PCR檢測(cè)不同樣品中牛羊布魯氏菌病的對(duì)比試驗(yàn)研究

王 佳,關(guān)紅民,豆思遠(yuǎn)

（1.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730046；2.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 武威 733006）

布魯氏菌?。˙rucellosis）簡(jiǎn)稱布病，是由布魯氏桿菌侵入動(dòng)物機(jī)體引起的慢性細(xì)菌性人獸共患傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動(dòng)物疫病，我國將其列為二類動(dòng)物傳染疫病[1]。該病主要侵害動(dòng)物機(jī)體的生殖器官，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展和食品衛(wèi)生安全，危害人類健康，阻礙對(duì)外貿(mào)易[2]。布魯氏菌病是當(dāng)前一種嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生事業(yè)和畜牧業(yè)發(fā)展的人獸共患傳染性疾病[3]。常用的布魯氏菌病病原學(xué)檢測(cè)方法中，PCR檢測(cè)是一項(xiàng)技術(shù)成熟、時(shí)間短的快速檢測(cè)方法，但PCR檢測(cè)方法與檢測(cè)試劑所要求的樣品以組織樣為主，采集過程存在人員感染和環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn)[4，5]。鑒于此，本研究通過對(duì)不同樣品中牛羊布魯式菌病的分析研究，旨在篩選出檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可操作性強(qiáng)，可替代組織和血液的樣品，以期降低牛羊布魯氏菌病采樣、檢測(cè)和廢棄物處理中人員的感染風(fēng)險(xiǎn)，為準(zhǔn)確檢測(cè)牛羊布魯氏菌病的感染情況提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品及數(shù)量

樣品采自29頭牛、18只羊。采集組織樣品15份，奶牛11份、羊4份。奶牛鼻腔拭子20份、生殖道拭子12份，羊鼻腔拭子8份、生殖道拭子16份，拭子樣品共計(jì)56份。鼻腔拭子、生殖道拭子分別用PBS和0.5%石碳酸生理鹽水緩沖溶液保存。采集尿液42份，奶牛29份、母羊13份。各種樣品采集數(shù)量詳見表1。

1.2 試劑

布魯氏菌病PCR試劑盒購自北京世紀(jì)元亨生物制品有限公司，批號(hào)為：201301G25。PBS溶液實(shí)驗(yàn)室自制，濃度為0.01 mol/L，pH值為7.4。

1.3 樣品制備

組織和分泌物加PBS液1 ml，研磨處理后取上清液100 μl，拭子樣品取PBS浸液和0.5%石碳酸生理鹽水浸液各100 μl，加入200 μl消化液和和20 μl蛋白酶K，震蕩混勻后，置于56℃水浴消化1 h。

表1 奶牛和羊PCR檢測(cè)樣品數(shù)量（單位：份）

表2 PCR檢測(cè)不同樣品中奶牛和羊布魯氏菌病測(cè)定結(jié)果

表3 PCR檢測(cè)不同類型樣品測(cè)定結(jié)果

1.4 DNA提?。V膜法）

1.4.1 從水浴鍋中取出樣品降至室溫，加入300 μl的DNA結(jié)合液混勻，將全部液體移入吸附柱中，室溫靜置3 min，10 000 rpm離心30 s。

1.4.2 棄去收集管中液體，加入500 μl DNA洗滌液，10 000 rpm離心30 s。

1.4.3 重復(fù)上一步。

1.4.4 棄去收集管中液體，10 000 rpm空柱離心1min，除去殘留DNA洗滌液。

1.4.5 將吸附柱放入新的1.5 ml離心管中，50 μl洗脫液洗脫模板。

1.5 擴(kuò)增條件

擴(kuò)增體系每份總體積為20μl，含16μl的PCR反應(yīng)液、2μl的Taq DNA聚合酶、2μl模板DNA。擴(kuò)增條件：94℃用時(shí)3 min；循環(huán)94℃用時(shí)30 s，60℃用時(shí)30 s，72℃用時(shí)30 s，共35次；72℃延伸7 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織中牛羊布魯氏菌病檢測(cè)結(jié)果

