動(dòng)物血清的成分及在細(xì)胞培養(yǎng)中的作用

石嘉琛，王家敏，喬自林 *

（1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

20世紀(jì)50年代，研究人員開(kāi)始將血清作為一種細(xì)胞培養(yǎng)基添加物使用，獲得了良好的培養(yǎng)效果。添加血清的培養(yǎng)基的效果與未添加血清的培養(yǎng)基相比，細(xì)胞活率更高，生長(zhǎng)密度更大，持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間更長(zhǎng)。一些要求較高的細(xì)胞需要在培養(yǎng)體系加入自體血清，如大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞[1]、豬耳緣成纖維細(xì)胞[2]等。新生牛血清或胎牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的生長(zhǎng)補(bǔ)充劑，主要是因?yàn)樗哂懈咚降纳L(zhǎng)刺激因子和低水平的生長(zhǎng)因子。使用牛血清作為培養(yǎng)基添加劑在建立原代細(xì)胞培養(yǎng)、維持器官/組織外植體和干細(xì)胞繁殖的情況下仍然是必要的，因?yàn)檠寰哂写龠M(jìn)分化的功能，還具有運(yùn)輸攜帶激素（如轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）、礦物質(zhì)和微量元素（如轉(zhuǎn)鐵蛋白）和脂質(zhì)的蛋白質(zhì)的功能，且含有貼附和擴(kuò)散因子，在維持pH值或直接抑制蛋白酶作用方面也有一定效果，使用血清就不需要為每個(gè)細(xì)胞系和菌種優(yōu)化培養(yǎng)基，這可節(jié)省大量人力物力，加快研究進(jìn)程[3]。

1 血清所含成分對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響

血清組成成分十分復(fù)雜，包含蛋白質(zhì)，多肽，激素等一些細(xì)胞生長(zhǎng)的有益因子，如白蛋白可作為載體蛋白攜帶小分子物質(zhì)，維持細(xì)胞生長(zhǎng)，還具有緩沖pH的作用?？赡芪廴静《?、支原體等外源微生物的新生牛血清可通過(guò)滅能處理進(jìn)行滅活，但同時(shí)可能使血清內(nèi)有利于細(xì)胞培養(yǎng)的生物活性物質(zhì)變性降解，從而影響細(xì)胞的培養(yǎng)[4]。一項(xiàng)關(guān)于胎牛血清組成的研究表明，隨著時(shí)間的增加，幾種細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)構(gòu)蛋白的數(shù)量以及營(yíng)養(yǎng)相關(guān)蛋白、細(xì)胞擴(kuò)散蛋白的數(shù)量都會(huì)發(fā)生變化，這種差異性不僅迫使大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行他們自己的胎牛血清和新生牛血清篩選，并且在此之后使用“預(yù)先選擇”的批次，它也常常使不同研究者的數(shù)據(jù)處理變得困難[5]。

2 血清濃度對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響

在一定范圍內(nèi)，提高細(xì)胞培養(yǎng)基含有的血清含量，可促進(jìn)細(xì)胞分化速度,但血清濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)異常[6]。一般來(lái)講，在培養(yǎng)基中添加5%～20%的血清可滿足絕大多數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。采用T75方瓶和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)PK15細(xì)胞時(shí)只需要在培養(yǎng)基中添加5%的血清即可生長(zhǎng)狀態(tài)良好，經(jīng)過(guò)72 h的培養(yǎng)后，細(xì)胞增長(zhǎng)倍數(shù)均為10倍以上[7]。

細(xì)胞在含有一定培養(yǎng)基血清濃度的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，血清所含的生長(zhǎng)因子可維持細(xì)胞的快速生長(zhǎng)，有助于阻止細(xì)胞的機(jī)械損傷[8]。一項(xiàng)培養(yǎng)基中血清添加量對(duì)于成纖維細(xì)胞的影響表明，10%血清濃度條件下成纖維細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，增殖速率較高，但40%血清濃度對(duì)成纖維細(xì)胞有損害作用，出現(xiàn)了細(xì)胞數(shù)量下降的現(xiàn)象[9]，肝細(xì)胞原代培養(yǎng)中血清濃度為20%時(shí)會(huì)對(duì)肝細(xì)胞造成一定傷害[10]。血清是細(xì)胞生物制品生產(chǎn)中的主要成本，幼小倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK21細(xì)胞）經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的馴化可以逐步適應(yīng)低血清培養(yǎng)條件，但其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝速率、乳酸和氨的積累速度降低[11]。添加15%FBS的培養(yǎng)基可取得較好的牛原代肌衛(wèi)星細(xì)胞和前體脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)效果[12]。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)是疫苗生產(chǎn)中常用的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方式，豬乙型腦炎病毒可在Vero細(xì)胞中增殖，維持液的血清濃度不僅影響細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)病毒效價(jià)也有一定影響，血清濃度在1%～4%范圍內(nèi)時(shí)，病毒毒價(jià)隨濃度升高而升高，維持液血清濃度超過(guò) 4%后，毒液的效價(jià)下降[13]。

3 血清種類(lèi)對(duì)培養(yǎng)效果的影響

血清根據(jù)來(lái)源動(dòng)物品種不同可分為人血清、馬血清和牛血清等。牛血清來(lái)源較豐富，目前廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)。牛血清制品可分為小牛血清、新生牛血清和胎牛血清，在這三種血清制品中，胎牛血清品質(zhì)最高，胎牛因未接觸到外界，血清中的細(xì)胞毒害成分最少，但其價(jià)格在牛血清中是最為昂貴的[15]。

