藍(lán)莓對大鼠肝纖維化模型中轉(zhuǎn)錄因子KLF11表達(dá)的影響*

洪 鑄， 楊 芳△， 楊 勤， 嚴(yán)芝強(qiáng)， 劉澤瑩， 劉麗榮

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1臨床血液學(xué)教研室， 2貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 3病理生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025)

肝纖維化是多種慢性肝損傷導(dǎo)致的慢性肝病所具有的共同性病理變化。目前有研究表明，食用藍(lán)莓具有一定的預(yù)防和改善肝纖維化的作用，然而其機(jī)理尚未完全明確[1]。Krüppel樣因子11(Krüppel-like factor 11, KLF11)是Krüppel樣因子家族的成員，此家族成員在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛分布，其C端含有高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)(C2H2型)，而N端則具有很強(qiáng)的多樣性，因而涉及功能復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)17個(gè)成員。已有的研究顯示，KLF11作為關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子具有抗肝纖維化功能[2]，且其受到RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)控[3]。由于花青素能夠抑制上述通路的信號(hào)[4]，而藍(lán)莓中含有高含量花青素，提示藍(lán)莓的改善纖維化作用可能與KLF11有聯(lián)系。因而在本研究中，將觀察和探討藍(lán)莓對四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的預(yù)防改善作用和其對KLF11在肝組織中表達(dá)的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，清潔級(jí)，40只，體重(120±20) g，由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[批號(hào)：SCXK(軍)2012-0011]提供，在常溫環(huán)境(18～24 ℃)飼養(yǎng)。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 藍(lán)莓由貴州麻江藍(lán)莓生產(chǎn)基地生產(chǎn)；抗KLF11抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；引物設(shè)計(jì)及合成由Thermo Scientific完成；RIPA裂解液購自索萊寶；TRIzol試劑購自Invitrogen；cDNA第1鏈合成試劑盒和SYBR Green試劑盒購自Thermo Scientific。CFX 9600 PCR儀購自Bio-Rad。

2 方法

2.1動(dòng)物模型的制備及分組 大鼠在常溫環(huán)境正常飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為4組：正常對照組(control group)、正常藍(lán)莓對照組(blueberry group)、模型組(model group)和藍(lán)莓預(yù)防組(blueberry prevention group)。正常組常溫環(huán)境下正常飼養(yǎng)16周；正常藍(lán)莓對照組每100 g體重予新鮮壓榨藍(lán)莓汁1 mL灌食，連續(xù)16周；模型組以每100 g體重予CCl40.3 mL腹腔注射給藥，CCl4濃度為40%，以市售橄欖油為溶劑以2 ∶3比例配制，隔日注射1次，持續(xù)16周；藍(lán)莓預(yù)防組造模處理方法前8周同模型組，之后以每100 g體重予新鮮壓榨藍(lán)莓汁1 mL灌食，同時(shí)予相同維持劑量的CCl4，連續(xù)8周，共16周[5]。

2.2 標(biāo)本采集模型制備后，腹腔注射麻醉劑麻醉動(dòng)物，之后均在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行無菌操作：快速從心臟采血，無抗凝管收集，并在當(dāng)天送檢；剪下肝組織，取右葉相同部位的肝以10%中性甲醛固定，石蠟包埋用于病理組織檢測；剪取余下的右葉肝臟接近的部位分裝進(jìn)RNA保護(hù)液、凍存管中，置于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3病理切片中肝組織增生程度的判定 按(Masson染色和HE染色)半定量分級(jí)法分為0～6級(jí)(S0～S6)，級(jí)別越高則提示肝纖維化程度越高[6]。

2.4血液相關(guān)指標(biāo)的測定 委托貴州省腫瘤醫(yī)院使用Siemens Advia 2400測定各組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平及肝纖維化4項(xiàng)[透明質(zhì)酸(haluronic acid，HA)、層粘連蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前膠原(procollagen type III，PCⅢ)和Ⅳ型膠原(collagen type Ⅳ，Col Ⅳ)]的水平。

