維生素D及其受體與子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)研究進(jìn)展

劉思思，孫振杰，馮 文

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)達(dá)國家女性生殖道最常見的腫瘤，是美國女性四大癌癥之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年歐美國家新增子宮內(nèi)膜癌病例63 230例，其中90%以上患者的發(fā)病年齡在50歲以上[1]。子宮內(nèi)膜癌的治療主要包括手術(shù)、放療、化療和內(nèi)分泌治療。由于目前臨床上患者對(duì)化療的不良反應(yīng)大且易耐藥，因此尋找高效低毒的藥物成為臨床研究的當(dāng)務(wù)之急[2]。維生素D是人體的必需脂溶性維生素之一，除維持鈣磷代謝平衡，在抗腫瘤增殖、免疫調(diào)節(jié)方面也有重要作用。有研究證明，在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌中已檢測(cè)到維生素D受體（vitamin D receptors，VDR）的存在。隨著對(duì)維生素D抗腫瘤機(jī)制的深入研究，其有望成為子宮內(nèi)膜癌內(nèi)分泌治療的新興藥物。

1 維生素D及VDR的生物學(xué)基礎(chǔ)

1.1 維生素D代謝途徑維生素D家族主要包括植物來源的維生素D2（麥角鈣化醇）和動(dòng)物來源的維生素D3（膽鈣化醇）。來自飲食或皮膚的維生素D通過血液循環(huán)與維生素D結(jié)合蛋白（VDBP）結(jié)合，首先被輸送到肝臟。在肝臟中，維生素D被25羥化酶代謝為骨化二醇[25（OH）D]，這是血清中維生素D的主要循環(huán)形式。骨化二醇在腎臟經(jīng)過1α-羥化酶進(jìn)一步代謝為骨化三醇[1α，25（OH）2D3][3]。骨化三醇作為主要的代謝活性形式進(jìn)入循環(huán)，與VDBP結(jié)合后作用于靶組織，調(diào)節(jié)鈣磷代謝，并對(duì)細(xì)胞增殖分化及免疫系統(tǒng)產(chǎn)生生物學(xué)作用[4]。

1.2 VDR的生物學(xué)作用VDR作為維生素D發(fā)揮作用的受體，存在于細(xì)胞核內(nèi)，來源于類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族，主要通過基因組和非基因組途徑起作用[5]。VDR存在于30多種組織中，常見于腸、腎、骨、卵巢、乳腺和前列腺等。VDR有兩個(gè)核心功能域，一個(gè)是高度轉(zhuǎn)換DNA結(jié)合域（DBD），其在氨基（NH2-）末端含有兩個(gè)鋅鍵；另一個(gè)是可變配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（LBD），其在羧基（COOH-）末端含有至少12個(gè)α-螺旋和3個(gè)β-折疊。骨化三醇與VDR結(jié)合能調(diào)節(jié)下游靶標(biāo)的基因組和非基因組。在基因組途徑中，骨化三醇通過結(jié)合細(xì)胞溶質(zhì)型VDR，促進(jìn)VDR磷酸化與類視黃醇受體（RXR）的異二聚化，實(shí)現(xiàn)復(fù)合物核轉(zhuǎn)位。骨化三醇-VDR-RXR復(fù)合物與維生素D反應(yīng)元件（VDRE）結(jié)合，募集轉(zhuǎn)錄共激活因子或共抑制因子調(diào)節(jié)靶基因的mRNA表達(dá)，以調(diào)節(jié)鈣磷代謝等功能[6]。最新研究表明，自噬銜接蛋白p62/SQSTM1在異二聚化和募集過程中起關(guān)鍵作用[7]。骨化三醇-VDR-RXR復(fù)合物能直接結(jié)合肝星狀細(xì)胞中的VDR和RXR靶向基因發(fā)生自噬。在非基因組途徑中，骨化三醇與膜結(jié)合型VDR結(jié)合，通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)生變化。有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450蛋白（CYP11A1）作為新型維生素D代謝酶，其代謝物可增強(qiáng)紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷和氧化應(yīng)激的防御機(jī)制，以細(xì)胞依賴性方式發(fā)揮抗癌作用。而CYP11A1的產(chǎn)物，如20（OH）D和20，23（OH）D，已被證明可作為VDR的偏向激動(dòng)劑[8]。因此，維生素D不僅能通過骨化三醇-VDR途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖，也能通過CYP11A1衍生物的VDR或甲狀腺激素樣受體（RORα/γ）途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。

2 維生素D抗腫瘤作用及其機(jī)制

大量研究表明，維生素D參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的整個(gè)過程[9]，其機(jī)制包括調(diào)節(jié)細(xì)胞行為，如增殖、分化、細(xì)胞凋亡、自噬和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），以及調(diào)節(jié)細(xì)胞-微環(huán)境相互作用，如血管生成、抗氧化劑、炎癥和免疫系統(tǒng)。

