哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1介導(dǎo)的自噬對(duì)骨代謝的調(diào)控

朱俊瑾 周佳琦 伍穎穎

1.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院 成都 610041；2.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院種植科 成都 610041

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物（mammalian target of rapamycin complex， mTORC）1是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）形成的一種復(fù)合物，能整合多種細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)，進(jìn)行蛋白質(zhì)、脂質(zhì)合成和自噬調(diào)控。其中，自噬是細(xì)胞降解損壞的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器并將其循環(huán)利用的過(guò)程，對(duì)于維持細(xì)胞壽命具有重要生理意義。近年來(lái)，對(duì)mTORC1介導(dǎo)的自噬效應(yīng)關(guān)注增多，對(duì)mTORC1介導(dǎo)的自噬效應(yīng)在骨組織調(diào)控方面的研究也不斷深入。本文就mTORC1/自噬通路在成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞分化、功能活性等方面的作用進(jìn)行綜述，為骨代謝的生物學(xué)機(jī)制及骨相關(guān)疾病研究提供新思路。

1 mTORC1

mTOR可整合多種信號(hào)，在適當(dāng)條件下直接激活絲氨酸/蘇氨酸激酶，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖。在結(jié)構(gòu)及功能方面，mTOR與其他蛋白質(zhì)分子構(gòu)成兩種不同復(fù)合物，分別為mTORC1和mTORC2，其核心組分分別為Raptor和Rictor。由于雷帕霉素的短期應(yīng)用不會(huì)干擾mTORC2信號(hào)，一般認(rèn)為mTORC2對(duì)雷帕霉素不敏感，因此在進(jìn)行mTOR的研究中，關(guān)注點(diǎn)多集中在mTORC1。

mTORC1能整合多種細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)（如生長(zhǎng)因子、氨基酸、應(yīng)激、氧、能量），通過(guò)關(guān)鍵的上游調(diào)節(jié)因子結(jié)節(jié)性硬化（tuberous sclerosis，TSC）1/2復(fù)合物，一種針對(duì)三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶Rheb的GTP酶活化蛋白，可將Rheb從GTP結(jié)合的激活態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槎姿狲B苷（guanosine diphosphate，GDP）結(jié)合的失活態(tài)，負(fù)性調(diào)節(jié)mTORC1。TSC1/2的這種作用使其在mTORC1的上游通路中承擔(dān)信號(hào)傳遞的工作。細(xì)胞外信號(hào)如胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulinlike growth factor，IGF）-1，通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）和Ras通路刺激蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular-signalregulated kinase，ERK）1/2等效應(yīng)激酶，使TSC1/TSC2磷酸化，致其失活，從而激活mTORC1，并對(duì)下游靶點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié)[1-2]。

mTORC1完成信號(hào)整合后，調(diào)控蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)合成、自噬等重要的細(xì)胞活動(dòng)。mTORC1對(duì)蛋白質(zhì)合成調(diào)控主要通過(guò)mTORC1靶蛋白核糖體蛋白S6激酶（S6 kinase，S6K）1和真核起始因子4E結(jié)合蛋白（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein，4EBP）1的磷酸化，而脂質(zhì)合成則由mTORC1激活膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element-binding protein，SREBP）1/2引起[3]。在自噬方面，mTORC1抑制轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）EB的細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移和活性，在一定程度上抑制自噬活動(dòng)[4]。

2 自噬

自噬是細(xì)胞吞噬過(guò)量或有缺陷的細(xì)胞器，在溶酶體中將其降解為最基本的允許循環(huán)利用的小分子，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自我更新的生理過(guò)程。根據(jù)被降解的底物進(jìn)入溶酶體方式的不同，自噬分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。研究較多的為巨自噬，簡(jiǎn)稱自噬。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，細(xì)胞內(nèi)雙層隔離膜包裹待降解的細(xì)胞器，形成密閉的自噬體，隨后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，并將自噬體的內(nèi)囊泡釋放到囊腔中，在水解酶的作用下分解為小分子，供細(xì)胞循環(huán)利用。如果細(xì)胞發(fā)生自噬缺陷，可能引起多種疾病發(fā)生，如腫瘤、自身炎癥性疾病[5]、風(fēng)濕性疾病等[6]。