2.5Western blot和免疫組織化學(xué)染色檢測KLF11蛋白質(zhì)在肝中的表達(dá) RIPA蛋白裂解液裂解組織，按BCA蛋白定量法計(jì)算并制作蛋白樣品，向蛋白液中加入SDS蛋白上樣緩沖液，取45 g上樣并使用SDS-PAGE分離后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉100 min。膜上加入稀釋后的 I 抗[KLF11為1 ∶2 000，β-actin為1 ∶ 5 000，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)為1 ∶3 000]，4 ℃過夜。次日用TBST洗凈后加入HRP標(biāo)記的 II 抗，室溫孵育1.5 h。之后使用ECL(enhanced chemiluminescence)工作液曝光。以IMAGE LAB軟件計(jì)算陰影值，KLF11表達(dá)量陰影值與β-actin表達(dá)量陰影面積的比值作為該蛋白的相對表達(dá)量，用于統(tǒng)計(jì)。免疫組織化學(xué)染色抗原修復(fù)采用高溫高壓修復(fù)法，使用與Western blot相同的 I 抗，孵育 II 抗后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，細(xì)胞核顯示棕色顆粒表示KLF11為陽性，手工計(jì)數(shù)顯色得分情況[7]。由于在肝纖維化時(shí)，肝組織高表達(dá)α-SMA，使用Western blot時(shí)將其作為肝纖維化標(biāo)志物一并檢測[8]。

2.6Real-time PCR檢測肝臟KLF11和Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ,ColⅠ)的mRNA表達(dá) 傳統(tǒng)TRIzol法提取組織總RNA，后鑒定質(zhì)量和純度，行反轉(zhuǎn)錄，使用cDNA第1鏈合成試劑盒，按說明書操作后上機(jī)反應(yīng)；將合成的cDNA按SYBR Green試劑盒說明書進(jìn)行操作上機(jī)，主要引物序列見表1。反應(yīng)條件為:95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，循環(huán)50次。結(jié)束后得出各個(gè)樣本Ct(cycle threshold)值，以正常對照組的表達(dá)量使用2-ΔΔCt法計(jì)算其余各組的目的相對表達(dá)量。

表1 Real-time PCR引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料呈正態(tài)分布，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，各組資料經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差齊性。等級(jí)資料用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)，組間資料多重比較用 Wil-coxon 秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠肝指數(shù)及 ALT、AST、肝纖四項(xiàng)水平的變化

與正常對照組比較，模型組肝纖指標(biāo)HA、 ALT 和 AST 顯著增高(P<0.01)，PCⅢ增高(P<0.05)；與模型組比較，藍(lán)莓預(yù)防組HA、ALT 和 AST 顯著降低(P<0.01)，PCⅢ降低(P<0.05)，其中LN和Col Ⅳ可能因低于儀器檢測下限或其它原因未檢出，見表2。

2 病理檢查結(jié)果的分級(jí)情況

各組大鼠肝纖維化分級(jí)具有明顯差異(P<0.01)，見表3。正常組與藍(lán)莓組分級(jí)無差別(P>0.05)；與正常組相比，模型組肝纖維化分級(jí)提高(P<0.01)，以S5～S6為主；與模型組相比，藍(lán)莓預(yù)防組肝纖維化分級(jí)降低(P<0.01)，以S2～S4為主，見表3。

表2 各組大鼠血清AST、ALT、HA和PCⅢ水平的變化

*P<0.05，**P<0.01vsnormal control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

表3 各組大鼠肝纖維化分級(jí)結(jié)果

**P<0.01vsnormal control group;#P<0.05vsmodel group.

3 病理檢查結(jié)果分析

正常組和藍(lán)莓組肝小葉完整且無細(xì)胞變性和炎癥細(xì)胞浸潤；模型組肝小葉破壞明顯，布滿圓形假小葉，纖維增生、炎癥細(xì)胞浸潤及脂肪變性明顯；藍(lán)莓預(yù)防組纖維化程度明顯減低，纖維增生程度有所改善，輕者以脂肪變性為主，重者肝小葉結(jié)構(gòu)尚在，匯管區(qū)有纖維增生和炎細(xì)胞少量浸潤，見圖1。

4 Western blot和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的分析

與其它各組比較比較，模型組KLF11表達(dá)顯著降低(P<0.01)，而α-SMA顯著增高(P<0.01)；藍(lán)莓預(yù)防組KLF11 表達(dá)較模型組顯著增高(P<0.01)；藍(lán)莓預(yù)防組α-SMA表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.01)，見圖2。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，見圖3。

Figure 1. Masson and HE staining of liver tissues in each group (scale bar=200 μm).

