MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞兩種低氧模型的建立與比較分析*

方天星， 倪玉芳， 賴德平， 曾凡才△

(西南醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 2公共衛(wèi)生學(xué)院， 四川 瀘州 646000)

細(xì)胞處于低氧狀態(tài)是一種普遍存在于生物機(jī)體內(nèi)的生理和病理生理現(xiàn)象。隨著低氧時(shí)間、程度以及環(huán)境的改變, 低氧環(huán)境對(duì)于細(xì)胞的影響既可是積極的，也可以是消極的。特別是在哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育過程中，子宮內(nèi)環(huán)境氧體積分?jǐn)?shù)在1%～5%(pO20.5～30 mmHg)之間，這種低氧環(huán)境可促進(jìn)大多數(shù)器官的發(fā)育及形態(tài)形成[1]。此外，在實(shí)體瘤中，隨著腫瘤細(xì)胞的快速增殖，迅速消耗了正常血管系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，誘發(fā)腫瘤內(nèi)部的低氧。這種低氧環(huán)境使腫瘤有更高的局部復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率，以及更低的遠(yuǎn)期生存率[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)低氧與乳腺癌的侵襲性密切相關(guān)，腫瘤侵襲性可增加乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)以及對(duì)放化療的抵抗等[4-5]。細(xì)胞為適應(yīng)低氧環(huán)境，低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是起關(guān)鍵性作用的轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1是由α和β 兩個(gè)亞基組成的異二聚體蛋白，其中HIF-1β是組成性表達(dá)，而HIF-1α是HIF-1獨(dú)有的受氧濃度調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)。在常氧條件下細(xì)胞表達(dá)的HIF-1α?xí)焖俳到?，但在低氧狀態(tài)下卻保持穩(wěn)定，與HIF-1β形成轉(zhuǎn)錄因子HIF-1后調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)[6],因此，HIF-1α對(duì)HIF-1的活性起決定性作用。

既然腫瘤細(xì)胞常處于低氧環(huán)境，因此選擇恰當(dāng)?shù)牡脱跫?xì)胞模型研究低氧對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的分子機(jī)制十分重要。目前，模擬細(xì)胞低氧主要有兩類方法，一類是用可調(diào)節(jié)氧氣濃度的低氧小室或者三氣培養(yǎng)箱來培養(yǎng)細(xì)胞的物理低氧模型；另一類則是用化學(xué)低氧模擬劑處理細(xì)胞的化學(xué)低氧模型，如HIF-脯氨酰羥化酶抑制劑二甲基草酰甘氨酸(dimethyloxalylglycine，DMOG)、甲磺酸去鐵胺(deferoxamine，DFO)和CoCl2等[7]。本研究首先建立目前實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用較廣泛的三氣培養(yǎng)法和化學(xué)試劑CoCl2法兩種低氧乳腺癌細(xì)胞模型，然后探討兩種低氧模型在HIF-1α的表達(dá)與穩(wěn)定性以及細(xì)胞活力、凋亡、侵襲與遷移等方面的差異，為低氧細(xì)胞模型的選擇和腫瘤細(xì)胞的低氧研究提供參考。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫。CoCl2購(gòu)自Sigma；基質(zhì)膠(Matrigel)和凋亡試劑盒Annexin V PE Apoptosis Detection Kit I均購(gòu)自BD；CCK-8試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Solarbio；Transwell小室購(gòu)自Millicell；Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)購(gòu)自Gibco；兔抗HIF-1α(ab2185)、兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)(ab37150)和鼠抗Bcl-2(ab117115)抗體均購(gòu)自Abcam。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1兩種低氧模型的構(gòu)建 MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞置于含10%胎牛血清的Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況2～3 d進(jìn)行換液或者傳代。常氧培養(yǎng)條件為溫度37 ℃，空氣，100%濕度。兩種低氧模型分別為化學(xué)低氧模型和物理低氧模型。為建立化學(xué)低氧模型，首先以滅菌注射用水配制濃度為10 mmol/L CoCl2貯存液，再用貯存液配制50～300 μmol/L 不同CoCl2濃度的Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)細(xì)胞24 h、48 h和72 h形成模擬低氧環(huán)境。物理低氧模型采用三氣培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置氧體積分?jǐn)?shù)梯度分別為1%、2%和5%，其中每一個(gè)氧濃度梯度下再選擇3個(gè)時(shí)點(diǎn)，分別為4 h、16 h和24 h。為便于同時(shí)檢測(cè)3個(gè)時(shí)點(diǎn)的樣品以減少實(shí)驗(yàn)誤差，所有細(xì)胞均在常氧條件下預(yù)培養(yǎng)過夜后，先將24 h處理組放入三氣培養(yǎng)箱；8 h后，再將16 h處理組放入三氣培養(yǎng)箱；繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，又將4 h處理組放入三氣培養(yǎng)箱；再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，同時(shí)取出3個(gè)處理時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞樣品進(jìn)行蛋白提取，并嚴(yán)格控制在5 min內(nèi)完成從三氣培養(yǎng)箱取出到刮取細(xì)胞至離心管這一系列操作。