在形成自噬體的過(guò)程中，自噬相關(guān)基因（autophagy-related gene，ATG）發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[7]，ATG蛋白參與自噬體的形成、吞噬泡的伸長(zhǎng)以及介導(dǎo)自噬體與溶酶體的結(jié)合。大多數(shù)核心ATG蛋白被募集到自噬體的形成位點(diǎn)，即吞噬泡裝配位點(diǎn)（phagophore assembly site），促進(jìn)自噬體形成。在這一過(guò)程中，哺乳動(dòng)物ATG1蛋白家族中UNC-51樣激酶（Unc-51-like kinase，ULK）1、ULK2，以及mATG13，與粘著斑激酶家族相互作用蛋白（focal adhesion kinase family interacting protein，F(xiàn)IP）200形成復(fù)合物，同樣參與自噬體在吞噬泡裝配位點(diǎn)的起始調(diào)節(jié)。此外，啟動(dòng)自噬還需要PI3K/Vps34復(fù)合物Ⅰ的參與。吞噬泡的伸長(zhǎng)延伸過(guò)程則涉及ATG12和ATG8（LC3）兩種重要的泛素樣蛋白。脂質(zhì)形式的LC3（LC3-Ⅱ）還能附著于自噬體的雙層膜上，介導(dǎo)自噬體與溶酶體的融合。

3 mTORC1調(diào)控的自噬對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)

3.1 mTORC1在自噬中的調(diào)控機(jī)制

mTORC1在自噬中起著重要的調(diào)節(jié)作用。mTORC1對(duì)自噬的調(diào)節(jié)涉及ULK1復(fù)合體的參與。ULK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在自噬誘導(dǎo)早期起著關(guān)鍵作用。在營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下，mTORC1結(jié)合到ULK1復(fù)合物中，隨后磷酸化ULK1和ATG13，抑制自噬活性；而在營(yíng)養(yǎng)缺乏狀況下，mTORC1從與ULK1復(fù)合物的結(jié)合中分離出來(lái)，導(dǎo)致ULK1去磷酸化及活性增加，而后磷酸化ATG13和FIP200，啟動(dòng)自噬體的形成，介導(dǎo)自噬發(fā)生[8]。當(dāng)自噬溶酶體內(nèi)的吞噬物被水解酶降解，產(chǎn)生的氨基酸可將固定在溶酶體上的RagA/B GDP-RagC/D GTP異二聚體轉(zhuǎn)化為RagA/B GTP-RagC/D GDP的形式，介導(dǎo)了mTORC1的Raptor亞基與Rag-Ragulator復(fù)合體的結(jié)合，從而抑制自噬。另外，p62蛋白（又稱SQSTM1蛋白）是一種選擇性自噬接頭蛋白，也參與自噬的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過(guò)程。p62和Rag GTP酶形成的特殊復(fù)合物也可將mTORC1吸附至溶酶體表面，并響應(yīng)氨基酸信號(hào)，促進(jìn)RagA/B GTP-RagC/D GDP的形成[9]。而mTORC1被p62激活后，又磷酸化其底物S6K1和eIF4E結(jié)合蛋白，從而抑制自噬發(fā)生相關(guān)蛋白，負(fù)向調(diào)控自噬。

3.2 mTORC1/自噬參與對(duì)骨代謝的調(diào)控

mTORC1介導(dǎo)的自噬效應(yīng)在骨代謝過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用。骨代謝為骨相關(guān)細(xì)胞的代謝活動(dòng)，參與代謝的細(xì)胞主要有成骨細(xì)胞（osteoblast）、破骨細(xì)胞（osteoclast）、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cell）以及骨細(xì)胞等，其中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分別通過(guò)形成新骨和吸收舊骨，使骨組織處于動(dòng)態(tài)平衡中[10]。多數(shù)研究表明，mTORC1受雷帕霉素抑制后，骨組織中的自噬水平提高，改善了骨代謝。

3.2.1 mTORC1正向調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞成骨向分化 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的前體，負(fù)責(zé)骨的形成、生長(zhǎng)和發(fā)育[11]。成骨細(xì)胞受損以及脂肪生成增加可能引起骨穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致骨量減少，骨髓脂肪堆積，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[12]。而通過(guò)成骨細(xì)胞特異性敲除或雷帕霉素治療以阻斷mTOR信號(hào)傳導(dǎo)，可以改善成骨分化并抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的脂肪細(xì)胞向分化來(lái)逆轉(zhuǎn)肌原纖維蛋白1缺陷小鼠的骨質(zhì)減少表型[13]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[14]揭示，雷帕霉素通過(guò)提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自噬水平，能夠改善卵巢切除術(shù)后小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能，提高細(xì)胞再生能力，部分恢復(fù)小鼠低骨量表型，在一定程度上抑制骨質(zhì)疏松。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)[15-16]表明，在成骨細(xì)胞中應(yīng)用雷帕霉素抑制mTORC1后，細(xì)胞自噬水平提高，同時(shí)成骨活性也增加，促進(jìn)了骨形成。

