干細(xì)胞及其外泌體治療早發(fā)性卵巢功能不全的研究進(jìn)展

劉夢宇，吳氫凱

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指女性在40周歲以前因妊娠以外的原因?qū)е绿崆伴]經(jīng)，并伴有血清雌激素下降、促性腺激素升高的特征。歐洲人類生殖和胚胎學(xué)學(xué)會（ESHRE）將POI定義為40周歲以下女性，因除妊娠以外的原因?qū)е麻]經(jīng)至少4個月，而且卵泡期血清檢查至少2次（2次檢查間隔時間30 d以上）出現(xiàn)卵泡刺激素（FSH）＞25 IU/L、雌二醇（E2）＜73.2 pmol/L[1]。對于FSH＞40 IU/L的患者過去又稱為卵巢早衰（premature ovarian failure，POF），該綜述對干細(xì)胞及其外泌體（exosomes）對POI及POF的最新研究進(jìn)展一并介紹。POI的病因較為復(fù)雜，仍有50%～90%的特發(fā)性患者未能明確病因，已知的病因包括：遺傳學(xué)因素、醫(yī)源性因素、自身免疫學(xué)、先天性酶缺乏、感染與環(huán)境因素等。對于自身免疫因素引起的POI患者，免疫抑制治療為其首選方式，但長期應(yīng)用仍存在免疫功能缺陷所致的各類風(fēng)險。目前臨床上對無明顯激素禁忌證的患者，均建議采取激素替代治療（hormone replacement therapy，HRT），至少應(yīng)用至平均絕經(jīng)年齡。雖然HRT可緩解因激素缺乏導(dǎo)致的更年期癥狀，但長期應(yīng)用也會增加血栓和腫瘤等風(fēng)險。同時，HRT并不能恢復(fù)卵巢的內(nèi)分泌和排卵功能，對有生育要求的患者無能為力。干細(xì)胞（stem cells）是一種具有自我更新能力及多向分化潛能的細(xì)胞，干細(xì)胞來源的外泌體是一種由干細(xì)胞分泌產(chǎn)生的微小囊泡，可攜帶多種生物活性物質(zhì)。近年來干細(xì)胞及其外泌體應(yīng)用于POI生物治療的研究日益增多，本文就不同干細(xì)胞及其外泌體對POI的生物學(xué)作用和可能的作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 干細(xì)胞應(yīng)用于POI治療

干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能、無限增殖能力的原始未分化細(xì)胞，根據(jù)其發(fā)生來源可分為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells）和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞來源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，在體外培養(yǎng)中仍具有向三胚層組織分化的潛能。但因其來源有限、體內(nèi)致瘤性強以及涉及倫理爭議等問題，在臨床應(yīng)用中受到限制。成體干細(xì)胞可來源于多種已分化組織中的未分化細(xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞等。成體干細(xì)胞具有來源豐富、免疫原性低、易于體外分離培養(yǎng)等特點，在多種組織修復(fù)和細(xì)胞治療領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。近年來，干細(xì)胞因其高度增殖、多向分化等優(yōu)勢被應(yīng)用于POI的研究中，并取得一定療效。

1.1 成體組織間充質(zhì)干細(xì)胞用于POI/POF治療

1.1.1 人骨髓干細(xì)胞（human bone marrow-derived stem cells，hBMDSCs） 及人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMMSCs） hBMDSCs是一組具有多向分化潛能的異質(zhì)性單核細(xì)胞，包括多種造血干細(xì)胞、hBM-MSCs和內(nèi)皮祖細(xì)胞。其中hBM-MSCs含量不足1%。