2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞，在96孔板中加入100 μL(密度5×107/L)的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)過夜，化學(xué)低氧細(xì)胞以含有不同CoCl2濃度的培養(yǎng)基分別處理24 h、48 h和72 h；物理低氧細(xì)胞置于2% O2處理24 h，處理時(shí)間結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基同時(shí)每孔加入100 μL CCK-8反應(yīng)液(10 μL CCK-8+90 μL無血清培養(yǎng)基)，繼續(xù)孵育3 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 收集6孔板細(xì)胞，從離開培養(yǎng)環(huán)境開始計(jì)時(shí)，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入150 μL RIPA裂解液，刮取貼壁細(xì)胞至離心管這一系列操作嚴(yán)格控制在5 min內(nèi)。隨后冰上裂解10 min。10%的超聲強(qiáng)度冰上超2 s，停3 s，重復(fù)5次、4 ℃，16 000 r/min 離心10 min，吸取上清BCA測(cè)定總蛋白濃度。其余加入5×上樣緩沖液至終濃度為1×，沸水煮沸5 min后，冰上放置2 min。SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，4 ℃過夜孵育 I 抗，TBST洗膜15 min后，用HRP標(biāo)記的 II 抗溶液在室溫孵育1 h，TBS洗膜5 min后化學(xué)發(fā)光顯色。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 化學(xué)低氧細(xì)胞以含有100 μmol/L CoCl2的培養(yǎng)基處理24 h，物理低氧細(xì)胞置于2% O2處理24 h。處理時(shí)間結(jié)束后，用不含EDTA的胰酶同時(shí)消化細(xì)胞，收集細(xì)胞使每組細(xì)胞密度不少于1×105個(gè)。預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000×g離心5 min，為避免細(xì)胞被吸棄，小心吸棄并保留30 μL左右上清。加入500 μL的binding buffer充分懸浮細(xì)胞，依次加入5 μL PE-annexin V和5 μL 7-氨基放線菌素D (7-aminoactinomycin)混勻后，室溫避光孵育15 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.5Transwell實(shí)驗(yàn) 4 ℃過夜溶解Matrigel，之后在預(yù)冷的Transwell侵襲小室中每孔加入100 μL稀釋好的Matrigel(無血清培養(yǎng)基稀釋至濃度為1.0 g/L)，置37 ℃、無CO2孵箱中培養(yǎng)4 h。細(xì)胞用胰酶消化，稀釋成1×109/L的無血清的細(xì)胞懸液，化學(xué)低氧細(xì)胞添加CoCl2使其終濃度100 μmol/L。Transwell侵襲小室中每孔加200 μL細(xì)胞懸液，同時(shí)在侵襲小室的下室中加入600 μL含20% FBS培養(yǎng)基，以便形成趨化梯度。培養(yǎng)24 h后，取出侵襲小室，棄去其中的細(xì)胞培養(yǎng)液，用棉簽拭去小室內(nèi)表面的細(xì)胞，然后PBS漂洗2次。隨后固定液室溫固定20 min，PBS漂洗2次；0.5%結(jié)晶紫染液室溫染色30 min，PBS漂洗2次，顯微鏡觀察，成像。

