數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)在病原微生物檢測中的應(yīng)用進(jìn)展*

劉譯利 綜述，高 晶 審校

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200011;2.上海健康醫(yī)學(xué)院,上海 201318)

數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是一種新興核酸檢測技術(shù)，其利用分割技術(shù)將核酸分子移入獨(dú)立的反應(yīng)單元中并進(jìn)行擴(kuò)增，在結(jié)果統(tǒng)計(jì)中加入泊松分布公式的應(yīng)用，從而提升檢測效能。數(shù)字PCR技術(shù)不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對核酸的定量不依賴循環(huán)閾值(Ct值)與標(biāo)準(zhǔn)品，打破了先前核酸檢測技術(shù)定量拷貝數(shù)的傳統(tǒng)方法，實(shí)現(xiàn)核酸拷貝數(shù)單分子層面的絕對定量。憑借其高靈敏度、高精確性等特點(diǎn)，數(shù)字PCR相對于熒光定量PCR，具有更廣闊的應(yīng)用前景。

1 數(shù)字PCR技術(shù)的原理

數(shù)字PCR是第3代核酸定量技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了核酸拷貝數(shù)從相對定量到絕對定量的突破。數(shù)字PCR通過將包含核酸分子的反應(yīng)體系均勻分配至獨(dú)立的反應(yīng)單元并進(jìn)行擴(kuò)增，采集終點(diǎn)熒光信號(hào)，根據(jù)有無熒光信號(hào)將反應(yīng)單元計(jì)為陽性或陰性。在理想狀態(tài)下，反應(yīng)體系被均勻離散，各反應(yīng)室中最多僅有1個(gè)核酸分子，而在實(shí)際操作中，反應(yīng)體系的目標(biāo)核酸水平較高或分配不均勻時(shí)，無法保證理想狀態(tài)得以實(shí)現(xiàn)，因此，對陽性反應(yīng)單元采用泊松分布公式進(jìn)行校正以減小誤差。隨著反應(yīng)單元數(shù)的增加，可以提高反應(yīng)的靈敏度和特異度，同時(shí)可以提高單分子的檢測效率，減少污染，降低成本。數(shù)字PCR根據(jù)其分配反應(yīng)體系方式的不同可以分為兩類[1]：微滴式數(shù)字PCR和微流控芯片式數(shù)字PCR。

2 數(shù)字PCR技術(shù)的特點(diǎn)

數(shù)字PCR技術(shù)作為新興的臨床檢測技術(shù)，與以往的技術(shù)比較，定量目標(biāo)核酸的方法不同，具有不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線、高靈敏度、高特異度等諸多優(yōu)點(diǎn)，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)比較，各方面均有不同。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是針對整個(gè)反應(yīng)擴(kuò)增過程實(shí)時(shí)采集并分析熒光信號(hào)，生成擴(kuò)增曲線，然后利用Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行核酸水平的定量分析。在臨床檢測中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)存在一定的局限性：對標(biāo)本類型與核酸模版水平要求相對較高，目前主要應(yīng)用于血液、尿液與肺泡灌洗液等背景簡單的標(biāo)本中，在檢測如糞便、痰液等背景復(fù)雜的標(biāo)本時(shí)，由于標(biāo)本與標(biāo)準(zhǔn)品間背景不同為檢測引入誤差[2]；部分標(biāo)本中存在反應(yīng)抑制劑，如血液抗凝劑、福爾馬林等，降低了擴(kuò)增效率，影響Ct值；標(biāo)本目標(biāo)核酸水平低于檢測限等因素均會(huì)影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的精確度與靈敏度,且各標(biāo)準(zhǔn)品水平存在差異，不僅為實(shí)驗(yàn)引入新誤差，還導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)可交換性差。

2.1不需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線 數(shù)字PCR采用終點(diǎn)熒光信號(hào)測量法，針對陽性反應(yīng)單元應(yīng)用泊松分布公式校正誤差，實(shí)現(xiàn)真正意義上單分子水平的絕對定量，提升各實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)的可互換性。此外，在2代測序技術(shù)(NGS)中，文庫的建立往往使用熒光定量PCR技術(shù)，但受其擴(kuò)增效率與標(biāo)準(zhǔn)曲線的限制導(dǎo)致文庫分子的定量不理想，數(shù)字PCR可測定模版的絕對水平與長度，并且擴(kuò)增過程不易發(fā)生錯(cuò)配，非常適合NGS文庫的質(zhì)量控制[3]。