2.1 維生素D在抗炎、DNA損傷修復(fù)和抗氧化防御中的作用炎癥是癌癥發(fā)展的危險(xiǎn)因素之一。有研究表明，使用過抗生素的患者子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率會(huì)降低。近來針對(duì)子宮內(nèi)膜癌的研究發(fā)現(xiàn)，維生素D對(duì)參與炎癥和先天免疫應(yīng)答的核因子κB（NF-κB）具有誘導(dǎo)抑制作用，能降低趨化因子CXCL1和CXCL2的表達(dá)，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤[10]。維生素D可打破免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞間的平衡，進(jìn)而減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[11]。人體每日補(bǔ)充維生素D可減少氧化性DNA損傷，表明維生素D能保護(hù)人體免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA損傷[12]。研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（NRF2）作為受維生素D調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，能增加抗氧化酶表達(dá)，提示維生素D可能是誘導(dǎo)抗氧化酶并發(fā)揮抗氧化防御的潛在因素[13]。

2.2 維生素D在細(xì)胞增殖和分化中的作用骨化三醇在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中均有抑制細(xì)胞增殖和分化的作用。CYP11A1的新型代謝產(chǎn)物通過與VDR結(jié)合抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，發(fā)揮降低血鈣的作用[14]。維生素D通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞周期和信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)抗增殖作用。維生素D能增加胰島素樣生長(zhǎng)因子3（IGF-3）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑p21和p27蛋白的表達(dá)，抑制CDK2表達(dá)，進(jìn)而抑制IGF-1和IGF-2刺激的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展[15]。維生素D誘導(dǎo)分化與其相關(guān)的抗增殖特性，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，如磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、NF-κB 和 Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)。

2.3 維生素D在細(xì)胞凋亡、自噬及端粒酶活性中的作用誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡可抑制腫瘤發(fā)展。研究表明，維生素D能在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡，從而激活內(nèi)在細(xì)胞凋亡途徑半胱氨酸天冬氨酸酶3（Caspase-3）和Caspase-9，并破壞促凋亡因子和抗凋亡因子之間的平衡，實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡的過程[16]。

自噬是在細(xì)胞存活和凋亡中起關(guān)鍵作用的分解代謝過程。研究表明，維生素D可引起細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制性自噬，維生素D誘導(dǎo)的自噬細(xì)胞死亡主要通過上調(diào)自噬相關(guān)基因Beclin1實(shí)現(xiàn)[7]。維生素D介導(dǎo)的自噬細(xì)胞死亡中有CDK抑制劑的參與，主要受p19或p27蛋白表達(dá)缺失調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)。維生素D還可通過促進(jìn)DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子4（DDIT4）的表達(dá)誘導(dǎo)自噬。

激活端粒酶可使腫瘤細(xì)胞端粒長(zhǎng)度不因細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而縮短，從而賦予腫瘤細(xì)胞無限分裂能力。研究顯示，維生素D可通過減少人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）mRNA生成而降低mRNA的穩(wěn)定性，從而降低端粒酶活性，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[17]。Kasiappan等[18]研究顯示維生素D能抑制腫瘤組織中端粒酶的過表達(dá)，從而降低腫瘤細(xì)胞存活率和增殖速率。在子宮內(nèi)膜癌的Ishikawa細(xì)胞中，骨化三醇誘導(dǎo)成熟微小RNA-498（miR-498）水平升高，促進(jìn) hTERT mRNA降解，阻止miR-498轉(zhuǎn)錄基因所調(diào)控的細(xì)胞存活。

2.4 維生素D在腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲及血管生成中的作用EMT、轉(zhuǎn)移侵襲和血管生成是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的基本過程。維生素D可降低纖溶酶原激活系統(tǒng)中某些因子和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達(dá)，并抑制其活性，減少腫瘤細(xì)胞浸潤所需的蛋白水解酶的生成。維生素D可通過降低腫瘤細(xì)胞層黏連蛋白受體和整合素的表達(dá)削弱腫瘤侵襲性[19]。研究發(fā)現(xiàn)參與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞分化過程的E-鈣黏蛋白和乳鐵蛋白等基因上調(diào)依賴于ICB-1基因，ICB-1基因的缺失阻斷了維生素D對(duì)上皮細(xì)胞EMT的抑制[20]。研究發(fā)現(xiàn)SEMA蛋白家族的SEMA3B和SEMA3F在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中受骨化三醇誘導(dǎo)，表達(dá)呈現(xiàn)較低水平，隨著腫瘤進(jìn)展，SEMA蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低，表明SEMA蛋白在抑制癌基因的轉(zhuǎn)化過程中起關(guān)鍵作用。有研究顯示，使用骨化三醇處理Ishikawa細(xì)胞株，可下調(diào)參與肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)重組的蛋白質(zhì)表達(dá)和活性，誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲解聚，進(jìn)而影響細(xì)胞骨架重組。維生素D能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞侵襲性，Bokhari等[21]發(fā)現(xiàn)經(jīng)維生素D處理過的子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞和Ishikawa細(xì)胞的腫瘤侵襲能力減弱，同時(shí)這兩種細(xì)胞表達(dá)的侵襲分子標(biāo)志物（MMP-2和MMP-9）水平也會(huì)降低。

