耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

姚丹玲，朱衛(wèi)民

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，重慶 400016)

鮑曼不動(dòng)桿菌最常見于醫(yī)院環(huán)境，因極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力及高水平獲得耐藥的性質(zhì)，易引起院內(nèi)感染暴發(fā)流行。同時(shí)碳青霉烯類抗生素的廣泛不合理使用，耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌(Carbapenem resistantAcinetobacter baumannii,CRAB)檢出率逐年增加，其產(chǎn)生耐藥與碳青霉烯酶，外膜孔蛋白，外排泵，青霉素結(jié)合蛋白位點(diǎn)等因素密切相關(guān)。

1 碳青霉烯耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的流行現(xiàn)狀及耐藥趨勢(shì)

自2005年開始，國家性細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)逐步建立起來。2004—2005年我國CHINET監(jiān)測(cè)(中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè))對(duì)于鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性分析提示此菌對(duì)亞胺培南的耐藥率為34.9%，對(duì)美羅培南的耐藥率為43.2%[1]，2017CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)資料則顯示，這兩種藥物耐藥率已分別上升到66.7%和69.3%[2]，對(duì)多黏菌素B和替加環(huán)素的耐藥率較低。2011年以來通過抗菌藥物臨床應(yīng)用專項(xiàng)整治活動(dòng)，全國范圍內(nèi)抗菌藥物總的消耗量增幅持續(xù)減少，抗菌藥物總體使用強(qiáng)度降低，但碳青霉烯類藥物的消耗量和使用強(qiáng)度等指標(biāo)持續(xù)上升，直到目前我國各大醫(yī)院對(duì)此類藥物仍然存在過度依賴的現(xiàn)象。2011年作為分水嶺，通過2011年我國CHINET不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)顯示鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為65.2%和66.2%[3]，其2005年—2011年耐藥率增長速度與2011年—2017年耐藥率增長速度相比有明顯的倍數(shù)關(guān)系。同時(shí)在2005—2017年的連續(xù)監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌屬(86.0%～93.4%為鮑曼不動(dòng)桿菌)始終占居菌種總數(shù)的前七位，且存在逐年增加趨勢(shì)，其中河南、陜西、黑龍江、遼寧、湖北、湖南、云南耐藥率均較高，耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率及增長率均居于首位[4]。因?yàn)橹委熂?、院?nèi)爆發(fā)、資源浪費(fèi)等問題的存在，全球各個(gè)國家積極致力于控制耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌的流行，并共同努力防止其蔓延至全球。

2 碳青霉烯耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制

2.1 碳青霉烯酶

碳青霉烯酶的產(chǎn)生是耐藥的主要機(jī)制之一，其中最重要的是與屬于Ambler D類的碳青霉烯酶有關(guān)。

2.1.1 A類碳青霉烯酶

A類酶通過絲氨酸殘基滅活β-內(nèi)酰胺鍵，水解碳青霉烯類抗生素，包括KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemase)、GES(Guiana extendedspectrum)、SME(Serratiamarcescens enzyme)、IMI(imipenem-resistant)等幾種酶。KPC酶首次在腸桿菌科的肺炎克雷伯菌中被發(fā)現(xiàn)，具有KPC-2酶活性的肺炎克雷伯菌首次于2007年在浙江被報(bào)道[5]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有23種KPC酶基因，KPC酶的編碼基因位于質(zhì)粒上[6]，Martinez等[7]的研究指出腸桿菌科和銅綠假單胞菌分離株檢出的KPC酶通常與位于質(zhì)粒中的轉(zhuǎn)座子Tn 4401相關(guān)。這種水平性轉(zhuǎn)移的能力使KPC酶不再局限于腸桿菌科某些細(xì)菌中，鮑曼不動(dòng)桿菌中的發(fā)現(xiàn)也越來越多。GES酶同樣也是首次在肺炎克雷伯菌中被發(fā)現(xiàn)，其中GES-2、GES-14酶基因可水解碳青霉烯類抗生素，多項(xiàng)研究己從鮑曼不動(dòng)桿菌中分離得到了包括GES-11、GES-14、KPC-2、KPC-3、KPC-4、KPC-10等眾多酶基因。這表明GES酶和KPC酶已從腸桿菌科細(xì)菌向非發(fā)酵菌擴(kuò)散。

2.1.2 B類碳青霉烯酶

B類碳青霉烯酶又名金屬β-內(nèi)酰胺酶(metalloβ-lactamases,MBLs)，能水解除單環(huán)內(nèi)酰胺類以外的大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶類抗生素，B類酶包括IMP(imipenmase)、VIM(Verona intergon-encoded metallo-β-lactamase)、SIM(Seoulimipenemase)、NDM(New Delhi metallo-β-lactamase)等。

