miR-485-5p靶向作用于SOX5抑制肝癌細(xì)胞Hep3B的活力及侵襲和遷移能力*

王常元， 范 偉， 馮新富， 張 瑩， 劉振華， 蔣 濤

(貴州省人民醫(yī)院 1肝膽外科二部, 2肝膽外科三部， 貴州 貴陽(yáng) 550002)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)簡(jiǎn)稱肝癌，是最常見的原發(fā)性肝癌，發(fā)病率位居全球腫瘤第6位[1]，占全球所有腫瘤發(fā)生率的7%[2]，患者長(zhǎng)期生存率較低，5年生存率低于15%。因此，研究肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對(duì)肝癌的個(gè)體化精準(zhǔn)治療極其重要。

研究表明，微小RNA-485-5p (microRNA-485-5p, miR-485-5p)可抑制食道癌[3]、小細(xì)胞肺癌[4]和肝癌[5]等腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖[6]。性別決定區(qū)Y框蛋白5(sex determining region Y-box protein 5, SOX5)在非小細(xì)胞肺癌[7]和三陰性乳腺癌[8]中相對(duì)高表達(dá)，其高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。但SOX5在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，以及miR-485-5p與SOX5在肝癌中的關(guān)系目前還尚未可知。本課題研究 miR-485-5p影響肝癌Hep3B細(xì)胞的活力及侵襲和遷移能力的分子機(jī)制，以及SOX5在此機(jī)制中的作用，以期為肝癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1臨床樣本 選取貴州省人民醫(yī)院2017年6月～2017年12月手術(shù)切除經(jīng)病理檢查確診為肝細(xì)胞癌的肝癌組織標(biāo)本和癌旁正常組織(與腫瘤組織臨近>1.5 cm)各22例，患者年齡為29～69歲，平均年齡(49.77±10.87)歲，組織標(biāo)本切除前患者均未進(jìn)行放化療等治療方式。樣本用途均與患者說明，并與患者簽訂知情同意書。

1.2細(xì)胞、試劑和儀器 人肝癌細(xì)胞株Huh7、Hep3B和HCCLM3及人正常肝細(xì)胞株THLE-3購(gòu)自ATCC。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco;胰蛋白酶(trypsin)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和MTT購(gòu)自Sigma-Aldrich；Transwell板購(gòu)自Corning；抗SOX5抗體、抗增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗體、抗Ki67抗體、抗細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)抗體、抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)抗體和抗β-actin抗體購(gòu)自Abcam；RT-qPCR引物, miR-485-5p模擬物(miR-485-5p mimics, miR-485-5p)和抑制物(anti-miR-485-5p)，SOX5的過表達(dá)載體(pcDNA-SOX5)和干擾物(SOX5 small interfering RNA, si-SOX5),空載體和陰性對(duì)照[miR-control (miR-con)、anti-miR-control (anti-miR-con)和si-control (si-con)]及雙螢光素酶載體購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(dual-luciferase reporter assay system)購(gòu)自Promega；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、總RNA提取試劑盒、 real-time PCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。顯微鏡、發(fā)光儀、酶標(biāo)儀及real-time PCR儀購(gòu)自Bio-Rad。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將肝癌細(xì)胞Hep3B、Huh7和HCCLM3及人正常肝細(xì)胞株THLE-3培養(yǎng)于含10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，顯微鏡下觀察，胰蛋白酶消化傳代。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep3B細(xì)胞以每孔2×105個(gè)接種于6孔板中，觀察細(xì)胞至融合度為80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。先用無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋脂質(zhì)體和各組片段及載體，將等體積稀釋的脂質(zhì)體和各組載體片段輕柔混勻，室溫下孵育20 min，將混合液加入到培養(yǎng)好的Hep3B細(xì)胞中，輕柔混勻，培養(yǎng)6 h，換成RPMI-1640完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

