BMP-7/Smads通路參與EndoMT在大鼠HHPH中的作用*

張晶晶， 武垣伶， 黃丹娜， 高 慧， 樓國(guó)強(qiáng)， 周卓琳， Lingfang SHI， 王萬(wàn)鐵△

(溫州醫(yī)科大學(xué) 1病理生理學(xué)教研室, 2附屬第二醫(yī)院病理科, 浙江 溫州 325035； 3Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Stanford University Medical School, Stanford, CA 94305-5236， USA)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是常見的慢性疾病之一，世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)，到2030年，COPD將成為全球第3大死因，嚴(yán)重影響人民的健康狀況和生活質(zhì)量[1]。研究表明，COPD的預(yù)后與肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PH)發(fā)生與否有關(guān)[2]。因此，防止PH的發(fā)生發(fā)展成為緩解COPD亟需解決的問(wèn)題。PH發(fā)生時(shí)其肺血管壓力逐漸升高，可導(dǎo)致右心衰竭，甚至死亡。PH持續(xù)發(fā)展，難以逆轉(zhuǎn)的主要原因是肺血管重塑(pulmonary vessel structural remodeling，PVSR)。研究表明，肺動(dòng)脈壁中平滑肌樣細(xì)胞大量表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)是形成肺血管重塑的重要原因之一[3]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition，EndoMT)與PVSR之間有密切關(guān)系。Kim等[4]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,ECs)可以通過(guò)EndoMT使自身α-SMA和波形蛋白等表達(dá)上調(diào)，從而參與動(dòng)脈粥樣硬化性血管重塑。但是EndoMT是否參與低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓(hypoxia-hypercapnia pulmonary hypertension，HHPH)PVSR的發(fā)展及其潛在機(jī)制至今尚未完全明確。

目前認(rèn)為，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族與EndoMT有著緊密的聯(lián)系。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)家族屬于TGF-β超家族的成員。有實(shí)驗(yàn)表明，BMP-7與BMP受體(BMP receptor，BMPR)結(jié)合后，能激活下游Smad1/5/8，下調(diào)膠原蛋白和E-鈣黏蛋白表達(dá)水平[5]，也可下調(diào)α-SMA蛋白表達(dá)水平[6]，從而發(fā)揮其抗血管重塑能力。但是目前BMP-7及其下游Smad1/5/8構(gòu)成的通路對(duì)HHPH的影響尚未明確。因此，本文旨在探討B(tài)MP-7/Smads通路參與的EndoMT對(duì)HHPH的作用以及其可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(rat pulmonary endothelial cells，RPAECs)購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。BMP受體激動(dòng)劑rhBMP-7購(gòu)自PeproTech；BMP受體抑制劑DMH-1購(gòu)自MedChemExpress；兔抗大鼠p-Smad1/5/8 抗體和兔抗大鼠Smad1/5/8 抗體購(gòu)自CST；兔抗大鼠α-SMA抗體和小鼠抗大鼠CD31抗體購(gòu)自Abcam；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；RT-PCR引物購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司和TaKaRa；TRITC標(biāo)記山羊抗兔抗體和FITC標(biāo)記山羊抗小鼠抗體購(gòu)自博蘊(yùn)公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojindo；4%多聚甲醛固定液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和BCA 蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自Thermo。ChemiScope 3600 正置熒光顯微鏡(Nikon)；常氧培養(yǎng)箱和低氧高二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)；S1000TMPCR熱循環(huán)儀和蛋白電泳/轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)；CLINX蛋白曝光儀(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)；DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠)。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 在5% CO2、21% O2、37 ℃的環(huán)境下使用含有10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)RPAECs。細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合時(shí)使用0.25%胰蛋白酶?jìng)鞔?，每周傳?次。參考本研究室前期實(shí)驗(yàn)及其它學(xué)者的研究制備細(xì)胞模型和確定藥物濃度[7-8]。當(dāng)RPAECs密度約為80%時(shí)，換用無(wú)FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h，隨后隨機(jī)分為5組：常氧對(duì)照(control, Con)組、低氧高二氧化碳(hypoxia-hypercapnia, HH)組、BMP受體激動(dòng)劑rhBMP-7組、BMP受體抑制劑DMH-1組和溶劑DMSO組。Con組換新鮮的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于常氧培養(yǎng)箱(21% O2、5% CO2)內(nèi)。HH組換新鮮的DMEM高糖培養(yǎng)基，rhBMP-7組換用含rhBMP-7(100 μg/L)的DMEM高糖培養(yǎng)基，DMH-1組換用含DMH-1(10 μmol/L)和rhBMP-7(100 μg/L)的DMEM高糖培養(yǎng)基，DMSO組換用含DMSO的DMEM高糖培養(yǎng)基(終濃度<0.05%并且與DMH-1組的溶劑濃度一致)，均置于低氧高二氧化碳培養(yǎng)箱(1% O2、6% CO2)內(nèi)。各組同時(shí)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2CD31和α-SMA免疫熒光雙標(biāo)法鑒定RPAECs 在6孔板內(nèi)制備細(xì)胞爬片，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行造模。造模結(jié)束后，4%多聚甲醛固定30 min，0.1% Triton X-100處理20 min，5% BSA溶液封閉30 min。滴加1% BSA溶液配制的I抗(含抗α-SMA抗體和抗CD31抗體，稀釋比例均為1 ∶100)，另取一張細(xì)胞爬片滴加PBS溶液代替 I 抗作為空白對(duì)照，4 ℃冰箱靜置孵育過(guò)夜。第2天將爬片取出，避光滴加 II 抗(含TRITC標(biāo)記 II 抗和FITC標(biāo)記 II 抗，稀釋比例均為1:100)孵育30 min，滴加DAPI染色液(稀釋比例為1 ∶ 1 000)室溫孵育5 min，滴加防熒光淬滅劑于細(xì)胞后封片。在正置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，拍片并保存。