2.2高靈敏度與高特異度 HUGGETT等[4]研究者在利用熒光定量PCR測定野生型DNA中罕見突變基因時(shí)，出現(xiàn)引物錯(cuò)配，野生型基因競爭性擴(kuò)增的現(xiàn)象，可檢測到的突變率為1%，數(shù)字PCR利用分區(qū)原理，降低了背景干擾，檢測下限突破至0.001%，較熒光定量PCR低了1 000倍[5-6]，輕松實(shí)現(xiàn)單分子核酸檢測。同時(shí)，數(shù)字PCR技術(shù)的分區(qū)處理還可提高對反應(yīng)抑制劑的耐受能力，降低其對擴(kuò)增結(jié)果的干擾。數(shù)字PCR的應(yīng)用意味著反應(yīng)體系從微升級(jí)至納升級(jí)的突破，在臨床應(yīng)用最廣泛的微滴式數(shù)字PCR的檢測系統(tǒng)(QX200)[7]中，可以將原體積為20 μL的標(biāo)本分配至多達(dá)20 000個(gè)反應(yīng)室中，即使是低豐度的目的序列也能被靈敏地檢測到。因此，在背景富集的檢測環(huán)境下，存在抑制劑或低豐度目標(biāo)核酸拷貝數(shù)的標(biāo)本檢測中，數(shù)字PCR均具有良好的靈敏度與特異度。目前，數(shù)字PCR已被用來檢測糞便標(biāo)本中的大腸埃希菌[8]。

2.3高精密度 除了不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線外，數(shù)字PCR的高精密度還歸功于泊松分布的應(yīng)用。泊松分布是指離散概率分布，反應(yīng)隨機(jī)分布狀態(tài)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，根據(jù)陽性反應(yīng)單元的個(gè)數(shù)及比例進(jìn)行結(jié)果校正，提升檢測精密度。數(shù)字PCR的定量是將有無熒光信號(hào)直接計(jì)為“陽性”或“陰性”，若目標(biāo)核酸沒有均勻離散，各反應(yīng)室中存在一個(gè)以上靶核酸，則檢測結(jié)果偏差較大，應(yīng)用泊松分布原理計(jì)算結(jié)果，可大幅度提高檢測精密度。

2.4步驟簡便，不需要擴(kuò)增前DNA處理 在熒光定量PCR技術(shù)中，提取DNA的步驟復(fù)雜且不同試劑盒的提取效率不同，對各實(shí)驗(yàn)室間的數(shù)據(jù)可比性及檢測精確度有一定影響。PAVSIC等[9]學(xué)者嘗試在數(shù)字PCR平臺(tái)上摒棄這一步驟，利用95 ℃熱處理直接降解病毒蛋白質(zhì)衣殼，釋放DNA，該方法較傳統(tǒng)提取方式避免了DNA的丟失，可得到更高水平的病毒，更接近實(shí)際檢測值。

2.5數(shù)字PCR技術(shù)臨床應(yīng)用的局限性 數(shù)字PCR作為一種新興的核酸檢測技術(shù)，在進(jìn)入臨床檢測前，尚需要進(jìn)行大量的性能驗(yàn)證，比對該前沿技術(shù)與傳統(tǒng)核酸檢測方法間結(jié)果的一致性，并解決質(zhì)量管理控制等問題，不斷優(yōu)化技術(shù)，確保檢測結(jié)果的可靠性。