hBMDSCs及分離的hBM-MSCs在POF的研究中均有應(yīng)用。Herraiz等[2]將hBMDSCs經(jīng)尾靜脈注射入化療誘導(dǎo)POF小鼠及人卵巢移植小鼠（來自POF患者的卵巢皮質(zhì)組織）兩種動物模型體內(nèi)，可觀察到hBMDSCs對卵巢組織的多重再生作用，包括增加局部血管形成、增加卵泡和基質(zhì)細(xì)胞數(shù)目、恢復(fù)生育力等。相比hBMDSCs，hBM-MSCs在治療POF的研究中已取得大量成果。Bao等[3]發(fā)現(xiàn)POI小鼠接受hBM-MSCs治療后，卵巢內(nèi)各級卵泡數(shù)目增加、性激素水平和生育力均可得到恢復(fù)。目前更多的學(xué)者傾向于hBM-MSCs可向受損卵巢間質(zhì)組織遷移，但不向卵細(xì)胞分化，而是通過旁分泌途徑分泌相關(guān)細(xì)胞因子改善卵巢間質(zhì)微環(huán)境，促進(jìn)組織修復(fù)。例如：Khanmohammadi等[4]發(fā)現(xiàn)hBM-MSCs的條件培養(yǎng)基濃縮液可達(dá)到與hBM-MSCs相似的治療效果，提示旁分泌途徑在hBM-MSCs治療POF中也發(fā)揮了重要作用。對于hBM-MSCs作用機(jī)制的研究還包括：抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成、減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積從而抗卵巢組織纖維化、抑制炎癥反應(yīng)以及hBM-MSCs分化為卵巢顆粒樣細(xì)胞等。目前hBM-MSCs修復(fù)卵巢功能的作用已在多種動物模型上得到驗證，在臨床治療中，POF患者通過hBMMSCs移植后改善內(nèi)分泌水平、恢復(fù)排卵，甚至自然妊娠并分娩健康嬰兒的臨床案例也已有報道[5]。在迄今為止發(fā)表的3篇研究中，共有41例POF患者，其中接受自體hBM-MSCs移植后有3例成功妊娠[5-6]。

1.1.2 人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（human adipose derive mesenchymalstem cells，hADSCs） hADSCs 與hBM-MSCs具有相似的性質(zhì)，在不同條件下可誘導(dǎo)分化為多種中胚層來源細(xì)胞，并具有取材方便、可自體移植降低免疫排斥反應(yīng)的優(yōu)勢。在化療誘導(dǎo)POF小鼠中，Sun等[7]將hADSCs通過尾靜脈注射和雙側(cè)卵巢原位注射兩種方式對POF小鼠進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)hADSCs定位于卵巢間質(zhì)而非直接分化為卵泡結(jié)構(gòu)細(xì)胞，且小鼠排卵數(shù)目增加。在自然衰老小鼠模型中，Ding等[8]發(fā)現(xiàn)hADSCs分泌的肝細(xì)胞生長因子（HGF）與堿性成纖維生長因子（bFGF）可激活細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白1/叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1（SIRT1/FOXO1）信號通路，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善小鼠卵巢功能。除單獨使用hADSCs外，hADSCs還可與其他生物制劑聯(lián)合使用，進(jìn)一步提高治療效果。Su等[9]將可溶性膠原負(fù)載hADSCs后移植入卵巢組織中，延長hADSCs停留時間至4周，可較單一hADSCs移植取得更佳治療效果[10]，為探索hADSCs治療POI的機(jī)制提供重要線索。

1.1.3 人月經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞（human menstrual blood stem cells，hMenSCs） hMenSCs 是從人月經(jīng)血中分離的具有高度增殖能力的一類干細(xì)胞。hMenSCs及其條件培養(yǎng)基在抑制卵泡閉鎖、促進(jìn)激素恢復(fù)和提高小鼠生育力方面，取得了與其他間充質(zhì)干細(xì)胞相似的效果[11]，此外，hMenSCs與卵巢顆粒細(xì)胞還存在著密不可分的關(guān)系。Manshadi等[12]將細(xì)胞膜紅色熒光探針標(biāo)記的hMenSCs經(jīng)尾靜脈移植入POF大鼠體內(nèi)，可檢測到其定位在未成熟的卵泡顆粒細(xì)胞層內(nèi)，并增加了抗苗勒管激素（AMH）、FSH受體（FSHR）、雌二醇（E2）、孕酮（P4）的表達(dá)量，進(jìn)而對卵泡生成和排卵過程起調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步實驗表明，定位于卵巢內(nèi)的hMenSCs經(jīng)過卵巢組織微環(huán)境刺激，較未移植前hMenSCs可表達(dá)更多的與人卵巢組織相同的mRNA[13]?；煋p傷所致POF多數(shù)原因是由于卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，Yan等[14]發(fā)現(xiàn)體外實驗中化療藥物多柔比星的確可導(dǎo)致人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，但hMenSCs可通過抑制生長停滯DNA損傷可誘導(dǎo)蛋白 B（Gadd45b）、促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白 B1（CyclinB1）和CDC2蛋白表達(dá)，修復(fù)損傷的顆粒細(xì)胞。