2.3RT-PCR檢測(cè)RPAECs中α-SMA、CD31和Smad1/5/8 mRNA的水平 取出造模完畢的RPAECs，加入1 mL TRIzol，用細(xì)胞刮研磨細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至EP管后冰上裂解10 min。加入200 μL氯仿后顛倒混勻，靜置15 min，離心后吸取上層水相。加入等體積異丙醇，顛倒混勻，離心后收集白色沉淀。加入DEPC水稀釋的75%乙醇，使沉淀懸浮，再次離心收集沉淀即為提取的總RNA。加入20 μL DEPC水溶解RNA沉淀，測(cè)定總RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA。CD31引物由TaKaRa設(shè)計(jì)并合成，其余引物由上海捷瑞公司設(shè)計(jì)并合成，序列見表1。PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物在恒壓100 V電壓下電泳30～40 min，然后曝光成像。ImageJ軟件分析電泳條帶灰度值，用目的基因與GAPDH基因灰度值之比表示目的基因的表達(dá)水平。

2.4Western blot 檢測(cè)RPAECs中α-SMA、CD31、Smad1/5/8和p-Smad1/5/8蛋白的水平 用1 mL含PMSF的RIPA裂解液(PMSF∶RIPA=1∶100)裂解造模結(jié)束的細(xì)胞，充分研磨后轉(zhuǎn)至EP管中，靜置40 min，離心收集上清。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，稀釋成2 g/L后用沸水煮10 min。電泳時(shí)每孔蛋白上樣量為20 μg，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，再用10%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1.5 h。洗膜后，4 ℃條件下孵育 I 抗過(guò)夜。I 抗α-SMA、CD31、p-Smad1/5/8、Smad1/5/8和GAPDH抗體稀釋比例均為1 ∶ 1 000。第2天洗膜后在室溫下用 II 抗孵育1 h。α-SMA、p-Smad1/5/8、Smad1/5/8、GAPDH蛋白用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 II 抗孵育，CD31蛋白用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠 II 抗孵育，稀釋比例均為1 ∶ 10 000。 II 抗孵育完畢后，避光滴加ECL化學(xué)發(fā)光液(溶液A∶溶液B=1 ∶ 1)，曝光并保存條帶。ImageJ軟件分析條帶灰度值，用p-Smad1/5/8與Smad1/5/8蛋白灰度值之比表示p-Smad1/5/8蛋白的表達(dá)水平，其余蛋白用目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值之比表示目的蛋白的表達(dá)水平。

表1 RT-PCR引物序列

2.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 按每孔200 μL的比例在96孔板中接種密度為5×107/L的RPAECs懸液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)。待RPAECs密度約為80%時(shí)，制備細(xì)胞模型。造模完畢后取出96孔板，棄去舊培養(yǎng)基，滴加PBS溶液洗滌后，向96孔板內(nèi)含細(xì)胞的各孔中滴加10 μL CCK-8和90 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育3 h，然后測(cè)定450 nm處的吸光度(A)。結(jié)果處理按每組獲得的6個(gè)吸光度值，去除一個(gè)最大值與一個(gè)最小值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.6Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移情況 用無(wú)血清的培養(yǎng)基制備密度為1×108/L的細(xì)胞懸液。在Transwell小室的下室分別加入各分組所需的藥物(每孔加500 μL，且含10% FBS)，在上室加200 μL上述細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)造模(省略細(xì)胞饑餓步驟)。約20 h后取出小室，棄去舊培養(yǎng)基。用干凈棉簽拭去Transwell小室未穿膜的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定穿膜細(xì)胞30 min，PBS漂洗，自然干燥5 min。用結(jié)晶紫染液染穿膜細(xì)胞30 min，再用PBS溶液清洗數(shù)次，室溫下自然風(fēng)干。用手術(shù)刀割下完整的Transwell小室膜，置于載玻片上，蓋上蓋玻片封片。普通顯微鏡下觀察并拍片，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組樣本組間比較均數(shù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)法，先檢驗(yàn)方差齊性，若方差齊則兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，若方差不齊則使用Dunnett T3檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組細(xì)胞CD31和α-SMA的表達(dá)情況