3 維生素D與子宮內(nèi)膜癌

關(guān)于維生素D與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，國內(nèi)外已有相關(guān)研究報(bào)道。Tagliabue等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，編碼VDR基因（rs7041和rx4588）的基因多態(tài)性與不同部位的腫瘤無關(guān)。而在動(dòng)物研究卻發(fā)現(xiàn)攝入維生素D可降低肥胖引起的子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率。隨后有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，骨化三醇濃度會(huì)隨著體質(zhì)量指數(shù)的增加而降低，推測(cè)骨化三醇的升高可能不是引起成年女性肥胖的重要激素機(jī)制[23]。之后Yabushita等[24]在人子宮內(nèi)膜癌RL95-2細(xì)胞和Ishikawa細(xì)胞中通過免疫組織化學(xué)（免疫組化）法發(fā)現(xiàn)VDR蛋白表達(dá)和核定位現(xiàn)象。隨后Agic等[25]通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞核內(nèi)VDR蛋白及mRNA表達(dá)水平高于正常內(nèi)膜細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)水平，提示子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞可能是維生素D作用的靶細(xì)胞。通過蛋白質(zhì)印跡法發(fā)現(xiàn)，24-羥化酶蛋白水平在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中表達(dá)水平高于正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞，此現(xiàn)象可能與腫瘤進(jìn)展程度有關(guān)。而24-羥化酶mRNA水平升高與不同組織類型腫瘤的預(yù)后有關(guān)。24-羥化酶主要負(fù)責(zé)的維生素D分解代謝，降低24-羥化酶濃度可能有利于維生素D抗癌治療。Bergadà等[26]同樣證實(shí)了子宮內(nèi)膜癌組織中24-羥化酶蛋白水平低于正常子宮內(nèi)膜；但與腫瘤的不同病理分期無關(guān)。近年來，An等[27]收集60例子宮內(nèi)膜癌患者腫瘤組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)VDR在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，而在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)率更高，VDR從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌組織學(xué)分級(jí)低有關(guān)，可能子宮內(nèi)膜癌組織細(xì)胞質(zhì)與VDR間某種共同途徑被激活，使VDR在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)?？傊?，以上所提出的分子學(xué)證據(jù)展現(xiàn)維生素D代謝酶及VDR表達(dá)的變化，提示維生素D可能作為子宮內(nèi)膜癌治療方法的潛在靶標(biāo)。

大量的實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)骨化三醇可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移速率。Saunders等[28]針對(duì)子宮內(nèi)膜癌RL95-2細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用細(xì)胞毒性藥物卡鉑，其可呈濃度依賴方式抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，最大抑制率可達(dá)78%；單獨(dú)使用骨化三醇以相同方式抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，最大抑制率可達(dá)29%；卡鉑聯(lián)合骨化三醇共同加入RL95-2細(xì)胞株可大幅度提高細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。但此實(shí)驗(yàn)未從VDR分子機(jī)制角度闡明現(xiàn)象。隨后Yabushita等[24]研究發(fā)現(xiàn)，50 nmol/L骨化三醇呈劑量依賴性抑制RL95-2細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制率達(dá)44%；6 d后，RL95-2細(xì)胞高水平表達(dá)細(xì)胞角蛋白多肽，在膠原凝膠中培養(yǎng)時(shí)變成具有明顯極性的柱狀并形成腺樣結(jié)構(gòu)。Lee等[29]研究發(fā)現(xiàn)骨化三醇與雌激素聯(lián)合使用促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，顯現(xiàn)了抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)這兩種藥物均可通過Caspase-3激活增強(qiáng)VDR的表達(dá)并抑制細(xì)胞增殖。近年來Kuittinen等[30]研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用紫杉醇與紫杉醇聯(lián)合卡鉑使用同樣有效，且比單獨(dú)使用卡鉑更有效地抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。而骨化三醇與紫杉醇聯(lián)合卡鉑使用能進(jìn)一步抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。紫杉醇針對(duì)子宮內(nèi)膜癌UT-EC-1細(xì)胞系殺滅率高達(dá)25%，而紫杉醇在UT-EC-3細(xì)胞系中的殺滅率高于卡鉑，達(dá)53%。紫杉醇聯(lián)合骨化三醇較單一使用紫杉醇對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用。并且在VDR高表達(dá)的UT-EC-1細(xì)胞系中觀察到了卡鉑和骨化三醇的協(xié)同抗腫瘤作用。

