冠心病患者來(lái)源HDL對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積及凋亡的影響*

王 遠(yuǎn)， 高宏偉， 馮高潔， 代 佩， 張秦風(fēng)， 白 瑞， 秦衛(wèi)偉， 李 虹， 高 奮

(山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院， 山西 太原 030001)

脂蛋白代謝異常是動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素。低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)水平與冠心病發(fā)病呈正相關(guān)，而高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)通過(guò)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)、抗凋亡和抗炎等機(jī)制發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[1]。然而多個(gè)臨床研究(ILLUMINATE、dal-OUTCOMES、AIM-HIGH和HPS2-THRIVE)卻表明應(yīng)用膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑雖然可顯著升高HDL水平，但心血管事件和死亡風(fēng)險(xiǎn)非但沒(méi)有下降，反而明顯增加[2]，提示單純升高HDL水平并不能發(fā)揮HDL的抗動(dòng)脈硬化效應(yīng)。HDL是由載脂蛋白與脂質(zhì)組成的大顆粒分子，功能上具有高度的異質(zhì)性。已有研究證實(shí)，在糖尿病[3]、代謝綜合征、感染[4]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[5]等炎癥性疾病時(shí)，功能正常的HDL向“失功能HDL”轉(zhuǎn)變，其抗動(dòng)脈粥樣硬化能力下降并具有促動(dòng)脈硬化作用[6-7]。然而，在冠心病條件下，HDL的功能改變?nèi)绾?，尚缺乏文獻(xiàn)報(bào)道。本研究將通過(guò)提取健康(healthy)人群、穩(wěn)定型冠心病(stable coronary artery disease, SCAD)和急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI) 3類人群的HDL，體外觀察不同人群HDL對(duì)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1 人群資料

選擇2018年1月～2018年6月山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科住院患者200例，其中男性112例，女性88例，年齡48～72歲，根據(jù)冠脈造影結(jié)果分為冠脈正常對(duì)照組65例、穩(wěn)定型冠心病組68例和急性心肌梗死組67例。記錄各組一般資料并進(jìn)行生化檢驗(yàn)，包括性別、年齡、體重、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)、吸煙史、空腹血糖(fasting glucose，F(xiàn)G)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein chesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein chesterol, HDL-C)。所有患者均簽署知情同意書，如未取得知情同意，退出本研究。本研究獲得山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段嚴(yán)格執(zhí)行醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)規(guī)章制度。入選患者均排除內(nèi)分泌疾病、嚴(yán)重肝腎功能異常、嚴(yán)重感染、重度貧血、心臟瓣膜病和腫瘤等疾病。

穩(wěn)定型冠心病的診斷依據(jù)2007版《慢性穩(wěn)定型心絞痛診斷及治療指南》，慢性穩(wěn)定型心絞痛指心絞痛發(fā)作的程度、頻率、性質(zhì)及誘發(fā)因素在數(shù)周內(nèi)無(wú)顯著變化的患者，通常見于冠狀動(dòng)脈至少一支主要分支管腔直徑狹窄在50%以上，當(dāng)體力或精神應(yīng)激時(shí)，冠狀動(dòng)脈血流不能滿足心肌代謝的需要，導(dǎo)致心肌缺血，而引起的心絞痛發(fā)作，休息或含服硝酸甘油可緩解的患者。

急性心肌梗死的診斷依據(jù)2012年ESC《第3版心肌梗死全球定義》，AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)為檢測(cè)到心臟生物標(biāo)志物心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)上升和(或)下降超過(guò)健康人群參考值上限(upper reference limit，URL)第99百分位，且符合下列條件中的至少1項(xiàng)：(1)有缺血癥狀；(2)新出現(xiàn)或很可能新出現(xiàn)ST段顯著抬高或T波改變，或新出現(xiàn)左束支傳導(dǎo)阻滯；(3)心電圖出現(xiàn)病理性Q波；(4)有新出現(xiàn)的存活心肌損失或新出現(xiàn)局部室壁運(yùn)動(dòng)異常的影像學(xué)證據(jù)；(5)血管造影或尸檢發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓。入選患者除滿足上述條件外，均滿足發(fā)病24 h內(nèi)，行急診冠狀動(dòng)脈造影檢查并證實(shí)存在單支或多支血管急性閉塞或伴急性血栓形成。

健康對(duì)照組無(wú)典型缺血性胸痛，心電圖大致正常，經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)冠狀動(dòng)脈無(wú)斑塊及狹窄。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡雄性C57/BL6J小鼠，18～20 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SXXK (晉) 2015-0001。