2.3RT-qPCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，根據(jù)Total RNA提取試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作，提取細(xì)胞總RNA，然后以RNA為模板按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，再以cDNA為模板按照 real-time PCR的說明書進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)? 95 ℃ 4 min；95 ℃ 45 s、58 ℃ 35 s、72 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。miR-485-5p的上游引物序列為5’-AGAGGCTGGCCGTGATGAATTC-3’，下游采用試劑盒通用引物；SOX5的上游引物序列為5’-CAGCCAGAGTTAGCAATAGG-3’，下游引物序列為5’-CTGTTGTTCCCGTCGGAGTT-3’； U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCAGCACATATA-3’,下游引物序列為5’-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’；β-actin的上游引物序列為5’-CAGGGCGTGATGGTGGGCA-3’,下游引物學(xué)序列為5’-CAAACATCATCTGGGTCATCTTCTC-3’。

2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液，室溫裂解20 min，超聲破碎細(xì)胞，收集蛋白并檢測(cè)濃度。進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的 I 抗[抗SOX5抗體(1∶1 200)、抗PCNA抗體(1∶1 000)、抗Ki67抗體(1∶500)、抗cyclin D1抗體(1∶1 500)、抗MMP-2抗體(1∶1 000)和抗β-actin抗體(1∶1 500)]，4 ℃孵育過夜，洗膜3次，然后加入稀釋的 II 抗，室溫孵育1 h，顯影。以β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

2.5MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力 收集轉(zhuǎn)染后的Hep3B細(xì)胞，消化細(xì)胞，稀釋細(xì)胞至1×107/L，以每孔200 μL將細(xì)胞接種于96孔板中，分別在培養(yǎng)至24 h、48 h和72 h進(jìn)行 MTT 實(shí)驗(yàn)，每孔加入 20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔再加入150 μL DMSO，室溫震蕩混勻5 min，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm處的吸光度(A)值。

2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力 遷移實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的各組Hep3B細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用含1% BSA的RPIM-1640培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至2×108/L。在Transwell下層小室加入500 μL含10% FBS的RPIM-1640培養(yǎng)基，上層加入100 μL稀釋好的細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用棉簽拭去上層小室的細(xì)胞，甲醛固定遷移的細(xì)胞30 min，結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel膠用4 ℃無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶8比例稀釋，加入上層小室，37 ℃ 烘3 h使稀釋后的Matrigel膠成為固態(tài)，以下步驟同遷移實(shí)驗(yàn)，上層小室加入100 μL細(xì)胞，下層加入含10% FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，固定細(xì)胞，染色，計(jì)數(shù)。

2.7免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌組織和癌旁組織中SOX5的表達(dá) 用4%多聚甲醛固定肝癌和癌旁組織樣本，梯度乙醇脫水，然后進(jìn)行石蠟包埋，切片，按常規(guī)程序脫蠟和水化，用3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶15 min，然后用枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，再用10%正常山羊血清37 ℃ 封閉30 min，加入1∶300稀釋的SOX5抗體，4 ℃過夜孵育，用PBS緩沖液清洗3次，加入稀釋的生物素標(biāo)記Ⅱ抗，37 ℃孵育30 min，滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物工作液，37 ℃孵育30 min，洗3次，加DAB顯色液，避光顯色，終止顯色。蘇木素襯染胞核，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，37 ℃干燥48 h，顯微鏡觀察并照相。以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。

2.8雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 按照2.2的步驟培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建好的SOX5的野生型(wild-type SOX5, SOX5-WT)和突變型(mutant SOX5, SOX5-MUT)雙螢光素酶報(bào)告載體分別與miR-con或miR-485-5p共轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)好的Hep3B細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，室溫裂解轉(zhuǎn)染的細(xì)胞20 min，離心收集上清，加入螢光素酶底物，發(fā)光儀檢測(cè)酶活性。以海腎螢光素酶活性為內(nèi)參照，計(jì)算螢火蟲螢光素相對(duì)酶活性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差進(jìn)行分析, 以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-485-5p和SOX5在肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)

與正常肝細(xì)胞THLE-3相比，miR-485-5p在肝癌細(xì)胞Hep3B、Huh7和HCCLM3組中的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，SOX5 的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；免疫組化結(jié)果顯示，與正常癌旁組織相比，肝癌組織中的SOX5水平顯著升高，見圖1。miR-485-5p和SOX5在3個(gè)肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況一致，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇表達(dá)差異更大的Hep3B細(xì)胞進(jìn)行研究。