自噬環(huán)節(jié)受到抑制會(huì)影響成骨。Piemontese等[17]發(fā)現(xiàn)，在小鼠成骨細(xì)胞中條件性敲除編碼自噬相關(guān)蛋白ATG7的基因后，細(xì)胞成骨活性下降，小鼠股骨、脊椎和總體骨密度降低，增加了骨折發(fā)生。同時(shí)，成骨細(xì)胞自噬功能受抑制還會(huì)影響骨細(xì)胞的形態(tài)和功能，細(xì)胞核呈圓形并偏離中心，而這種破壞可導(dǎo)致骨量和結(jié)構(gòu)受影響，從而降低骨強(qiáng)度。研究[18]發(fā)現(xiàn)，自噬在成骨細(xì)胞生長(zhǎng)、分化過(guò)程中并不呈現(xiàn)同一水平。在成骨細(xì)胞匯聚成團(tuán)、形成結(jié)節(jié)階段，自噬水平明顯高于細(xì)胞增殖和分化早期，抑制該時(shí)期特殊蛋白FIP200會(huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化末期受到抑制，使小鼠骨骼發(fā)育受到損害。

mTORC1/自噬通路參與一些常見信號(hào)分子對(duì)骨的調(diào)控。一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）可通過(guò)早期mTOR抑制介導(dǎo)的自噬和后期AKT/mTOR信號(hào)軸的晚期激活來(lái)調(diào)控人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[19]。而PI3K/AKT/mTOR信號(hào)級(jí)聯(lián)可以通過(guò)高劑量慢性飲酒來(lái)激活。同時(shí)在小鼠模型中觀察到成骨分化減少，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪細(xì)胞向分化加強(qiáng)和骨質(zhì)減少[20]。同樣，當(dāng)體內(nèi)外成骨細(xì)胞發(fā)生自噬缺陷時(shí)，細(xì)胞成骨能力和礦化水平均降低，這可能由成骨細(xì)胞中自噬泡運(yùn)輸過(guò)程被阻斷引起的礦化減少所致[21]。

相反，也有觀點(diǎn)認(rèn)為，mTORC1抑制介導(dǎo)的自噬激活并不利于骨量調(diào)節(jié)，抑制自噬反而可能促進(jìn)成骨分化[22]。Fitter等[23]建立前成骨細(xì)胞特異性Raptor基因敲除小鼠模型，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明廢除mTORC1功能導(dǎo)致成骨潛能下降，表現(xiàn)為低骨量的成骨表型。這可能與mTORC1在生物形成中的基礎(chǔ)作用有關(guān)。mTORC1參與轉(zhuǎn)錄和翻譯等過(guò)程，調(diào)控蛋白質(zhì)的形成[24]。當(dāng)敲除Raptor基因后，mTORC1無(wú)法為細(xì)胞分化提供必需蛋白質(zhì)，從而阻斷前成骨細(xì)胞的成骨分化過(guò)程。

3.2.2 mTORC1/自噬對(duì)破骨細(xì)胞可能存在雙向調(diào)控 破骨細(xì)胞功能也受到mTORC1/自噬的調(diào)控[25]。在高糖（30.5 mmol·L-1）環(huán)境中，RAW264.7細(xì)胞中AMPK的磷酸化水平下降，促進(jìn)了mTOR磷酸化，致使ULK1磷酸化水平降低，進(jìn)一步引起LC3Ⅱ含量下降，抑制破骨發(fā)生。雷帕霉素處理提高了細(xì)胞自噬水平，破骨細(xì)胞數(shù)目也隨之增多[26]。另外，抑制自噬還可能會(huì)廢除它對(duì)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（tumor necrosis factor receptorassociated factor，TRAF）3的降解作用，延遲破骨細(xì)胞在體內(nèi)外成熟[27]。TRAF3是一種阻止破骨分化的細(xì)胞內(nèi)因子，在自噬過(guò)程中被溶酶體降解。當(dāng)自噬受抑制后，TRAF3降解過(guò)程中斷，不利于破骨細(xì)胞分化。