3 主要試劑

氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)購(gòu)自上海昂羽生物技術(shù)有限公司；巰基乙酸鈉(BD)；抗ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G1(ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1)、Bax和Bcl-2抗體均購(gòu)自于Abcam；抗GAPDH抗體(BioWorld);抗β-actin抗體、goat anti-mouse IgG、goat anti-rabbit IgG、RPMI-1640培養(yǎng)基、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超敏化學(xué)發(fā)光試劑和RIPA裂解緩沖液(博士德生物科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液和飽和油紅O染色液(Solarbio)；活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Beyotime)；ACK紅細(xì)胞裂解液(北京諾博萊德科技有限公司)。

4 主要方法

4.1HDL的提取及鑒定 利用溴化鉀(KBr)將收集好的新鮮血漿密度調(diào)整為1.24×103g/L， 加入含密度為1.063×103g/L的KBr溶液的離心管底部，配平后，65 000 r/min離心320 min。血漿經(jīng)超速離心后大致分3層：最上層為TG、極低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein, VLDL)和LDL，中間層為HDL，底層為無(wú)脂血漿。采用腰穿針將中層HDL吸出后，通過(guò)PD-10脫鹽柱透析。透析后的HDL冷凍成固態(tài)后置入冷凍離心干燥機(jī)凍干，約12 h后可形成HDL粉末。HDL粉末溶于去離子水后采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，本研究中1.5 mL血漿提出的HDL粉末溶于250 μL去離子水后所測(cè)的蛋白濃度約為2 g/L。采用SDS-PAGE法鑒定HDL純度。

4.2小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及鑒定 將巰基乙酸鈉與去離子水配制成2%巰基乙酸鈉溶液，121℃滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?周齡C57/BL6J小鼠予腹腔注射2 mL 2%巰基乙酸鈉溶液，刺激72 h。頸椎脫臼處死，乙醇浸泡3 min，剪開皮膚，充分暴露腹膜，腹腔內(nèi)注射10 mL預(yù)冷PBS，輕柔5 min，用注射器抽取腹腔灌洗液至15 mL離心管中，800 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL ACK裂解液裂解3～5 min。離心后20% FBS RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于37 ℃孵箱內(nèi)，4 h后PBS沖洗未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞為純度較高的原代巨噬細(xì)胞。采用F4/80抗體進(jìn)行標(biāo)記，熒光顯微鏡鑒定巨噬細(xì)胞純度。

4.3實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 提取的巨噬細(xì)胞按每孔1×106個(gè)接種于6孔板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)分組如下：(1)對(duì)照(control)組：無(wú)干預(yù)措施；(2)ox-LDL組：50 mg/L ox-LDL干預(yù)24 h；(3)ox-LDL+HDLhealthy組：50 mg/L ox-LDL及50 mg/L HDLhealthy聯(lián)合培養(yǎng)24 h；(4)ox-LDL+HDLSCAD組：50 mg/L ox-LDL及50 mg/L HDLSCAD聯(lián)合培養(yǎng)24 h；(5)ox-LDL+HDLAMI組：50 mg/L ox-LDL及50 mg/L HDLAMI聯(lián)合培養(yǎng)24 h。

4.4巨噬細(xì)胞油紅O染色 飽和油紅O原液與去離子水按3∶2體積比配制油紅O工作液，混勻，室溫放置5～10 min，過(guò)濾后備用。染色步驟：(1)吸棄各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液，PBS漂洗3次；(2)4%多聚甲醛固定30 min，蒸餾水浸洗后60%異丙醇浸洗1 min；(3)油紅O工作液染色30 min；(4)60%異丙醇漂洗20 s；(5)蒸餾水洗；(6)甘油明膠封片；(7)倒置顯微鏡觀察脂質(zhì)染色結(jié)果，采集圖像。

4.5Western blot實(shí)驗(yàn) 提取各組細(xì)胞總蛋白，以BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度。取100 μg樣品蛋白于沸水1 min變性，取20 μg蛋白樣本用SDS-PAGE分離，電泳完畢后半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBST封閉2 h，分別加入稀釋好的 I 抗(抗β-actin、ABCA1、ABCG1、Bax和Bcl-2抗體，均按1∶1 000稀釋)，4 ℃搖床低速過(guò)夜。TBST充分洗滌后加入相應(yīng)稀釋 II 抗室溫輕搖2 h，TBST再次充分洗滌。ECL法顯影，分析條帶灰度值，以β-actin為參照，用待測(cè)蛋白灰度值與內(nèi)參的比值來(lái)表示蛋白表達(dá)水平。

4.6巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS含量的測(cè)定 采用ROS測(cè)試盒各組細(xì)胞ROS的含量。DCFH-DA原液與PBS按1 ∶1 000配制成工作液。干預(yù)結(jié)束時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，用PBS漂洗3次，各取1 mL 工作液加入各實(shí)驗(yàn)組，37 ℃，避光孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，采集圖像。