2.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 在24孔板中加入1 mL細(xì)胞懸液(密度2×108/L)，培養(yǎng)過夜觀察細(xì)胞密度達(dá)80%～90%，用10 μL移液槍輕輕劃線，垂直90度，用力均勻，確保劃線處無細(xì)胞，并用PBS液洗滌2次后顯微鏡拍照記錄。然后細(xì)胞更換為2% FBS培養(yǎng)基，化學(xué)低氧細(xì)胞添加CoCl2使其終濃度為100 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再次拍照記錄。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 化學(xué)低氧模型的建立

化學(xué)試劑CoCl2處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，隨著CoCl2濃度的增加，細(xì)胞活力呈被抑制趨勢(shì)，當(dāng)CoCl2濃度為300 μmol/L時(shí)開始顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.05)，見圖1A；如果處理時(shí)間增加至48 h和72 h，150 μmol/L的CoCl2就開始顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.01)，見圖1B、C。當(dāng)CoCl2濃度為100 μmol/L時(shí),處理24 h、48 h和72 h對(duì)細(xì)胞的活力均無顯著抑制作用，如果將CoCl2濃度增加到150 μmol/L，處理48 h就抑制細(xì)胞活力(P<0.05)，72 h差異更顯著(P<0.01)，見圖1D。綜合不同時(shí)間及濃度的CCK-8檢測(cè)結(jié)果，如果CoCl2濃度為100 μmol/L，處理時(shí)間24 h將不會(huì)抑制細(xì)胞活力，但Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HIF-1α高表達(dá)，說明在此條件下即可成功構(gòu)建化學(xué)低氧模型，見圖1E。因此，為了不抑制細(xì)胞活力，最終選擇CoCl2處理時(shí)間為24 h、處理濃度為100 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 物理低氧模型的建立

根據(jù)文獻(xiàn)和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了3種不同程度低氧(1%、2%和5% O2)和3個(gè)時(shí)點(diǎn)(4 h、16 h和24 h)來營(yíng)造低氧環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞，并利用Western blot檢測(cè)HIF-1α蛋白表達(dá)(依據(jù)抗體說明書，40～80 kD條帶為降解的HIF-1α，110～130 kD條帶為翻譯后修飾的HIF-1α)。結(jié)果顯示在不同程度低氧情況下，HIF-1α蛋白表達(dá)水平均隨著時(shí)間的增加而升高,表明物理低氧模型構(gòu)建成功，見圖2A～C。從三氣培養(yǎng)箱取出細(xì)胞至常氧環(huán)境下進(jìn)行蛋白提取的短時(shí)間內(nèi)，HIF-1α?xí)l(fā)生大量降解。如果處理時(shí)間為24 h，氧體積分?jǐn)?shù)分別選擇1%、2%和5%，結(jié)果顯示2% O2處理細(xì)胞的HIF-1α蛋白表達(dá)最強(qiáng),見圖2D。如果2% O2分別處理4 h、16 h和24 h，CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與常氧對(duì)照組相比，低氧處理4 h后細(xì)胞活力并未發(fā)生明顯改變，16 h和24 h細(xì)胞活力明顯受到抑制(P<0.01)，見圖2E。這一結(jié)果提示物理低氧抑制細(xì)胞活力呈時(shí)間依賴性。因此，后續(xù)物理低氧模型選擇2% O2處理細(xì)胞24 h。