在性能驗(yàn)證方面，TRYPSTEEN等[10]和BOSMAN等[11]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，數(shù)字PCR少數(shù)反應(yīng)單元存在假陽性的現(xiàn)象，目前出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因還不得而知，有些學(xué)者猜測可能是閾值設(shè)置不當(dāng)導(dǎo)致的。此外，不精密的技術(shù)設(shè)計(jì)在檢測過程中可能帶來污染，由于數(shù)字PCR的高靈敏度，極微量的污染也可能造成結(jié)果誤差，并且當(dāng)前該技術(shù)無法單獨(dú)分離陽性反應(yīng)室而從中提取核酸，利用全基因組測序等方法研究假陽性液滴形成。另外，擴(kuò)增RNA基因時(shí)分區(qū)中可能包含未完全反轉(zhuǎn)錄的模板，取樣過程存在隨機(jī)誤差引起目的基因未被提取到等原因均有可能導(dǎo)致假陰性。在技術(shù)操作層面，目前數(shù)字PCR技術(shù)尚未實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化模式且操作繁瑣。如何避免實(shí)驗(yàn)過程中的污染是對技術(shù)人員極大的考驗(yàn)，因此，相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作人員的技術(shù)培訓(xùn)尤為重要。此外，反應(yīng)室中有限的標(biāo)本體積、有限的數(shù)量分區(qū)導(dǎo)致動(dòng)態(tài)檢測范圍局限；多重檢測能力低、試劑耗材昂貴等因素也導(dǎo)致了數(shù)字PCR技術(shù)尚未能廣泛應(yīng)用于臨床檢測中。

3 數(shù)字PCR技術(shù)在病原微生物檢測中的應(yīng)用

當(dāng)前數(shù)字PCR技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于臨床疾病的相關(guān)檢測中，如判斷慢性粒細(xì)胞白血病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[12]、器官移植的排斥反應(yīng)監(jiān)測與個(gè)性化治療[13]、無創(chuàng)產(chǎn)前診斷[14-15]、癌癥基因突變檢測[16-17]、腫瘤耐藥突變檢測[5]等方面。在臨床病原微生物檢測領(lǐng)域，數(shù)字PCR技術(shù)也有卓越的貢獻(xiàn)。首先，鑒于其高靈敏度，檢測標(biāo)本不需要利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)和鑒定方法，大幅度縮短了報(bào)告時(shí)間，為臨床診斷與治療爭取了時(shí)間，對傳染性疾病的快速診斷和控制起到了極大的作用；其次，病原體的載量與臨床疾病的發(fā)展、藥效評(píng)價(jià)和用藥量調(diào)整都息息相關(guān)，即使是微量的病原體載量波動(dòng)也具有重要的參考意義，數(shù)字PCR技術(shù)可對病原體精準(zhǔn)定量，已在病原微生物檢測方面展開了廣泛的研究。

3.1臨床罕見微生物鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1.1臨床難培養(yǎng)細(xì)菌的鑒定 臨床上鑒定細(xì)菌的方法主要有：細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定、血清學(xué)抗體檢測及核酸檢測等，其中利用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行核酸檢測是最快速、最安全、靈敏度與特異度均較高的方法，但影響該技術(shù)檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的因素較多。我國布魯菌病患者多在出現(xiàn)癥狀時(shí)自行服用抗菌藥物，導(dǎo)致病原菌血清水平較低，難以被檢測到。韓冰等[18]嘗試?yán)脭?shù)字PCR技術(shù)檢測布魯菌，可檢測到的拷貝數(shù)低至0.08 copy/μL，有效提高了低豐度標(biāo)本的病原菌檢出率。結(jié)核分枝桿菌是引起結(jié)核病的病原菌，可累及全身多處器官，其中以感染肺部導(dǎo)致肺結(jié)核最為常見，由于血液中僅存在極低載量的結(jié)核菌DNA，故一般檢測標(biāo)本局限于痰液標(biāo)本、深部痰液取樣困難度高、痰液標(biāo)本背景復(fù)雜等影響因素易導(dǎo)致檢測效能低下。宋能等[19]利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測結(jié)核菌CFP10基因序列，利用質(zhì)粒測得其最低檢測限為1.2 copy/μL，并選取20例結(jié)核菌感染患者，檢測其血液標(biāo)本中核酸絕對定量水平為3.4～94.0 copy/μL，靈敏度明顯高于熒光定量PCR技術(shù)。