然而，有研究表明自噬激活反而會(huì)對(duì)破骨細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)作用。核因子κB受體活化因子配體（nuclear factor κB receptor activator ligand，RANKL）/核因子κB受體活化因子（nuclear factor κB receptor activator，RANK）途徑對(duì)于破骨分化至關(guān)重要。成骨細(xì)胞上RANKL通過(guò)與破骨細(xì)胞前體上的RANK結(jié)合介導(dǎo)骨吸收，此過(guò)程可被骨保護(hù)素（osteoprotegerin）抑制[28]。據(jù)報(bào)道[29]，骨保護(hù)素通過(guò)磷酸化AMPK，促進(jìn)TSC1/2復(fù)合物的形成，其下游mTORC1接受信號(hào)后抑制Rheb表達(dá)，促進(jìn)自噬，然而卻抑制破骨細(xì)胞分化及破骨吸收活性，且雷帕霉素的應(yīng)用導(dǎo)致破骨細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步下降。在Raptor缺陷型骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)中，觀察到較低的mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)和延遲的破骨細(xì)胞分化，而組成性激活的S6K1可避免破骨細(xì)胞受損，促其分化。當(dāng)進(jìn)一步使用雷帕霉素抑制S6K1后，又抑制了破骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)[30]。另外，在對(duì)人類骨相關(guān)疾病的研究中，破骨細(xì)胞被認(rèn)為是畸形性骨炎（Paget’s disease of bone）的關(guān)鍵細(xì)胞，過(guò)度的骨吸收導(dǎo)致畸形性骨炎患者局灶性和無(wú)序性骨轉(zhuǎn)換增加[31]。在畸形性骨炎患者的破骨細(xì)胞中，mTORC1的表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，同時(shí)細(xì)胞存在自噬缺陷，包括自噬體形成受抑制和自噬清除缺陷。而3-磷酸肌醇依賴蛋白激酶（3-phosphoinositide-dependent protein kinase，PDK）1可通過(guò)mTORC1/自噬調(diào)節(jié)作用，部分影響破骨細(xì)胞表型。當(dāng)抑制畸形性骨炎患者破骨細(xì)胞的PDK1后，mTORC1的表達(dá)降低，細(xì)胞表現(xiàn)出更高的LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值，骨吸收能力受抑制[32]。這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了mTORC1/自噬通路在維持骨穩(wěn)態(tài)中的重要作用，mTORC1/自噬通路作為調(diào)節(jié)破骨分化和骨吸收的雙刃劍，可能是骨相關(guān)疾病的治療靶點(diǎn)。

3.2.3 mTORC1/自噬對(duì)骨細(xì)胞的調(diào)控尚未明確 目前，關(guān)于mTORC1/自噬在調(diào)節(jié)骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中作用的研究仍然有限。之前研究[33]表明，mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)可能參與骨細(xì)胞間的細(xì)胞通訊，間隙連接蛋白connexin（Cx）43是一種主要的半通道蛋白，可維持相鄰骨細(xì)胞間的樹突狀連接和骨穩(wěn)態(tài)。地塞米松抑制AKT-mTORC1信號(hào)會(huì)導(dǎo)致Cx43的降解[34]。在自噬激活后，Cx43被內(nèi)吞到自噬溶酶體中并通過(guò)自噬降解，導(dǎo)致樹突狀連接縮短且樹突連接減少，損害了骨細(xì)胞間的細(xì)胞通訊。

有趣的是，mTORC1/自噬在骨細(xì)胞中的作用也有相反的研究報(bào)道[35]，抑制骨細(xì)胞的自噬功能可能會(huì)引起細(xì)胞的低骨量表型。而使用雷帕霉素至少部分通過(guò)激活骨細(xì)胞的自噬來(lái)降低老年雄性大鼠骨小梁衰退程度，表明雷帕霉素可能是老年骨質(zhì)疏松癥的可行治療藥物[36]，但關(guān)于mTORC1/自噬信號(hào)與骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)間的關(guān)系還需進(jìn)一步的研究。

4 小結(jié)

mTORC1介導(dǎo)的自噬作用通過(guò)對(duì)各種骨相關(guān)細(xì)胞（如成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞）的活性、功能進(jìn)行調(diào)控，影響骨代謝過(guò)程，其中涉及多種信號(hào)分子的調(diào)節(jié)，在骨組織代謝過(guò)程中起到重要作用。mTORC1或自噬的任一環(huán)節(jié)發(fā)生異常，都可能引起細(xì)胞活性、功能異常并導(dǎo)致疾病的發(fā)生。應(yīng)用抑制劑（如雷帕霉素）或調(diào)控內(nèi)源性信號(hào)分子能夠抑制mTORC1，從而提高自噬在骨組織中的水平。然而，目前研究顯示mTORC1抑制引起的自噬水平提高并不完全有利于骨量調(diào)節(jié)，這可能與不同研究中mTORC1的抑制水平和自噬活化水平區(qū)別較大有關(guān)，接近極值的水平可能會(huì)影響細(xì)胞的基礎(chǔ)功能，從而呈現(xiàn)相反結(jié)果，且細(xì)胞生長(zhǎng)、分化不同階段的自噬水平也不一致。不同細(xì)胞間的研究結(jié)果表明了mTORC1/自噬信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，進(jìn)一步深入探究mTORC1/自噬信號(hào)及其上下游轉(zhuǎn)錄因子的系列分子事件尤為重要，其結(jié)果有望為人類骨疾病的治療和預(yù)防提供新思路。