3 兩種低氧模型中HIF-1α蛋白表達(dá)的差異

由于化學(xué)低氧和物理低氧屬于兩種不同類型的細(xì)胞模型，而HIF-1α蛋白是細(xì)胞在低氧狀態(tài)下的核心分子。比較兩種模型的HIF-1α蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)存在明顯差異。物理低氧細(xì)胞的HIF-1α蛋白表達(dá)明顯高于化學(xué)低氧，但未降解HIF-1α蛋白低于化學(xué)低氧；兩種低氧模型細(xì)胞在70 kD左右的HIF-1α降解蛋白的大小和量也不一致。上述結(jié)果說明物理低氧細(xì)胞的HIF-1α蛋白量多，特別是氧體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，并且在從低氧裝置取出后進(jìn)入復(fù)氧狀態(tài)的短時(shí)間內(nèi)會(huì)發(fā)生快速降解?；瘜W(xué)低氧模型細(xì)胞雖然不易受氧體積分?jǐn)?shù)的影響，但也同樣存在HIF-1α蛋白的降解，并且降解的HIF-1α蛋白的分子量與物理低氧有些許差異,見圖3。這說明這兩種低氧模型可能還存在不同的HIF-1α蛋白降解或修飾機(jī)制。

Figure 1. Establishment of chemical hypoxia model of MDA-MB-231 cells. A, B and C: the viability of the MDA-MB-231 cells treated with CoCl2at different concentrations for 24 h, 48 h and 72 h, respectively; D: the viability of the cells treated with CoCl2at 100 μmol/L or 150 μmol/L for different time; E: the protein expression levels of HIF-1α in the cells treated with CoCl2at 100 μmol/L for 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group;△△P<0.01vscontrol group.

圖1 化學(xué)低氧模型的建立

4 兩種低氧模型的細(xì)胞凋亡差異

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，對(duì)照組凋亡率為1.635%±0.005%，CoCl2處理的化學(xué)低氧組凋亡率為1.595%±0.045%，2% O2處理的物理低氧組凋亡率為6.555%±0.275%。以上結(jié)果表明，CoCl2處理后未見細(xì)胞凋亡發(fā)生明顯變化(P>0.05)，而2% O2處理后細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.01)，見圖4A。此外，檢測(cè)抗凋亡蛋白Bcl-2的結(jié)果顯示，與對(duì)照組(常氧)相比，CoCl2組Bcl-2蛋白表達(dá)未見明顯變化(P>0.05)，但在1%和2% O2處理后明顯降低(P<0.01),見圖4B。

5 兩種低氧模型的乳腺癌細(xì)胞在侵襲和遷移上的差異

當(dāng)以不同程度低氧處理MDA-MB-231細(xì)胞時(shí)，1%和2% O2組的MMP-2蛋白表達(dá)增加十分明顯，尤以2% O2組最高，5% O2組僅少量增強(qiáng)，見圖5A。

Figure 2. Establishment of physical hypoxia model of MDA-MB-231 cells. A, B and C: the expression levels of HIF-1α in the MDA-MB-231 cells exposed to different volume fractions of oxygen for different time were assessed by Western blot; D: the protein expression levels of HIF-1α in the cells exposed to different volume fractions of oxygen for 24 h (n=3); E: the effects of 2% O2on the cell viability (n=4). Mean±SD.**P<0.01vscontrol group.

圖2 物理低氧模型的建立

Figure 3. The differences in protein expression levels of HIF-1α between the 2 hypoxia models of MDA-MB-231 cells. For physical hypoxia model, the cells were exposed to hypoxia with different volume fractions of oxygen for 24 h, and for chemical hypoxia model, the cells were treated with CoCl2at concentration of 100 μmol/L for 24 h. The expression levels of HIF-1α were assessed by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 兩種低氧模型中HIF-1α蛋白表達(dá)的差異

化學(xué)低氧組的MMP-2蛋白表達(dá)也比對(duì)照組有所增加，但幅度低于1%和2% O2組，見圖5B。由于物理低氧模型會(huì)造成細(xì)胞凋亡，故不能利用Transwell和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步展示細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化，但對(duì)化學(xué)低氧模型細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)。Transwell結(jié)果顯示，經(jīng)CoCl2處理24 h后，細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)，侵襲細(xì)胞數(shù)目約為對(duì)照組的2～3倍(P<0.01)，見圖5C。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)CoCl2處理細(xì)胞的遷移能力也明顯增強(qiáng)(P<0.05)，見圖5D。