IMP酶已在世界范圍內(nèi)被廣泛報(bào)道，其基因型多達(dá)42種[8]，此類酶對(duì)頭孢菌素類與碳青霉烯類抗生素也有較強(qiáng)耐藥作用。其中大多數(shù)IMP酶介導(dǎo)的碳青霉烯類抗生素耐藥性報(bào)道來自亞洲的銅綠假單胞菌[9]相比于IMP酶，VIM型酶更為常見。1996年，VIM-2酶基因于銅綠假單胞菌中被發(fā)現(xiàn)[10]，此類基因最為常見，也是鮑曼不動(dòng)桿菌中最先發(fā)現(xiàn)的VIM酶。目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了37種VIM酶基因。VIM酶與IMP酶氨基酸序列同源性＜40%，且擁有相似的與底物結(jié)合的結(jié)構(gòu)，但VIM酶對(duì)于碳青霉烯類抗生素的親和力更勝IMP酶。

NDM酶的發(fā)現(xiàn)較前兩種酶晚，NDM-1酶基因于2008年首次發(fā)現(xiàn)。NDM-1酶基因與VIM-1酶基因和VIM-2酶基因具有最高的同源性。它是一種28kDa的單體蛋白，表現(xiàn)出與青霉素類和頭孢菌素類的緊密結(jié)合的特性[11]。一項(xiàng)泰國的研究表明，所有的blaNDM-1基因陽性的鮑曼不動(dòng)桿菌在其上游具有ISAba125插入序列[12]。

2.1.3 D類碳青霉烯酶

D類碳青霉烯酶，又名OXA類酶，但此類酶無法快速且完全的水解碳青霉烯類抗生素，對(duì)頭孢菌素類無水解能力，需合并其他耐藥機(jī)制才能對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。Kim等[13]的研究指出，OXA類酶引起耐藥與其上游存在一個(gè)插入序列(insertion sequence,IS)密切相關(guān)，IS通過提供啟動(dòng)子，高度表達(dá)碳青霉烯酶，使之耐藥水平升高。ISAba1序列最為常見，可以插入到blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51等基因上游，提高耐藥基因的表達(dá)能力，導(dǎo)致對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥，或增強(qiáng)耐藥程度，表現(xiàn)多重耐藥。臨床多項(xiàng)研究數(shù)據(jù)顯示blaOXA-23、blaOXA-51在大部分地區(qū)檢出率高，是重要的碳青霉烯酶基因型，同時(shí)blaOXA-24、blaOXA-58、blaOXA-143等基因型也存在一定檢出率。

世界范圍內(nèi)，blaOXA-23基因在產(chǎn)生耐藥的過程中起到至關(guān)重要的作用。blaOXA-23基因位于質(zhì)?；蛉旧w上，以質(zhì)粒為主，并且blaOXA-23的水平傳播較為頻繁[14]。轉(zhuǎn)座子在一個(gè)細(xì)菌內(nèi)或不同分離株之間的基因組位置傳播中發(fā)揮了重要作用[15]。至今為止已在鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)與blaOXA-23相關(guān)的四種主要轉(zhuǎn)座子，分別為 Tn2006，Tn2007，Tn2008，Tn2009[16-17]。而我國blaOXA-23的水平轉(zhuǎn)移主要與轉(zhuǎn)座子Tn2009 和質(zhì)粒PAZJ221 有關(guān)。研究指出除Tn2007轉(zhuǎn)座子以外的其他所有的轉(zhuǎn)座子，在blaOXA-23基因的上游均可見ISAba1插入序列[17]。

blaOXA-51基因是1996年在阿根廷的一株鮑曼不動(dòng)桿菌染色體上發(fā)現(xiàn)的，被認(rèn)為是鮑曼不動(dòng)桿菌的天然基因，對(duì)碳青霉烯類抗生素的水解能力較弱[18]。雖然blaOXA-51基因是在染色體上被發(fā)現(xiàn)的，但有研究表明，定位于質(zhì)粒的耐藥水平比定位在染色體的耐藥水平要高。原因可能是blaOXA-51基因上游 ISAba1提供強(qiáng)啟動(dòng)子，從而基因拷貝增多，耐藥水平升高[19]。有其他研究表明新的插入序列ISAba9與blaOXA-51基因過度表達(dá)相關(guān)，若blaOXA-51上游存在 ISAba9/ISAba1嵌合體元件，可使blaOXA-51基因表達(dá)水平較ISAba1單獨(dú)存在時(shí)升高8倍以上[20]。