本實(shí)驗(yàn)標(biāo)記CD31表達(dá)的熒光呈綠色，標(biāo)記α-SMA表達(dá)的熒光呈紅色，熒光強(qiáng)度表示蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Con組CD31熒光強(qiáng)度高，表達(dá)量多，而α-SMA熒光強(qiáng)度弱，幾乎無(wú)表達(dá)；與Con組相比，HH組細(xì)胞CD31熒光強(qiáng)度減弱(P<0.05)，而α-SMA熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(P<0.05)；與HH組相比，DMSO組的CD31和α-SMA熒光強(qiáng)度無(wú)明顯差別(P>0.05)，而rhBMP-7組CD31熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(P<0.05)，α-SMA熒光強(qiáng)度降低(P<0.05)；與rhBMP-7組相比，DMH-1組CD31熒光強(qiáng)度減弱(P<0.05)，α-SMA熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Immunofluorescence changes of pulmonary artery endothelial cells in each group (×400). Mean±SD.n=4.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsHH group;△P<0.05vsrhBMP-7 group.

圖1 各組大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞CD31和α-SMA的免疫熒光變化

2 各組細(xì)胞α-SMA、CD31和Smad1/5/8的mRNA表達(dá)情況

由RT-PCR結(jié)果顯示，與Con組相比，HH組α-SMA的mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)，CD31和Smad1/5/8的mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；與HH組相比，DMSO組α-SMA、CD31和Smad1/5/8的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)，而rhBMP-7組α-SMA的mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)，CD31和Smad1/5/8的mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；與rhBMP-7組相比，DMH-1組α-SMA 的mRNA水平升高(P<0.05)，Smad1/5/8和CD31的mRNA水平降低(P<0.05)，見圖2。

3 各組細(xì)胞α-SMA、CD31和p-Smad1/5/8的蛋白表達(dá)情況

由Western blot結(jié)果顯示，與Con組相比，HH組α-SMA的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，CD31和p-Smad1/5/8的蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05);與HH組相比，DMSO組α-SMA、CD31和p-Smad1/5/8的蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)，而rhBMP-7組α-SMA的蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，CD31和p-Smad1/5/8的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05);與rhBMP-7組相比，DMH-1組α-SMA的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，CD31和p-Smad1/5/8的蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，見圖3。

Figure 2. The mRNA expression levels of α-SMA, CD31 and Smad1/5/8 in each group. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsHH group;△P<0.05vsrhBMP-7 group.

圖2 各組細(xì)胞α-SMA、CD31和Smad1/5/8 mRNA的表達(dá)水平

Figure 3. The protein levels of α-SMA, CD31 and p-Smad1/5/8 in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsHH group;△P<0.05vsrhBMP-7 group.

圖3 各組α-SMA、CD31和p-Smad1/5/8蛋白的表達(dá)水平

4 各組細(xì)胞活力的情況

由CCK-8結(jié)果顯示，Con組的A值為1.519±0.038，與Con組相比，HH組的A值(1.204±0.085)減小(P<0.05)；DMSO組的A值(1.268±0.044)與HH組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，而rhBMP-7組A值(1.448±0.012)增大(P<0.05)；與rhBMP-7組相比，DMH-1組A值(0.928±0.012)減小(P<0.05)，見圖4。

5 各組細(xì)胞的遷移情況

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Con組的細(xì)胞遷移數(shù)相比，HH組遷移細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)；與HH組相比，DMSO組遷移細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，而rhBMP-7組的遷移細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)；與rhBMP-7組相比，DMH-1組遷移細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)，見圖5。

Figure 4. The viability of RPAECs in each group. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsHH group;△P<0.05vsrhBMP-7 group.