Figure 4. The differences in apoptosis of the MDA-MB-231 cells between the 2 hypoxia models. A: for chemical hypoxia model, the cells were treated with CoCl2at concentration of 100 μmol/L for 24 h, and for physical hypoxia model, the cells were exposed to hypoxia with 2% oxygen for 24 h, then the cell apoptosis was analyzed by flow cytometry; B: the results of Western blot for determining the protein expression levels of Bcl-2 in the MDA-MB-231 cells treated with CoCl2; C: the results of Western blot for determining the protein expression levels of Bcl-2 in the cells exposed to different volume fractions of oxygen. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖4 兩種低氧模型細(xì)胞凋亡的差異

討 論

據(jù)報(bào)道，發(fā)生于女性的惡性腫瘤中，僅乳腺癌就占據(jù)30%[8]，其中又以三陰性乳腺癌侵襲性強(qiáng)，惡性程度高，預(yù)后差[9-10]。研究表明在正常乳腺組織中，平均氧濃度為8.6%，但是在乳腺癌組織中，平均氧濃度低至1.5%[11-12]。由此可見低氧環(huán)境對(duì)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞只在低氧狀態(tài)下能保持HIF-1轉(zhuǎn)錄因子的活性，但在常氧條件下會(huì)發(fā)生快速降解[13],其分子機(jī)制是在常氧時(shí)，HIF-1的HIF-1α亞基的氧依賴降解結(jié)構(gòu)域中脯氨酸殘基會(huì)在脯氨酰羥化酶催化下與O2發(fā)生羥化反應(yīng)，羥化的HIF-1α可被von Hippel-Lindau(VHL)抑癌基因產(chǎn)物pVHL蛋白特異結(jié)合，此結(jié)合蛋白經(jīng)泛素化修飾后降解。因此，HIF-1轉(zhuǎn)錄因子在常氧環(huán)境下無活性。但在低氧環(huán)境下，由于氧濃度不足，脯氨酰羥化酶不能將HIF-1α蛋白羥化，不發(fā)生HIF-1α蛋白的快速降解。HIF-1α可進(jìn)入細(xì)胞核與HIF-1β形成異二聚體HIF-1轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)，發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)[14],上述機(jī)制即為物理低氧細(xì)胞模型的工作原理。另有研究發(fā)現(xiàn)，化學(xué)試劑CoCl2的Co2+可置換脯氨酰羥化酶的Fe2+,從而抑制脯氨酰羥化酶的活性，以阻止HIF-1α被羥基化后降解[15]。這是CoCl2處理的化學(xué)低氧細(xì)胞模型的工作原理。兩種模型均會(huì)保持HIF-1α蛋白的穩(wěn)定，使HIF-1發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。

乳腺癌細(xì)胞MCF-7對(duì)于不同濃度CoCl2的耐受能力差別較大[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CoCl2對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的抑制同樣呈現(xiàn)時(shí)間及濃度依賴性，但可以找到對(duì)細(xì)胞活力影響小的濃度和時(shí)點(diǎn); 而物理低氧模型卻不易找到對(duì)細(xì)胞活力影響小的時(shí)點(diǎn)。4 h的時(shí)間太短，細(xì)胞還未完成分裂，16 h和24 h的低氧環(huán)境均會(huì)抑制細(xì)胞活力。畢竟由于工作原理的差異，兩種類型低氧模型中低氧的核心分子HIF-1α蛋白的表達(dá)和穩(wěn)定性也存在一定的差異。首先，從量上看物理低氧的HIF-1α蛋白比化學(xué)低氧更多，且差異十分顯著；其次，從穩(wěn)定性上看將物理低氧的細(xì)胞從低氧培養(yǎng)箱取出到提取蛋白的很短復(fù)氧時(shí)間內(nèi)，HIF-1α即可發(fā)生快速降解。按照工作原理，化學(xué)低氧的細(xì)胞應(yīng)該不會(huì)發(fā)生降解，但Western blot結(jié)果顯示也有一定的降解，只是降解的比例小于物理低氧。其原因可能是為了不影響細(xì)胞生長(zhǎng)而選擇低濃度的CoCl2，但低濃度的CoCl2對(duì)脯氨酰羥化酶活性的抑制不完全，會(huì)使部分HIF-1α蛋白發(fā)生降解。此外，化學(xué)低氧降解條帶的大小與物理低氧略有差異，說明可能這兩種模型的HIF-1α蛋白降解和修飾機(jī)制有一定程度的不同[17]。