2.2 外膜孔蛋白

外膜孔蛋白(outermembrane proteins,OMPs)，存在于革蘭陰性菌的細(xì)胞膜表面或鑲嵌其中，是外膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)上的一種特殊的通道蛋白，具有高度選擇性、允許親水小分子物質(zhì)通過。CarO蛋白(carbapenem-resistantassociated out membrane protein,CarO)、熱修飾蛋白(heat-modifiable protern,HMPAB)、外膜蛋白W(out membrane protein W,OmpW)、外膜蛋白A(out membrane proteinA,OmpA)等均是較常見的類型[21]。外膜孔蛋白的缺失或表達(dá)下調(diào)也是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的重要機(jī)制之一，通過阻礙抗生素進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)而形成耐藥。

CarO蛋白是碳青霉稀類抗生素耐藥相關(guān)外膜蛋白，2002年Limansky等[22]在重癥監(jiān)護(hù)室中分離出一株鮑曼不動(dòng)桿菌Ab242，該菌株對(duì)亞胺培南耐藥，但碳青霉烯酶陰性，通過對(duì)外膜蛋白進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該菌株在29kDa處有外膜蛋白的缺失，并將該外膜蛋白命名為CarO蛋白。并且后續(xù)通過更深一步的研究明確證實(shí)了CarO蛋白與耐藥相關(guān)。缺乏CarO蛋白原因多與插入元件對(duì)基因的破壞相關(guān)，常見的插入元件包括ISAba1，ISAba10，ISAba125和ISAba825等，從而改變外膜蛋白，減少抗菌藥物進(jìn)入菌體內(nèi)而導(dǎo)致耐藥。

熱修飾蛋白(HMP-AB)與銅綠假單胞菌的外膜蛋白OprF和大腸埃希菌的外膜蛋白OmpA有較高的同源性，允許抗菌藥物的通過[23]，參與高水平耐藥。同時(shí)，Sato等[24]的研究也指出鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株的數(shù)量與OmpA mRNA水平呈顯著正相關(guān)。

2.3 外排泵

外排泵由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、膜融合蛋白和外膜蛋白三個(gè)部分組成，與滲透屏障相互協(xié)同作用下泵出抗菌藥物，共同決定了細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)外的滲透數(shù)量。外膜孔蛋白和外排泵根據(jù)不同的特性選擇化合物，并共同保護(hù)細(xì)菌免受結(jié)構(gòu)多樣化的抗生素的影響[25]。在鮑曼不動(dòng)桿菌中的外排泵包括：耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化(resistance nodulation division,RND)超家族、主要易化子(major facilitator superfamily,MFS)超家族、多重藥物與有毒復(fù)合物外排(multidrug andtoxic compound extrusion,MATE )超家族等[26]。其中，RND超家族是不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌最主要也是最早發(fā)現(xiàn)的外排泵系統(tǒng)，在病原菌毒力因子的調(diào)節(jié)、排除細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡和細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面均有一定的作用。

2.4 青霉素結(jié)合蛋白位點(diǎn)

青霉素結(jié)合蛋白(penicillin-binding proteins,PBPs)是β-內(nèi)酰胺類抗生素的主要作用靶位，對(duì)于細(xì)胞壁生物的合成極其重要。研究指出在pH6.3～7.0之間，PBPs表達(dá)量的減少也考慮是鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥的重要原因之一[27]。Russo研究指出青霉素結(jié)合蛋白7/8(PBP-7/8)有助于鮑曼不動(dòng)桿菌在體內(nèi)體外存活[28]。

2.5 整合子

整合子捕獲外來耐藥基因，在啟動(dòng)子作用下得以表達(dá)，形成耐藥。在目前研究已知的IV型整合子中，I型最為常見，此類整盒子與多種耐藥基因密切相關(guān)，并且共含有6種基因盒[29]。但整合子I類攜帶的基因盒與對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥似乎沒有特殊關(guān)聯(lián)，更大程度是通過其他機(jī)制的協(xié)助作用，此結(jié)論也與Japoni等[30]的研究相符，故需要更多的研究來找到I類整合子與耐藥之間存在的聯(lián)系。