圖1 各組大鼠肝組織Masson和HE染色結(jié)果的觀察

Figure 2. The protein expression levels of KLF11 and α-SMA in the rat liver tissues of each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnormal control group;##P<0.01vsmodel group.

圖2 各組大鼠肝細(xì)胞中KLF11和α-SMA蛋白表達(dá)的變化

5 Real-time PCR檢測KLF11和ColⅠ的mRNA表達(dá)結(jié)果分析

與正常對照組比較，模型組KLF11的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，而ColⅠ的表達(dá)顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，藍(lán)莓預(yù)防組KLF11的表達(dá)顯著增高(P<0.01)，而ColⅠ的表達(dá)顯著降低(P<0.01)；藍(lán)莓組較正常組KLF11的表達(dá)增高(P<0.05)，而ColⅠ的表達(dá)顯著降低(P<0.01),見圖4。

Figure 3. The protein expression levels of KLF11 in the rat liver tissues of each group (immunohistochemical staining, ×200).

圖3 免疫組織化學(xué)染色顯示各組大鼠肝組織中KLF11的表達(dá)變化

Figure 4. The mRNA expression levels of KLF11 and ColⅠ in the rat liver tissues of each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖4 各組大鼠肝細(xì)胞中KLF11和ColⅠ的mRNA表達(dá)變化

討 論

肝纖維化是多種慢性肝病的共同性病理過程，其終末期可進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌，目前大部分研究認(rèn)為：在一定程度上，肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的；而一旦進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌，則治療難度更大；因此，大量學(xué)者聚焦于研究肝纖維化的逆轉(zhuǎn)及其靶點(diǎn)的尋找上[9]。肝纖維化的發(fā)病機(jī)制主要是慢性肝損傷導(dǎo)致的靜止態(tài)肝星狀細(xì)胞激活，釋放大量的以SMA和膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)堆積；而肝損傷會(huì)導(dǎo)致ALT、AST從肝細(xì)胞中溢出從而使得血清ALT和AST水平升高[8]。本研究結(jié)果顯示，模型組血清肝損傷指標(biāo)ALT和AST及肝纖維化指標(biāo)HA和PCⅢ均顯著高于正常對照組；在病理肝纖維化分級(jí)上，模型組以S5～S6級(jí)為主，而正常組以S0級(jí)為主，模型組分級(jí)高于正常組對照組；Masson染色顯示正常組肝小葉完整且無細(xì)胞變性和炎癥細(xì)胞浸潤，模型組肝小葉破壞明顯，布滿圓形假小葉，纖維增生、炎癥細(xì)胞浸潤及脂肪變性明顯，呈現(xiàn)出典型的肝纖維化形態(tài)學(xué)特點(diǎn)；且模型組α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對照組；上述結(jié)果均顯示造模成功。與模型組相比，藍(lán)莓預(yù)防組血清肝損傷指標(biāo)ALT、AST及肝纖維化指標(biāo)HA、PCⅢ均顯著降低，肝纖維化等級(jí)以S2-S4為主，分級(jí)降低，α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著降低；相對于模型組的典型肝纖維化，藍(lán)莓預(yù)防組纖維化增生得到改善、炎癥細(xì)胞浸潤減少，均直接說明食用藍(lán)莓具有一定的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用。與正常對照組相比，藍(lán)莓組KLF11的mRNA表達(dá)水平提高，說明正常狀態(tài)下食用藍(lán)莓在轉(zhuǎn)錄水平上能夠提高KLF11的表達(dá)；與肝纖維化組相比，藍(lán)莓預(yù)防組KLF11的mRNA和蛋白水平均顯著提高，說明在肝纖維化模型中食用藍(lán)莓能夠提高和促進(jìn)肝臟內(nèi)KLF11的表達(dá)水平。