圖4 各組大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的變化

討 論

肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生并非罕見，目前估計(jì)，PH患病率約占全球人口的1%，而年齡超過(guò)65歲的人群則高達(dá)10%[9]。低氧是PH常見的誘導(dǎo)因素，而且PH的發(fā)生常常能引起機(jī)體CO2潴留，因此我們使用低O2和高CO2混合氣體條件下的細(xì)胞模型更符合臨床PH患者發(fā)病特點(diǎn)。肺動(dòng)脈高壓發(fā)展的主要病理變化是PVSR，PVSR發(fā)生過(guò)程中，前期肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常[10]，后期遠(yuǎn)端血管肌化增加，表達(dá)α-SMA的細(xì)胞大量積聚，并延伸到先前未肌化的血管中，從而引起嚴(yán)重的肺血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)改變[11-12]。近年的報(bào)道發(fā)現(xiàn)，ECs通過(guò)EndoMT可以表達(dá)α-SMA、波形蛋白和成纖維細(xì)胞特異蛋白1等，成為研究心肌纖維化、腎纖維化等具有血管重塑特點(diǎn)疾病的熱點(diǎn)[13]。但EndoMT是否參與HHPH及其潛在的機(jī)制尚未完全明確。

Figure 5. The migration ability of RPAECs in each group. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsHH group;△P<0.05vsrhBMP-7 group.

圖5 各組大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移情況

EndoMT是指ECs降低CD31和E-鈣黏蛋白等ECs特異性標(biāo)志物表達(dá)水平，而上調(diào)α-SMA、成纖維細(xì)胞特異蛋白1和波形蛋白等間充質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物表達(dá)水平的過(guò)程。ECs形態(tài)從鋪路石樣結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形結(jié)構(gòu)，且增殖和遷移能力也將改變[14-15]。在EndoMT過(guò)程中，ECs可同時(shí)存在內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的2種特征。因此，抑制EndoMT可能成為治療HHPH的新靶點(diǎn)。

目前認(rèn)為TGF-β家族與EndoMT發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。BMPs是TGF-β家族中的成員，主要是介導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化為軟骨和骨形成細(xì)胞。BMP-7又稱成骨蛋白1(osteogenic protein-1，OP-1)，近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)其具有抗血管重塑作用而逐漸成為研究熱點(diǎn)[16]。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠miR-4739過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)胸膜纖維化，給予外源性BMP-7后，E-鈣黏蛋白啟動(dòng)子活性以及mRNA水平下調(diào)從而能預(yù)防小鼠胸膜纖維化。Higgins等[18]發(fā)現(xiàn)，外源性rhBMP-7能抑制膠原蛋白Ⅰα1和膠原Ⅲα1基因表達(dá)和膠原蛋白Ⅰ蛋白的積累，同時(shí)增加單側(cè)輸尿管阻塞模型中腎臟膠原蛋白Ⅳα1的表達(dá)。BMPR是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，BMPⅠ型(BMPRⅠa和BMPRⅠb)和Ⅱ型(BMPRⅡ)受體以穩(wěn)定的同源以及瞬時(shí)異聚體受體復(fù)合物的形式存在[19-21]。Smads蛋白是BMPR下游關(guān)鍵的信號(hào)因子，與BMPR有關(guān)的Smad因子主要是受體激活的Smads。當(dāng)BMP-7與BMPR結(jié)合后，可以激活Smad1/5/8，再與共同的配體Smad4構(gòu)成復(fù)合物，然后易位到細(xì)胞核中誘導(dǎo)相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄[22]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Con組相比，HH組RPAECs的α-SMA蛋白和mRNA的表達(dá)增多，CD31蛋白和mRNA的表達(dá)量降低，細(xì)胞活力降低而遷移增多，說(shuō)明低氧高CO2誘導(dǎo)RPAECs發(fā)生了EndoMT；DMSO組與HH組相比，各組檢測(cè)指標(biāo)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中溶劑DMSO對(duì)RPAECs無(wú)明顯影響；與HH組比較，我們發(fā)現(xiàn)使用外源性rhBMP-7激活BMPR后，可出現(xiàn)Smad1/5/8的mRNA表達(dá)水平升高，Smad1/5/8的蛋白磷酸化增多，α-SMA 的mRNA和蛋白表達(dá)量減少，CD31的mRNA和蛋白表達(dá)量升高， RPAECs的活力升高而遷移減少，提示BMP-7/Smads通路激活可以緩解肺血管重塑，從而緩解PH。而DMH-1組與rhBMP-7組相比，DMH-1抑制了BMPR，出現(xiàn)了相反的變化，提示抑制BMP-7/Smads通路將加重肺血管重塑，促進(jìn)PH的發(fā)展。

綜上所述，低氧高二氧化碳環(huán)境可以誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndoMT，促進(jìn)PH的發(fā)展，其機(jī)制可能與BMP-7/Smads通路被抑制有關(guān)。