1.1.4 卵巢生殖干細(xì)胞 長期以來，人們一直認(rèn)為成年哺乳動物自出生后，卵巢內(nèi)具有一定數(shù)量卵母細(xì)胞且不再產(chǎn)生新的卵母細(xì)胞。最近的證據(jù)表明，從成年小鼠和人類卵巢中均可在體外分離和培養(yǎng)出雌性生殖干細(xì)胞（female germline stem cells，F(xiàn)GSCs）。近來也報道卵巢皮質(zhì)層活組織切片中存在卵巢間充質(zhì)干細(xì)胞。經(jīng)基因分析表明，不同于成纖維細(xì)胞和hBMMSCs的是，卵巢間充質(zhì)干細(xì)胞還表達(dá)CD44、CD90和基質(zhì)細(xì)胞前體表面抗原1（stromal cell antigen-1，STRO-1）[15]。Wu 等[16]從增強綠色熒光蛋白（EGFP）轉(zhuǎn)基因鼠卵巢組織內(nèi)分離出鼠卵原干細(xì)胞并移植入POF小鼠體內(nèi)，觀察到卵巢干細(xì)胞具有向卵巢皮質(zhì)層歸巢定位的效應(yīng)，繼而可分化為早期卵母細(xì)胞，并具有和正常卵泡相似的發(fā)育過程，也可對受損卵巢起到修復(fù)作用。

1.2 胎兒附屬物來源的干細(xì)胞用于POI/POF治療胎兒附屬物是指在胎兒出生后，除胎兒以外的其他組織，包括胎盤、胎膜、臍帶和羊水，其中胎盤羊膜層、臍血和羊水均可分離出相應(yīng)間充質(zhì)干細(xì)胞。這類細(xì)胞具有取材方便、來源豐富及細(xì)胞增殖能力強等優(yōu)勢，是一種理想的干細(xì)胞來源。

1.2.1 人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（human placentaderived mesenchymal stem cells，hPMSCs） 目 前 ，對于hPMSCs治療POF的研究表明，hPMSCs主要通過免疫調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用。透明帶3多肽（pZP3）免疫損傷誘導(dǎo)的POF小鼠給予hPMSCs移植后，觀察到卵巢組織內(nèi)閉鎖卵泡減少，顆粒細(xì)胞凋亡減少，且AMH及FSHR表達(dá)均增加[17]。在機(jī)制研究方面，Yin等[18]認(rèn)為hPMSCs可以通過影響磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路、調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞17/細(xì)胞毒 T細(xì)胞 17（Th17/Tc17）與 Th17/調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（Treg）之間平衡，減少卵泡閉鎖及顆粒細(xì)胞凋亡。此外，hPMSCs對小鼠卵巢免疫調(diào)節(jié)的作用還包括抑制CD25+CD4+Treg細(xì)胞增殖及分泌功能、抑制γ干擾素（IFN-γ）和轉(zhuǎn)化生長因子 β（TGF-β）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)等，以上方式均可減輕自身免疫反應(yīng)對卵巢組織造成的損傷。除調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)外，移植hPMSCs后也可減輕由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激肌醇依賴性激酶1α（IRE1α）信號通路引起的顆粒細(xì)胞凋亡[19]。