Figure 5. The differences in the invasion and migration ablilites of the MDA-MB-231 cells between the 2 hypoxia models. For physical hypoxia model, the cells were exposed to hypoxia with different volume fractions of oxygen for 24 h, and for chemical hypoxia model, the cells were treated with CoCl2at concentration of 100 μmol/L for 24 h. A and B: the images of Western blot for determining the protein expression of MMP-2; C: the cell invasion ability detected by Transwell assay; D: the cell migration ability assessed by wound-healing assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5 兩種低氧模型的乳腺癌細(xì)胞在侵襲和遷移上的差異

有文獻(xiàn)證實(shí)，HIF-1α可能主要通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白[18]的表達(dá)而非P53途徑來發(fā)揮抗A549細(xì)胞的凋亡作用[19]。本研究中2% O2處理后細(xì)胞凋亡增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，提示HIF-1α可能下調(diào)Bcl-2表達(dá)并誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。而與對(duì)照組相比，CoCl2處理組未檢測(cè)到細(xì)胞凋亡增加和Bcl-2蛋白的明顯變化，其原因應(yīng)該是化學(xué)低氧模型是將CoCl2處理濃度和時(shí)間控制在適宜范圍內(nèi)，從而避免了凋亡細(xì)胞的增加。

MMP-2蛋白通過降解Ⅳ型膠原促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[20]。有文獻(xiàn)證實(shí)，低氧環(huán)境下乳腺癌細(xì)胞通過依賴膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1(MT1-MMP)活化MMP-2酶原而促進(jìn)侵襲[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1%和2% O2處理后MMP-2蛋白表達(dá)特別強(qiáng)，尤其是在2% O2處理后，但在5% O2處理后僅有少量增加。在低氧狀態(tài)下，MMP-2表達(dá)如此強(qiáng)，說明低氧狀態(tài)下的乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力會(huì)增強(qiáng)[22]。而在5% O2處理后MMP-2表達(dá)增加不多，其原因可能與O2體積分?jǐn)?shù)要低于5% HIF-1α蛋白才穩(wěn)定有關(guān)[23]。雖然在低氧狀態(tài)下MMP-2蛋白大量表達(dá)，但是由于低氧會(huì)影響細(xì)胞的增殖，無法用Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的侵襲和遷移能力。不過對(duì)于CoCl2處理的化學(xué)低氧模型，同樣觀察到了MMP-2蛋白表達(dá)增加，并通過Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲及遷移能力的增強(qiáng)，說明低氧環(huán)境能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力。

綜上所述，雖然這兩種都是常用低氧模型，但由于工作原理的差別，實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的差異。不過這兩種模型都是使HIF-1α蛋白不降解，以保證HIF-1發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。因此，各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)方案的需要，選擇一種方式建立低氧模型進(jìn)行研究。如果條件允許，我們推薦物理低氧模型，畢竟它才是真實(shí)的低氧環(huán)境。而且物理低氧模型細(xì)胞會(huì)有更強(qiáng)的HIF-1α和MMP-2蛋白表達(dá)，也不用擔(dān)心化學(xué)低氧模擬劑作用于細(xì)胞內(nèi)的其它分子導(dǎo)致結(jié)果差異。