2 miR-485-5p過表達(dá)可抑制Hep3B細(xì)胞的活力

與miR-con組相比，miR-485-5p組Hep3B細(xì)胞中的miR-485-5p表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞活力在48 h和72 h均顯著降低(P<0.05)，PCNA、Ki67和cyclin D1的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖2，說明過表達(dá)miR-485-5p可抑制Hep3B細(xì)胞的生長(zhǎng)。

3 miR-485-5p過表達(dá)可抑制Hep3B細(xì)胞的遷移和侵襲能力

與miR-con組相比，miR-485-5p組Hep3B細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著下降(P<0.05)，MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),見圖3，說明過表達(dá)miR-485-5p可抑制Hep3B細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

4 miR-485-5p靶向調(diào)控SOX5

SOX5的3’ UTR序列中含有與miR-485-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖4A。雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果顯示，與miR-con組相比，miR-485-5p組野生型SOX5-WT的螢火蟲螢光素酶相對(duì)活性顯著下降(P<0.05)，而突變型SOX5-MUT的螢火蟲螢光素酶相對(duì)活性沒有明顯變化,見圖4B。Western blot結(jié)果表明，與miR-con組相比，miR-485-5p組的SOX5蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；與anti-miR-con組相比，anti-miR-485-5p組的SOX5蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，見圖4C。

Figure 1. The expression of miR-485-5p was low in hepatocellular carcinoma cell lines and the expression of SOX5 was relatively high. A and B: the expression of miR-485-5p and the mRNA level of SOX5 were detected by RT-qPCR; C: the protein level of SOX5 was detected by Western blot; D: immunohistochemistry was used to detect the SOX5 expression (×200). Mean±SD.n=9.*P<0.05vsTHLE-3 group.

圖1 miR-485-5p在肝癌細(xì)胞系中低表達(dá)而SOX5相對(duì)高表達(dá)

5 敲減SOX5的表達(dá)可抑制Hep3B細(xì)胞的活力及遷移和侵襲能力

與si-con組相比，si-SOX5組Hep3B細(xì)胞的A值在48 h和72 h顯著降低(P<0.05)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著下降(P<0.05)，SOX5、PCNA、Ki67、cyclin D1和MMP-2蛋白的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，見圖5，說明敲減SOX5的表達(dá)可抑制Hep3B細(xì)胞的活力、遷移和侵襲能力。

6 過表達(dá)SOX5部分逆轉(zhuǎn)了miR-485-5p過表達(dá)對(duì)Hep3B細(xì)胞活力及遷移和侵襲能力的抑制作用

與miR-con組相比，miR-485-5p組Hep3B細(xì)胞的活力在48 h和72 h均顯著降低(P<0.05)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著下降(P<0.05)，SOX5、PCNA、Ki67、cyclin D1和MMP-2蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與miR-485-5p+pcDNA組相比，miR-485-5p+pcDNA-SOX5組Hep3B細(xì)胞的活力在48 h和72 h顯著上升(P<0.05)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著上升(P<0.05)，SOX5、PCNA、Ki67、cyclin D1和MMP-2蛋白的表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，見圖6，說明SOX5過表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-485-5p對(duì)Hep3B細(xì)胞的活力及遷移和侵襲能力的抑制作用。

討 論

肝癌的復(fù)雜性和異質(zhì)性導(dǎo)致其非常難以治愈，即使手術(shù)切除或消融后，仍有70%的患者在5～10年內(nèi)經(jīng)歷腫瘤復(fù)發(fā)，晚期患者的治療效果微乎其微[9]。研究肝癌發(fā)展機(jī)制，對(duì)肝癌患者的個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療具有重要作用。

研究表明，大量miRNA在肝癌中表達(dá)異常，通過mTOR、Wnt、JAK/STAT和MAPK通路參與肝癌的發(fā)生，與腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)密切相關(guān)，并可作為肝癌的診斷、預(yù)后標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)[10-11]。Sun等[12]

Figure 2. Over-expression of miR-485-5p inhibited the viability and the expression of PCNA, Ki67 and cyclin D1 in the Hep3B cells. A: the expression level of miR-485-5p was detected by RT-qPCR; B: the cell viability was detected by MTT assay; C: the protein levels of cyclin D1, Ki67 and PCNA were detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmiR-con group.