胎牛血清（Fetal Bovine Serum，簡(jiǎn)稱(chēng)FBS）是經(jīng)心臟采集230～240日齡的胎牛全血，分離血清，經(jīng)濾過(guò)除菌制成，是疫苗生產(chǎn)的重要原輔料之一[18]。胎牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中效果最好的天然培養(yǎng)基，可提供細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子，還能發(fā)揮酸堿緩沖液作用[17]。新生牛血清指采集出生時(shí)間小于24 h的健康牛犢的血清，它是細(xì)胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，含有血小板促生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，在可獲得較好的細(xì)胞生長(zhǎng)增殖效果[19]。

目前市場(chǎng)上血清種類(lèi)繁多，李自良等[15]對(duì)國(guó)產(chǎn)胎牛血清、進(jìn)口胎牛血清、國(guó)產(chǎn)新生牛血清對(duì)MDCK細(xì)胞促生長(zhǎng)效果做了相關(guān)研究，結(jié)果表明，國(guó)產(chǎn)新生牛血清可連續(xù)傳代MDCK細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，排列緊密，不同代次MDCK細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層時(shí)細(xì)胞形態(tài)基本一致，但新生牛血清的有效集落數(shù)低于胎牛血清，這可能與二者所含的激素和其他活性物質(zhì)等組分與比例不同有關(guān)。王梅珂等對(duì)于國(guó)產(chǎn)血清和進(jìn)口血清對(duì)于Vero細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞匯合度的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)的一批血清細(xì)胞收獲量值大于3.00×108個(gè)/ml，且細(xì)胞相對(duì)增長(zhǎng)率大于90%，與進(jìn)口血清促細(xì)胞生長(zhǎng)效果相近，可替代進(jìn)口血清[16]。

4 細(xì)胞培養(yǎng)使用血清存在的不足

牛血清來(lái)源廣，即便是同一來(lái)源，同一批次的血清質(zhì)量也存在很大差異，具有因化學(xué)、蛋白質(zhì)方面差異和內(nèi)分泌參數(shù)的血清變異性，這提示我們?cè)诮忉屖褂醚逖a(bǔ)充劑可能具體定量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾或調(diào)節(jié)，血清作為細(xì)胞生長(zhǎng)和維持的重要物質(zhì)，在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)揮重要作用的同時(shí)，也帶有許多至今無(wú)法解決的問(wèn)題和弊端[20]，如血清中成分復(fù)雜，不能準(zhǔn)確加以區(qū)分血清批次間差異很大，且血清的保存期短，給批次生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化和連續(xù)化帶來(lái)限制。牛血清在使用時(shí)需要低溫儲(chǔ)存，然后解凍使用，血清中的脂蛋白產(chǎn)生沉淀，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值流失，從而影響細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，造成細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。

生物技術(shù)的發(fā)展、生物醫(yī)學(xué)的進(jìn)步都離不開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)，很多牛血清供應(yīng)商為小型企業(yè)，質(zhì)檢存在很多局限性，且生產(chǎn)環(huán)境是否合格無(wú)菌，設(shè)備的科技程度也因成本的限制而存在問(wèn)題。2000年10月1日，《中國(guó)生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》開(kāi)始實(shí)施，牛血清質(zhì)量雖有提升，但影響牛血清質(zhì)量的主要因素是大腸桿菌或噬菌體的污染，其次是細(xì)胞增殖檢查及細(xì)菌內(nèi)毒素[21]。此外，血清在培養(yǎng)基中的存在使產(chǎn)品的分離純化變得更加復(fù)雜，牛血清作為細(xì)胞培養(yǎng)常用的天然培養(yǎng)基，其成本較高，且易被外界的雜菌污染[22]。牛血清蛋白可能內(nèi)化在干細(xì)胞上，刺激產(chǎn)生免疫原性，因此，可能會(huì)產(chǎn)生許多潛在的問(wèn)題，如病毒和朊病毒的傳播，或由于牛蛋白附著在細(xì)胞上而引起的免疫反應(yīng)，這些細(xì)胞在移植后充當(dāng)抗原基質(zhì)。

5 結(jié)語(yǔ)

血清作為細(xì)胞培養(yǎng)中大量使用的培養(yǎng)基添加物，具有其他物質(zhì)無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，使用血清最大的缺點(diǎn)是其未經(jīng)測(cè)試的生物安全性和補(bǔ)充基本培養(yǎng)基的額外成本，針對(duì)這些問(wèn)題，需要制定一個(gè)全面，科學(xué)的血清生產(chǎn)行業(yè)規(guī)范，加速產(chǎn)業(yè)升級(jí)，使用血清替代品，主要是使用化學(xué)確定的培養(yǎng)基，可減輕風(fēng)險(xiǎn)，但目前血清仍然是建立和維持原代細(xì)胞系和連續(xù)細(xì)胞系的過(guò)程中使用最廣泛的添加物，對(duì)其化學(xué)組分的不明確也制約著血清的生產(chǎn)和質(zhì)量把控，一旦成分明確，相信血清將會(huì)成為生命科學(xué)研究中的一把利器。