3 治療進(jìn)展

目前，治療CRAB的藥物有限，常規(guī)包括耐碳青霉烯類抗生素、替加環(huán)素、黏菌素、舒巴坦復(fù)方制劑等，通過藥物的單藥或聯(lián)合選擇組成不同治療方案以達(dá)到治療目的：加大碳青霉烯類抗生素劑量、單用替加環(huán)素或替加環(huán)素聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦較為常見。并且有研究表明替加環(huán)素聯(lián)合方案較單藥治療對(duì)體內(nèi)外的CRAB有更好的抗菌活性，能夠提高CRAB醫(yī)院獲得性肺炎的治療療效。但無論單用或聯(lián)合，均不能徹底清除細(xì)胞內(nèi)的鮑曼不動(dòng)桿菌[31]。針對(duì)于CRAB醫(yī)院獲得性肺炎，Liang最新研究表明基于替加環(huán)素的治療與非替加環(huán)素治療相比ICU死亡率更高。與替加環(huán)素單藥治療相比，黏菌素單藥治療可一定程度上降低ICU死亡率。故此研究提示新的治療思路：黏菌素單藥治療可能是CRAB醫(yī)院獲得性肺炎更好的抗生素策略[32]。

近日，有研究提出替加環(huán)素、環(huán)丙沙星、阿米卡星三聯(lián)制劑方案治療CRAB，此方案可降低單種抗菌藥物的劑量，有利于延遲替加環(huán)素耐藥菌的產(chǎn)生，降低藥物不良反應(yīng)，在一定程度上清除CRAB效果更好[33]，但這僅是體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，需要大量臨床應(yīng)用效果來證實(shí)這一結(jié)果，提高此結(jié)論的嚴(yán)謹(jǐn)性。

為達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，檢測(cè)技術(shù)也需與時(shí)俱進(jìn)：基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜分析技術(shù)作為一種快速易于操作的技術(shù)，可以直接從細(xì)菌菌落中快速鑒定碳青霉烯酶活性，從而輔助早期規(guī)范治療用藥[34]。

針對(duì)于耐藥現(xiàn)狀新型藥物研制也在積極進(jìn)行，BAL30072作為新型鐵載體單層表面活性劑，對(duì)多種碳青霉烯類抗生素耐藥細(xì)菌顯示出抗菌活性，特別是針對(duì)CRAB。Landman研究表明BAL30072同美羅培南或黏菌素合用使抗菌活性增加[35]，但仍需進(jìn)一步研究明確此藥物的潛在臨床效用。

西他沙星是一種廣譜口服氟喹諾酮類藥物，對(duì)于92%的CRAB具有抗菌活性，尤其是針對(duì)替加環(huán)素耐藥CRAB血液分離株[36]，由于黏菌素存在腎毒性，西他沙星被認(rèn)為是CRAB血流感染首選替代藥物。目前仍需要更多研究明確其臨床療效。

Eravacycline作為新型合成氟代環(huán)素，對(duì)CRAB的抗菌活性約為替加環(huán)素的2～4倍[37]。頭孢他啶/阿維巴坦、FADDI-287、Cefiderocol等多類藥物仍處于臨床前階段或臨床開發(fā)的早期階段，但新型藥物的研究極具潛力，將在未來作為治療CRAB的關(guān)鍵突破口。

4 結(jié)語

耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌在醫(yī)院的大量檢出，導(dǎo)致基礎(chǔ)疾病治療難度增加，住院時(shí)間明顯延長，尤其是ICU病房檢出率極高，致降低死亡率這一目標(biāo)難以實(shí)現(xiàn)。這成為全球關(guān)注的醫(yī)學(xué)問題，嚴(yán)重威脅感染性疾病的治療。鮑曼不動(dòng)桿菌通過產(chǎn)生碳青霉烯酶、改變外膜孔蛋白、增強(qiáng)外排泵活性、改變青霉素結(jié)合蛋白位點(diǎn)及整合子機(jī)制等因素的協(xié)同作用下，產(chǎn)生交叉耐藥或多重耐藥。針對(duì)嚴(yán)峻的耐藥形勢(shì)，首先，加強(qiáng)醫(yī)院感染管控，重視預(yù)防隔離及手衛(wèi)生以減少院內(nèi)傳播；其次，通過對(duì)其耐藥機(jī)制的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)已知或未知機(jī)制中的新切入點(diǎn)，如三聯(lián)方案達(dá)到延緩耐藥等治療新思路控制和減少耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌的產(chǎn)生，甚至有望達(dá)到恢復(fù)其對(duì)耐碳青霉烯類抗生素敏感性這一目標(biāo)；再者，在藥物局限的形勢(shì)下研發(fā)新型藥物，BAL30072、西他沙星、Eravacycline、頭孢他啶/阿維巴坦、FADDI-287、Cefiderocol等，為治療用藥提供更多選擇；最后，新檢測(cè)技術(shù)的實(shí)施輔助CRAB的 早期檢出。通過新思路、新藥物、新技術(shù)的協(xié)同作用，為臨床抗感染治療及新藥研制提供幫助，為耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌的治療帶來新希望。