3.1.2病毒檢測 新型冠狀病毒為β屬的冠狀病毒，被國際病毒分類委員會(huì)命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2。2019新型冠狀病毒肺炎是由新型冠狀病毒感染肺部為主要臨床表現(xiàn)的感染性疾病，數(shù)字PCR技術(shù)的高靈敏度與高特異度可提高復(fù)雜來源的環(huán)境標(biāo)本中痕量病毒核酸的檢出率，并且可避免因病毒變異而導(dǎo)致的引物、探針結(jié)合能力與擴(kuò)增效率下降。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，數(shù)字PCR技術(shù)對于低病毒載量的檢測相對于熒光定量PCR技術(shù)更具優(yōu)勢，對于早期疑似病例的篩查、及時(shí)阻斷傳染源、控制傳染病暴發(fā)與蔓延起到了至關(guān)重要的作用[20]。

早期數(shù)字PCR技術(shù)已應(yīng)用于定量檢測乙型肝炎(簡稱乙肝)病毒DNA，近期有學(xué)者在此基礎(chǔ)上將其用于定量乙肝病毒復(fù)制過程中的重要標(biāo)志物——超螺旋的共價(jià)、閉合、環(huán)狀DNA分子(cccDNA)檢測,cccDNA也是導(dǎo)致乙肝病毒慢性感染與停止抗病毒治療后復(fù)發(fā)的主要原因[21]。由于乙肝病毒DNA與cccDNA基因序列同源性較高，且在接受治療時(shí)cccDNA水平較低，因此需要選擇靈敏度高、特異性好的檢測方法以提高檢出率與精確度，相比熒光定量PCR技術(shù)最低檢測限為50 ng,數(shù)字PCR技術(shù)檢測限可低至1 ng，可監(jiān)測管理慢性肝炎患者發(fā)揮重要作用，更能滿足臨床檢測需求。

數(shù)字PCR技術(shù)除應(yīng)用于臨床上病毒的直接鑒定外，還參與到病毒疫苗的研發(fā)中，如定量減毒登革病毒血清[22]、評(píng)估嵌合人偏肺病毒表位的重組流感病毒免疫保護(hù)效果等[23]。

3.1.3寄生蟲檢測 當(dāng)前寄生蟲類感染性疾病仍是熱帶國家及發(fā)展中國家需要面臨的公共衛(wèi)生問題之一，臨床上顯微鏡鏡檢是主要的檢測寄生蟲感染的手段，但該方法耗時(shí)長，低豐度標(biāo)本檢出率低。此前，WEERAKOON等[24]研究了數(shù)字PCR技術(shù)直接檢測血吸蟲DNA的可行性，實(shí)驗(yàn)中以血清、尿液、唾液、糞便為標(biāo)本，檢測結(jié)果均具有良好的靈敏度，且可根據(jù)血吸蟲DNA的載量變化判斷患者的感染程度，由此證明數(shù)字PCR技術(shù)在血吸蟲疾病控制方面同樣起到了重要作用。

3.2微生物載量極低的定性定量檢測 數(shù)字PCR技術(shù)可用于檢測臨床原始標(biāo)本中水平較低的病原菌DNA，例如從血液標(biāo)本中直接檢測人乳頭瘤病毒(HPV)[25]、結(jié)核分枝桿菌等[26]，在70例宮頸癌患者血清標(biāo)本中有93%的標(biāo)本檢測到血液循環(huán)中低水平的HPV[25]，可實(shí)現(xiàn)感染早期的篩查與治療，檢測的無創(chuàng)性減輕了患者檢查的痛苦，且降低了傷口感染風(fēng)險(xiǎn)。近期，華山醫(yī)院在1項(xiàng)有關(guān)青光眼睫狀體炎綜合征的研究中利用數(shù)字PCR技術(shù)對患者房水標(biāo)本進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，數(shù)字PCR技術(shù)較熒光定量PCR技術(shù)的檢測效能更優(yōu)，尤其適合無菌體液標(biāo)本中的微量病毒檢測。此外，有學(xué)者鑒于數(shù)字PCR技術(shù)高靈敏度、高精確度等技術(shù)優(yōu)勢，有學(xué)者將其應(yīng)用于孕婦羊水[27]和腦脊液結(jié)核分枝桿菌的檢測中。