本實(shí)驗(yàn)藍(lán)莓為貴州麻江藍(lán)莓生產(chǎn)基地生產(chǎn)，經(jīng)過該基地反復(fù)培育，其藍(lán)莓有效營養(yǎng)物質(zhì)含量逐年增加，具有糖脂比低、營養(yǎng)成分高的特點(diǎn)，其中花青素(anthocyanin)含量高達(dá)(0.901±0.473) g/100 g[5]。Kalt等[10]發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物在食用藍(lán)莓后，花青素會(huì)出現(xiàn)在肝臟中。Chen等[4]發(fā)現(xiàn)花青素能夠抑制RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路的主要蛋白和mRNA表達(dá)，而目前已確定的KLF11上游信號(hào)通路較少，RAS-RAF-MEK-ERK便是KLF11的已知關(guān)鍵負(fù)向調(diào)控因素，ERK信號(hào)能通過磷酸化KLF11和干擾KLF11募集mSin3a-HDAC復(fù)合物，從而阻斷KLF11對基因表達(dá)的抑制作用，因此我們推測食用含有大量花青素的藍(lán)莓，很可能通過此通路調(diào)節(jié)KLF11的表達(dá)[11]。KLF11作為關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子在對抗多種體內(nèi)組織器官纖維化中具有重要作用，包括其能對抗子宮內(nèi)膜纖維化、心肌纖維化、肝纖維化，KLF11能直接與ColⅠ的基因啟動(dòng)子結(jié)合，且可以通過HP1-HMT染色質(zhì)重塑途徑直接下調(diào)ColⅠ的表達(dá)，從而抑制肝纖維化發(fā)生，因此我們檢測了不同組別之間ColⅠ的mRNA表達(dá)量[12-13]。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：藍(lán)莓預(yù)防組ColⅠ的mRNA表達(dá)水平顯著低于模型組，而KLF11在藍(lán)莓預(yù)防組表達(dá)較模型組高，說明在發(fā)生肝纖維化的狀態(tài)下藍(lán)莓可以提高大鼠模型體內(nèi)KLF11的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，這些KLF11可能在轉(zhuǎn)錄水平上影響和降低了ColⅠ的表達(dá)，從而抵制肝纖維化的發(fā)生；此外，藍(lán)莓組較正常組在KLF11的mRNA表達(dá)水平高，但在蛋白表達(dá)水平無顯著差異，而藍(lán)莓組ColⅠ的mRNA表達(dá)顯著低于正常組，說明正常情況下藍(lán)莓能在轉(zhuǎn)錄水平提高KLF11的表達(dá)儲(chǔ)備，但在KLF11之外可能尚有其他影響ColⅠ表達(dá)的因素存在。

綜上所述，食用藍(lán)莓可以一定程度上預(yù)防和降低肝纖維化水平，這與詹瑋等[5]研究結(jié)果一致；在肝纖維化發(fā)生時(shí)，藍(lán)莓可能通過促進(jìn)KLF11的表達(dá)從而降低肝纖維化水平，我們猜測其機(jī)制很可能是通過藍(lán)莓花青素抑制RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路使得KLF11表達(dá)增多，之后KLF11通過募集mSin3a-HDAC復(fù)合物、結(jié)合ColⅠ的基因啟動(dòng)子區(qū)及通過HP1-HMT染色質(zhì)重塑途徑，共同下調(diào)Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)[11-13]，從而達(dá)到改善肝纖維化的效果，但是否經(jīng)此途徑亦或是還有之外的調(diào)控途徑，尚需要深入研究。由于藍(lán)莓花青素是天然的植物成分，易于獲得，而已發(fā)現(xiàn)KLF11作為一種關(guān)鍵的抑制性轉(zhuǎn)錄因子在如多種惡性腫瘤、糖尿病、器官纖維化等疾病中均存在表達(dá)降低的現(xiàn)象[13-17]，說明KLF11是尚未研究透徹的重要角色，因此藍(lán)莓花青素-RAS-RAF-MEK-ERK-KLF11的潛在信號(hào)通路其作用方式及靶點(diǎn)，值得深入研究。