1.2.2 人羊膜上皮細(xì)胞（human amniotic epithelial cells，hAECs） 及 人 羊 膜 間 充 質(zhì) 干 細(xì) 胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs） hAECs和hAMSCs是從人羊膜中分離出的兩種類似的干細(xì)胞群，兩者均具有早期外胚層細(xì)胞多能分化的特性，并且可在法律和倫理允許的范圍內(nèi)使用，因此hAECs和hAMSCs具有易獲取和非侵入性獲取等優(yōu)點，是用于同種異體移植和再生醫(yī)學(xué)的重要干細(xì)胞來源。Zhang等[20]研究表明hAECs及其條件培養(yǎng)基均可通過旁分泌途徑激活TGF-β/Smad通路、促進(jìn)血管生成，進(jìn)而修復(fù)卵巢功能。在hAECs培養(yǎng)基上清液中也檢測到多種與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、免疫應(yīng)答相關(guān)的活性物質(zhì)。Ding等[21]對自然衰老小鼠給予hAMSCs治療，發(fā)現(xiàn)hAMSCs通過分泌HGF和表皮細(xì)胞生長因子（EGF），促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖、抑制其凋亡進(jìn)而增加卵巢內(nèi)卵泡數(shù)目，恢復(fù)小鼠激素水平。以上研究表明hAECs和hAMSCs對小鼠卵巢功能均有一定的提升。Ding等[22]將hAMSCs與hAECs進(jìn)行對比研究，結(jié)果表明hAMSCs比hAECs能更有效地改善卵巢功能，其原因為hAMSCs的生物學(xué)特性（端粒酶活性、細(xì)胞因子及膠原蛋白分泌水平）更優(yōu)于hAECs。

1.2.3 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs） hUCMSCs 是一種從新生兒臍帶華通氏膠中分離出的多能干細(xì)胞，具有與hBM-MSCs相似的免疫表型。Song等[23]發(fā)現(xiàn)hUCMSCs可能通過分泌血管生長因子，如HGF、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血小板生長因子（PGF）、TGF-β等促進(jìn)卵巢修復(fù)。Zheng等[24]研究發(fā)現(xiàn)hUCMSCs可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)生長因子/神經(jīng)生長因子受體（NGF/TrkA）通路減少顆粒細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)卵巢功能恢復(fù)。hUCMSCs對卵巢的修復(fù)作用在化療誘導(dǎo)及自然衰老動物模型[25]中均已被報道。在臨床治療中，Ding等[26]發(fā)現(xiàn)hUCMSCs可通過磷酸化FOXO3、FOXO1，激活原始卵泡；將膠原蛋白負(fù)載的hUCMSCs移植入長期不孕的POF患者，觀察到hUCMSCs可促進(jìn)卵泡生成及活化、增加竇狀卵泡數(shù)目，并有1例成功妊娠。

1.2.4 人羊水干細(xì)胞（human amniotic fluid stem cells，hAFSCs） hAFSCs是從羊水中分離培養(yǎng)的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，而羊水可從產(chǎn)前診斷羊水穿刺時或分娩過程中收集獲得，取材相對簡單且不涉及倫理問題，但可能存在有創(chuàng)操作的風(fēng)險。Liu等[27]首次將hAFSCs注射入化療損傷POF小鼠模型體內(nèi)，并觀察到hAFSCs可在小鼠卵巢內(nèi)存活較長時間并繼續(xù)增殖。進(jìn)一步研究表明，hAFSCs可抑制小鼠卵泡閉鎖，促進(jìn)卵泡發(fā)育、改善血清激素水平以及改善小鼠生育狀況[28]。

1.3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS）iPS指通過導(dǎo)入人工誘導(dǎo)編程的方法使體細(xì)胞去分化為多能干細(xì)胞，iPS類似胚胎干細(xì)胞，具有強大的自我更新和多向分化潛能。Liu等[29-30]在體外通過轉(zhuǎn)染微小RNA-17-3p（miR-17-3p）成功將人iPS誘導(dǎo)分化為卵巢上皮樣細(xì)胞（ovarianepitheliallike cells，OSE），繼而將OSE移植入POF小鼠體內(nèi)，觀察到其不僅可以促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖、生長，還可維持卵巢微環(huán)境促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟。眾所周知，卵巢功能的恢復(fù)與卵巢顆粒細(xì)胞密不可分，將鼠iPS細(xì)胞與卵巢顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞雌激素分泌水平明顯提高[31]。