由表2、表3可知，檢測(cè)組織樣品15份，奶牛陽性數(shù)為10份，羊陽性數(shù)為3份，奶牛布魯氏菌病感染率為90.91%，羊布魯氏菌病感染率為75.00%，組織樣品中牛羊布魯氏菌病的平均感染率為86.67%。

2.2 鼻腔拭子中牛羊布魯氏菌病檢測(cè)結(jié)果

從表2、表3、圖1、圖2可知，PBS保存的鼻腔拭子樣品15份，檢出陽性11份，奶牛布魯氏菌病感染率為72.73%，羊布魯氏菌病感染率為75.00%。PBS保存的鼻腔拭子布魯氏菌病的平均感染率為73.33%；0.5%石碳酸生理鹽水保存鼻腔拭子13份，檢出陽性10份，奶牛布魯氏菌病感染率為77.78%，羊布魯氏菌病感染率為78.00%，0.5%石碳酸生理鹽水保存的鼻腔拭子布魯氏菌病的平均感染率為76.92%。鼻腔棉拭子中牛羊布魯氏菌病的平均感染率為75%。

圖1 牛鼻腔拭子中布魯氏菌病PCR擴(kuò)增結(jié)果（部分樣品）

圖2 羊鼻腔拭子中布魯氏菌病PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 生殖道拭子中牛羊布魯氏菌病檢測(cè)結(jié)果

由表2、表3、圖3、圖4可知，PBS保存的生殖道拭子15份，檢出陽性12份，奶牛布魯氏菌病感染率為85.71%，羊布魯氏菌病感染率為75.00%，PBS保存的生殖道拭子布魯氏菌病的平均感染率為80.00%；0.5%石碳酸生理鹽水保存生殖道拭子13份，檢出陽性11份，奶牛布魯氏菌病感染率為80.00%，羊布魯氏菌病感染率為87.50%，0.5%石碳酸生理鹽水保存的生殖道拭子布魯氏菌病的平均感染率為84.62%。生殖道棉拭子中牛羊布魯氏菌病平均感染率為82.14%。

2.4 尿液中牛羊布魯氏菌病檢測(cè)結(jié)果

從表1、表2、圖4可知，檢測(cè)奶牛尿液29份，檢測(cè)出陽性21份，感染率為72.41%；檢測(cè)母羊尿液13份，檢測(cè)出陽性10份，感染率為76.92%。

3 討論

試驗(yàn)研究表明，牛羊的組織、鼻腔拭子、生殖道拭子及尿液中均可檢測(cè)出布魯氏菌。在組織樣品中，奶牛布魯氏菌病的感染率高于羊。用0.5%石碳酸生理鹽水保存的鼻腔拭子，奶牛和羊布魯氏菌病的感染率均高于PBS保存的拭子。用PBS保存的生殖道拭子，奶牛布魯氏菌病的感染率高于石碳酸生理鹽水保存的拭子，兩種保護(hù)液中的羊生殖道拭子，布魯氏菌病的感染情況與奶牛相反。用同種保護(hù)液保存的牛羊鼻腔拭子和生殖道拭子，生殖道拭子的感染率高于鼻腔拭子。用兩種保護(hù)液保存的牛羊同種拭子，0.5%石碳酸生理鹽水保存的拭子感染率高于PBS。尿液中，母羊布魯氏菌病的感染率高于奶牛。

圖3 牛生殖道拭子中布魯氏菌病PCR擴(kuò)增結(jié)果（部分樣品）

圖4 羊尿液、牛生殖道拭子中布魯氏菌病PCR擴(kuò)增結(jié)果（部分樣品）

通過檢測(cè)分析不同樣品中牛羊布魯氏菌病的感染情況可知，樣品檢出率從高到低順序?yàn)榻M織樣品、生殖道拭子、鼻腔拭子、尿液。采用PCR方法檢測(cè)鼻腔拭子和生殖道拭子，拭子樣品保存在0.5%石碳酸生理鹽水中，可降低采集組織樣品和血液樣品造成人員感染牛羊布魯氏菌病的生物安全威脅，提高牛羊布魯氏菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性。