林蘭等[31]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度骨化三醇作用于子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A細(xì)胞不同天數(shù)后，各組細(xì)胞生長(zhǎng)增殖均受到明顯抑制，且隨著骨化三醇作用濃度增加，細(xì)胞增殖能力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是通過下調(diào)Skp2基因轉(zhuǎn)錄水平及增加P27蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，減少其降解。研究顯示，大多腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后受負(fù)性調(diào)控因子Skp2/P27影響。子宮內(nèi)膜癌中檢測(cè)到Skp2表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致P27蛋白表達(dá)減少，預(yù)示著Skp2/P27與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。林顥等[32]選擇Skp2基因作為RNA干擾（RNAi）慢病毒靶基因，構(gòu)建特異表達(dá)載體轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)重組慢病毒RNAi在蛋白質(zhì)和mRNA水平上均可有效抑制Skp2基因表達(dá)，干擾細(xì)胞增殖分化，下調(diào)Skp2基因表達(dá)，上調(diào)P27蛋白表達(dá)，卻并未影響P27 mRNA水平。因此可推測(cè)，RNAi阻斷Skp2基因主要通過減少P27蛋白的泛素化降解，從而上調(diào)P27蛋白表達(dá)。

4 新型非高血鈣維生素D衍生抗癌劑PT19c與子宮內(nèi)膜癌

隨著對(duì)抗腫瘤機(jī)制的深入發(fā)掘，維生素D及其類似物開始廣泛應(yīng)用于腫瘤內(nèi)分泌治療中，而高鈣血癥仍然是臨床中使用維生素D的主要障礙。新合成類似物如EB1089和Maxacalcitol已被證實(shí)在各種實(shí)體瘤中具有降低血鈣效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，新型非高血鈣維生素D衍生的抗癌劑PT19c有較弱的VDR拮抗作用，因PT19c在VDR-配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（VDR-LBD）中發(fā)生空間倒置，缺少與VDR結(jié)合，不發(fā)揮經(jīng)典的骨化三醇-VDR-LBD作用[33]。研究人員用裸鼠卵巢癌SKOV-3細(xì)胞和子宮內(nèi)膜癌ECC-1細(xì)胞衍生的異種移植物建模，評(píng)估PT19c的抗腫瘤功效，在卵巢癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PT19c治療組降低了裸鼠異種移植腫瘤的進(jìn)展，而子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中使用骨化三醇作為對(duì)照組，在實(shí)驗(yàn)第20天時(shí)，PT19c治療組的腫瘤體積明顯減小。而骨化三醇組明顯減緩子宮內(nèi)膜癌發(fā)展，而在攜帶子宮內(nèi)膜癌ECC-1細(xì)胞異種移植物組中腫瘤體積持續(xù)增加。最后發(fā)現(xiàn)，PT19c治療可導(dǎo)致黏著斑形成和肌動(dòng)蛋白絲功能障礙。肌動(dòng)蛋白利用快速聚合和解聚以維持包括癌細(xì)胞在內(nèi)的活細(xì)胞形態(tài)。當(dāng)肌動(dòng)蛋白聚合被阻斷且現(xiàn)有肌動(dòng)蛋白絲組裝受到干擾，細(xì)胞將發(fā)生凋亡和死亡。有學(xué)者也觀察到細(xì)胞松弛素可破壞細(xì)胞骨架，發(fā)生Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這為通過抑制黏著斑形成和引發(fā)肌動(dòng)蛋白突變治療上皮性卵巢癌或子宮內(nèi)膜癌提供了可行的治療思路。

5 展望

目前研究已證實(shí)維生素D在腫瘤治療和預(yù)防中發(fā)揮抗增殖、促分化和免疫調(diào)節(jié)作用。高鈣血癥限制了維生素D的需求量與最大安全劑量，影響其抗腫瘤作用的發(fā)揮，但由于大多實(shí)驗(yàn)結(jié)果源于流行病學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)室研究，缺乏實(shí)際的臨床工作應(yīng)用，外加飲食攝入的維生素D含量及日照條件的不可控性，僅靠觀察性研究總結(jié)維生素D對(duì)腫瘤作用的理論依據(jù)有待進(jìn)一步證實(shí)。對(duì)維生素D及其類似物在子宮內(nèi)膜癌中作用的分子機(jī)制的體內(nèi)或離體研究較少；大多數(shù)研究是使用永生化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞完成的。此外，VDR除調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平，是否還可調(diào)控其他功能，尚無定論。深入研究維生素D及VDR在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，將更好地提高人類對(duì)維生素D及VDR的認(rèn)識(shí)水平，實(shí)現(xiàn)治療腫瘤效益的最大化。