圖2 miR-485-5p過表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞活力及PCNA、Ki67和cyclin D1的表達(dá)

Figure 3. Over-expression of miR-485-5p inhibited the migration and invasion abilities of Hep3B cells. A: the migration and invasion abilities were detected by Transwell assay (×100); B: the protein level of MMP-2 was detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmiR-con group.

圖3 miR-485-5p過表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力

Figure 4. miR-485-5p targeted SOX5 and regulated its expression. A: 3′UTR of SOX5 contains a nucleotide sequence complementary to miR-485-5p; B: the luciferase activity was detected by dual-luciferase reporter assay; C: the protein level of SOX5 was detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmiR-con group;#P<0.05vsanti-miR-con group.

圖4 miR-485-5p靶向調(diào)控SOX5的表達(dá)

Figure 5. Knock-down ofSOX5inhibited the viability, migration and invasion of Hep3B cells. A: the cell viability was detected by MTT assay; B: the migration and invasion abllities were detected by Transwell assay; C: the protein levels were detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vssi-con group.

圖5 敲減SOX5的表達(dá)抑制Hep3B細(xì)胞的活力、遷移和侵襲能力

Figure 6. Over-expression of SOX5 partially reversed the effects of miR-485-5p over-expression on the viability, migration and invasion of the Hep3B cells. A: the cell viability was detected by MTT assay; B: the migration and invasion abilities were detected by Transwell assay (×100); C: the protein levels were detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmiR-con group;#P<0.05vsmiR-485-5p+pcDNA group.

圖6 過表達(dá)SOX5部分逆轉(zhuǎn)miR-485-5p過表達(dá)對(duì)Hep3B細(xì)胞活力及遷移和侵襲能力的抑制作用

研究表明，miR-485-5p在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，其表達(dá)與肝癌組織TNM分期和轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，過表達(dá)miR-485-5p可抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-485-5p在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，是DSCR8的結(jié)合位點(diǎn)，通過激活Wnt /β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)肝癌進(jìn)展。本研究結(jié)果表明，與人正常肝細(xì)胞THLE-3相比，miR-485-5p在肝癌細(xì)胞Hep3B、Huh7和HCCLM3中表達(dá)均顯著下調(diào)，過表達(dá)miR-485-5p可抑制Hep3B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，與前述研究結(jié)果一致，再次證實(shí)miR-485-5p在肝癌中的作用。

TargetScan預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SOX5的3’UTR序列中含有與miR-485-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，提示miR-485-5p與SOX5之間可能存在調(diào)控關(guān)系，也提示SOX5可能參與肝癌的發(fā)展。SOX5是SOX(SRY-related high-mobility-group box)家族成員之一，其基因定位于染色體12p12.1，可直接結(jié)合DNA或其它蛋白調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化[14]，在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。SOX5在非小細(xì)胞肺癌[15]和乳腺癌[16]中表達(dá)量顯著升高，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，體外抑制SOX5可抑制NSCLC腫瘤生長(zhǎng)。前列腺癌患者SOX5高表達(dá)意味著腫瘤更易發(fā)生轉(zhuǎn)移，無(wú)進(jìn)展生存率和腫瘤特異性生存率也較低[17]。Wang等[18]研究表明，SOX5在肝細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中明顯上調(diào)，其通過Twist1和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，SOX5在肝癌細(xì)胞Hep3B、Huh7和HCCLM3中表達(dá)量顯著升高，敲減SOX5的表達(dá)可抑制肝癌Hep3B細(xì)胞的活力及遷移和侵襲能力，與Wang等[18]研究結(jié)果一致，證實(shí)了SOX5在肝癌發(fā)展中具有重要作用。

此外，Western blot和雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，miR-485-5p靶向負(fù)調(diào)控SOX5的表達(dá)，過表達(dá)SOX5可部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-485-5p對(duì)Hep3B細(xì)胞活力及遷移和侵襲能力的抑制作用，證實(shí)了在肝癌中miR-485-5p和SOX5之間具有調(diào)控關(guān)系。

本研究闡述了在肝癌Hep3B細(xì)胞中過表達(dá)miR-485-5p可靶向抑制SOX5的表達(dá)，進(jìn)而抑制Hep3B細(xì)胞的活力、遷移和侵襲能力。綜上所述，miR-485-5p和SOX5有望成為肝癌診斷和治療的分子靶點(diǎn)，為肝癌的診斷和治療提供了新的研究方向。