3.3感染性疾病病程變化及預(yù)后判斷方面的應(yīng)用 人類免疫缺陷病毒(HIV)感染患者在接受反轉(zhuǎn)錄病毒治療后即使抑制了血液中病毒繁殖，但存在于潛伏感染細(xì)胞中的HIV-DNA仍可維持HIV的低水平復(fù)制，通過檢測釋放于血液循環(huán)中低載量的HIV-DNA，可評(píng)估用藥療效與病程發(fā)展。BOSMAN等[11]利用數(shù)字PCR技術(shù)與熒光定量PCR技術(shù)對經(jīng)過治療后的患者進(jìn)行體內(nèi)殘余HIV-DNA檢測發(fā)現(xiàn)，數(shù)字PCR技術(shù)比熒光定量PCR技術(shù)具有更高的靈敏度，且對于高序列多樣性的標(biāo)本更具優(yōu)勢。有學(xué)者利用數(shù)字PCR技術(shù)檢出慢性阻塞性肺疾病患者痰液或肺泡灌洗液中存在的定植肺曲霉菌，提示及時(shí)檢出定植菌可有效預(yù)防呼吸系統(tǒng)疾病患者病情的進(jìn)一步惡化與反復(fù)，并且可提高預(yù)后效果[28]。此外，日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，可利用數(shù)字PCR技術(shù)的高靈敏度等特性對日本腦炎病毒及時(shí)進(jìn)行早期檢測，有效緩解了由于發(fā)病急、預(yù)后差的疾病特性帶來的嚴(yán)重后果[29]，大幅度降低了嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)病率和病死率。

3.4稀有基因突變的檢測 數(shù)字PCR技術(shù)在檢測野生型背景下的稀有突變基因方面也有明顯優(yōu)勢。相對于靈敏度低的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，數(shù)字PCR技術(shù)可檢測到早期痕量的稀有突變，例如檢測背景復(fù)雜的痰液標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌[30]，以及甲型流感病毒的耐藥性突變。我國是流感病毒的高發(fā)地區(qū)，使用數(shù)字PCR技術(shù)檢測甲型流感病毒對奧司他韋耐藥性突變的靈敏度可下降至0.1%[31]，對防止患者無效用藥，幫助臨床盡快采取針對性治療，降低傳染病傳播風(fēng)險(xiǎn)等均發(fā)揮了積極作用。

3.5數(shù)字PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)展 數(shù)字PCR技術(shù)檢測不需要憑借外部標(biāo)準(zhǔn)品即可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量的特性已被應(yīng)用于熒光定量PCR技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)品的測量[32]，美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院使用數(shù)字PCR技術(shù)標(biāo)定了巨細(xì)胞病毒標(biāo)準(zhǔn)品[33]，由于標(biāo)準(zhǔn)品的多樣性與水平的偏差導(dǎo)致熒光定量PCR技術(shù)各實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)缺乏可比性，標(biāo)準(zhǔn)化對于質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)的可靠性與可交換性起到了至關(guān)重要的作用。

4 小 結(jié)

數(shù)字PCR技術(shù)作為一種新興的核酸檢測技術(shù)，以其高靈敏度、高精確度及絕對定量的技術(shù)特點(diǎn)，在各檢測領(lǐng)域均顯示出不可比擬的優(yōu)勢，為目標(biāo)核酸絕對定量檢測帶來了歷史性進(jìn)步。在病原菌檢測方面，數(shù)字PCR技術(shù)可精確定量病原體載量，檢測罕見微生物，輔助臨床闡釋病程、藥效監(jiān)測、發(fā)現(xiàn)早期疾病。目前，數(shù)字PCR技術(shù)尚在發(fā)展初期，距離廣泛應(yīng)用于臨床檢測、取代實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)仍有許多問題需要解決，包括降低運(yùn)行成本、提高儀器自動(dòng)化程度、提高檢測通量、建立行業(yè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)等。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展、檢測平臺(tái)的不斷優(yōu)化，有效解決以上問題指日可待，數(shù)字PCR技術(shù)將擁有更廣闊的應(yīng)用前景。