)，其中Bm-cystatin-2在馬蘭絲蟲的整個(gè)生命周期都進(jìn)行表達(dá)，而Bm-cystatin-1和Bm-cystatin-3僅在媒介蚊子的晚期表達(dá)，在宿主哺乳動(dòng)物時(shí)期則不進(jìn)行表達(dá)[30]。許多線蟲的cystatin都可以干擾宿主抗原遞呈的過程，如馬蘭絲蟲、棉鼠線蟲和巴西日?qǐng)A線蟲。旋盤尾絲蟲的cystatins能夠降低外周血單核細(xì)胞表面分子白細(xì)胞分化抗原HLA-DR和CD86的表達(dá)量，這說明線蟲的cystatins也是一種調(diào)節(jié)單核細(xì)胞活性的因子[31]。此外，魏氏棘唇線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲和小鼠腸道寄生線蟲的cystatin通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞因子的表達(dá)，為自身逃避宿主免疫應(yīng)答提供便利。李婷婷等人對(duì)旋毛蟲的3種半胱氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)3種Stefin、Cystatin1和Cystatin2在旋毛蟲的肌幼蟲、成蟲和新生幼蟲時(shí)期都發(fā)生轉(zhuǎn)錄，而它們的表達(dá)則主要在肌幼蟲的表皮和桿狀體中。重組的旋毛蟲cystatins和IFN-γ共同作用于巨噬細(xì)胞RAW264.7，具有明顯劑量依賴性抑制巨噬細(xì)胞NO產(chǎn)生的作用[6]。此外，與許多線蟲類似，旋毛蟲cystatin同樣具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的功能，重組的cystatin單獨(dú)作用于巨噬細(xì)胞，能夠促進(jìn)IL-10的分泌。

2.4 原蟲

目前，錐蟲的半胱氨酸蛋白酶抑制劑研究最為深入，克氏錐蟲和布氏錐蟲中均存在cystatin類似蛋白chagasin，該蛋白具有抑制木瓜蛋白酶（C1）家族半胱氨酸蛋白酶活性的功能。研究表明，克氏錐蟲的半胱氨酸蛋白酶抑制劑能夠與半胱氨酸蛋白酶cruzain緊密結(jié)合，繼而該病半胱氨酸蛋白酶cruzain在蟲體的定位，這種定位的改變主要發(fā)生在高爾基體，而且Cystatins能夠上調(diào)克氏錐蟲感染后小鼠巨噬細(xì)胞NO的分泌量[32，33]。誘導(dǎo)墨西哥利什曼原蟲和碩大利什曼原蟲中也表達(dá)chagasin，重組表達(dá)的chagasin能夠抑制CA半胱氨酸蛋白酶和C1半胱氨酸蛋白酶，但是不能夠抑制CD半胱氨酸蛋白酶。阿米巴原蟲的含有2個(gè)編碼半胱氨酸蛋白酶抑制劑的基因，ICP1主要分布在細(xì)胞質(zhì)，而ICP2主要分布在吞噬體，兩者的晶體結(jié)構(gòu)顯示它們3個(gè)保守環(huán)形成的柔性契形結(jié)構(gòu)可能是抑制半胱氨酸蛋白酶活性的區(qū)域[34]。此外，阿米巴原蟲內(nèi)源性半胱氨酸蛋白酶抑制劑CPI1的差異性表達(dá)會(huì)影響其與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的結(jié)合，說明ICP1是調(diào)節(jié)阿米巴原蟲與宿主蛋白質(zhì)結(jié)合的重要因素，而且ICP1在阿米巴原蟲的致病過程中發(fā)揮重要作用[35]。

3 結(jié)語

半胱氨酸蛋白酶抑制劑在吸蟲、絳蟲、線蟲、原蟲中廣泛存在，具有獨(dú)特的酶抑制活性和免疫調(diào)節(jié)功能，調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)的抗原遞呈，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)量、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞NO的合成量等。對(duì)寄生蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)行基因克隆、序列分析和功能研究有助于在分子水平上闡明寄生蟲免疫調(diào)節(jié)和免疫逃避的機(jī)制，而且半胱氨酸蛋白酶抑制劑在抗寄生蟲感染中的應(yīng)用前景也在不斷擴(kuò)展。目前，半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但是很多寄生蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑的研究依然局限在序列分析和蟲體定位方面，有必要對(duì)它們的功能進(jìn)行深入的研究。相信隨著研究工作的不斷深入，寄生蟲半胱氨酸酶抑制劑的功能和應(yīng)用方面的研究會(huì)有新的突破，對(duì)寄生蟲免疫調(diào)節(jié)和免疫逃避的機(jī)制的了解也會(huì)越來越清楚。