2 干細(xì)胞來源的外泌體用于POI/POF治療

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是一種可由多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生的微小膜泡，具有脂質(zhì)雙分子膜結(jié)構(gòu)，其內(nèi)攜帶多種生物活性物質(zhì)，如生長因子、活性蛋白、mRNAs、長鏈非編碼 RNA（lncRNAs）、微小RNA（miRNAs）等，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊可發(fā)揮促進(jìn)組織損傷修復(fù)、影響腫瘤生長遷移等作用[32-33]。細(xì)胞外囊泡包含多種亞群，根據(jù)其合成及釋放途徑可分為：起源于細(xì)胞內(nèi)體的外泌體，直徑在30～150 nm之間，密度約為1.11～1.19 g/mL；衍生于細(xì)胞質(zhì)膜的微囊泡（microparticles/microvesicles）。但因目前針對EVs不同亞群標(biāo)志物尚未形成共識，在可證明其特定起源位置之前，國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會（ISEV）推薦使用EVs亞類型命名，如根據(jù)大小區(qū)分的物理學(xué)特征，直徑小于100 nm或200 nm的稱為小囊泡（small EVs，sEVs），直徑≥200 nm的為中囊泡或大囊泡（medium/large EVs）[34]。干細(xì)胞來源的外泌體可發(fā)揮與其親代干細(xì)胞類似的生物學(xué)作用，可作為治療POF的新型無細(xì)胞治療（cell-free therapy）方法。

hADSCs、hPMSCs等間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液對于修復(fù)卵巢功能均有一定效果，進(jìn)一步證實了干細(xì)胞通過旁分泌途徑發(fā)揮作用的設(shè)想。Huang等[35]發(fā)現(xiàn)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體（human adipose stem cell-derive exosomes，hADSC-Exo） 通過上調(diào) Smad2、Smad3、Smad5 表達(dá)，抑制 Fas、FasL、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）、caspase-8凋亡蛋白表達(dá)，從而抑制顆粒細(xì)胞凋亡，修復(fù)卵巢功能。在外泌體治療POI的研究中，多種miRNAs發(fā)揮了重要作用。Zhang等[36]研究表明人羊膜上皮細(xì)胞來源外泌體（exosomes derived from human amniotic epithelial cells，hAECs-Exo）可通過傳遞 miR-1246等多種miRNAs，抑制化療藥物引起的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。Xiao等[37]發(fā)現(xiàn)羊水干細(xì)胞來源外泌體（exosomes derived from amniotic fluid stem cells，AFSCs-Exo）可減少化療致POF小鼠卵巢內(nèi)閉鎖卵泡數(shù)目，同時體外實驗證明AFSCs-Exo通過傳遞其包含的miR-10a抑制環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。此外，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體也可傳遞miR-144-5p，調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT通路，進(jìn)而保護(hù)化療后大鼠體內(nèi)卵泡閉鎖[38]。因此干細(xì)胞旁分泌的作用可以部分歸因于外泌體，但目前研究數(shù)據(jù)較少，各類干細(xì)胞來源外泌體對于POI的治療效果及其機(jī)制還需進(jìn)一步評估。

3 結(jié)語與展望

POI是導(dǎo)致不孕不育的重要原因之一，但由于其病因復(fù)雜、發(fā)病機(jī)制不明確，臨床上尚未找到特定的治療方法。隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，干細(xì)胞及其外泌體治療為修復(fù)卵巢功能、恢復(fù)生育能力提供了新的希望。在動物模型中干細(xì)胞移植的效果已被大量證實，但在臨床應(yīng)用中還鮮有報道，并且對于干細(xì)胞移植所需要的數(shù)量和移植方法還處在探索階段，未形成基本共識。對于POI患者來說，干細(xì)胞移植的安全性評估永遠(yuǎn)是干細(xì)胞治療的重要內(nèi)容。部分干細(xì)胞在移植入體內(nèi)后可能會失去其高度增殖和分化的特性，甚至不斷累積表觀遺傳學(xué)的修飾作用、產(chǎn)生染色體突變等風(fēng)險。因此在真正用于臨床治療之前，以上問題均需要繼續(xù)開展相應(yīng)實驗進(jìn)行研究。近年來由于干細(xì)胞移植存在植入細(xì)胞存活率低、倫理爭議、來源有限、成瘤及免疫排斥風(fēng)險的問題，干細(xì)胞旁分泌作用的研究越來越受到關(guān)注，并提出了無細(xì)胞治療的生物治療方式。其中干細(xì)胞來源外泌體較干細(xì)胞免疫排斥幾率更低，可以避免或減輕移植后異常分化和炎癥相關(guān)問題的風(fēng)險。外泌體在保持干細(xì)胞生物作用的同時，又能規(guī)避其缺陷，有望成為POI的一種新型治療方法。但目前對于外泌體治療POI的文獻(xiàn)較少，其作用機(jī)制及安全性仍需進(jìn)一步實驗探索。