4.7巨噬細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 用annexin V/PI法檢測(cè)巨噬細(xì)胞凋亡率，操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理及分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。人群資料數(shù)據(jù)分析前均進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同人群臨床數(shù)據(jù)的比較

入選穩(wěn)定型冠心病患者68例、急性心肌梗死67例及年齡、性別匹配的冠狀動(dòng)脈造影正常者65例。各組間體重指數(shù)(body mass index，BMI)、SBP、DBP、FG和TG水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與對(duì)照組比較，SCAD組及AMI組LDL-C和HDL-C的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同人群臨床資料比較

BMI: body mass index; SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure; FG: fasting glucose; TG: triglyceride; LDL-C: low-density lipoprotein chesterol; HDL-C: high-density lipoprotein chesterol; SCAD: stable coronary artery disease; AMI: acute myocardium infarction.

2 血漿HDL的分離及鑒定

血漿經(jīng)超速離心后大致分3層：最上層為TG、VLDL和LDL，中間層為HDL，底層為無(wú)脂血漿，見圖1A。采用SDS-PAGE鑒定HDL純度，由于HDL中主要成分為ApoA-I，在30 kD處可見蛋白富集，與血漿樣本比較，白蛋白(分子量約72 kD)被大量去除，見圖1B。

Figure 1. Isolation and identification of HDL from different subjects. A: different fractions of plasma after sequential ultracentrifugation; B: SDS-PAGE of HDL and plasma. Lane 1: HDL from healthy subjects; Lane 2: HDL from patients with stable coronary artery disease; Lane 3: HDL from patients with acute myocardium infarction.

圖1 不同人群HDL的提取及鑒定結(jié)果

3 小鼠腹腔來(lái)源巨噬細(xì)胞鑒定

光鏡下巨噬細(xì)胞呈圓形、橢圓形、三角形或不規(guī)則形，有偽足和突起。熒光顯微鏡下巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志F4/80呈紅色熒光，DAPI染核，可確定巨噬細(xì)胞純度達(dá)95%以上，見圖2。

Figure 2. Identification of mouse peritoneal macrophages by F4/80 (×40).

圖2 小鼠腹腔來(lái)源巨噬細(xì)胞的鑒定結(jié)果

4 油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴含量

與對(duì)照組相比，經(jīng)ox-LDL單獨(dú)或聯(lián)合HDL處理后巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯增加(P<0.05)；與ox-LDL單獨(dú)處理相比，聯(lián)合HDLhealthy處理后巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積減少，而聯(lián)合HDLSCAD或HDLAMI處理后巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積增加(P<0.05)；與HDLSCAD組相比，HDLAMI組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積進(jìn)一步增加(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. Intracellular lipid deposition in mouse peritoneal macrophages. The levels of intracellular lipids were determined by oil red O staining (×200). A: control group； B：ox-LDL group; C: ox-LDL+HDLhealthygroup; D: ox-LDL+HDLSCADgroup; E: ox-LDL+HDLAMIgroup. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;&P<0.05vsD.

圖3 用油紅O染色法測(cè)定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積

5 不同來(lái)源HDL對(duì)泡沫細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，經(jīng)ox-LDL單獨(dú)或聯(lián)合HDL處理后巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS的含量明顯增加；與ox-LDL單獨(dú)處理相比，聯(lián)合HDLhealthy處理后巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS的生成減少，而聯(lián)合HDLSCAD或HDLAMI處理后巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS的水平反而增加(P<0.05)；與HDLSCAD組相比，HDLAMI組巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS的水平進(jìn)一步增加(P<0.05)，見圖4。

6 不同來(lái)源HDL對(duì)泡沫細(xì)胞ABCA1和ABCG1表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，經(jīng)ox-LDL單獨(dú)處理或聯(lián)合HDL處理后巨噬細(xì)胞內(nèi)ABCA1和ABCG1的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與單純ox-LDL處理組相比，HDLhealthy處理后巨噬細(xì)胞內(nèi)ABCA1和ABCG1的表達(dá)進(jìn)一步增加(P<0.05)，而聯(lián)合HDLSCAD或HDLAMI處理后巨噬細(xì)胞內(nèi)ABCA1和ABCG1的表達(dá)反而下調(diào)(P<0.05)；與HDLSCAD組比較，HDLAMI組ABCA1和ABCG1的表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)(P<0.05)，見圖5。

7 不同來(lái)源HDL對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，ox-LDL處理后巨噬細(xì)胞凋亡增加；與ox-LDL處理組比較，HDLhealthy可抑制巨噬細(xì)胞細(xì)胞凋亡，而HDLSCAD或HDLAMI處理后巨噬細(xì)胞凋亡反而增加;與HDLSCAD處理組比較，HDLAMI處理組巨噬細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高(P<0.05)，見圖6。

Figure 4. Intracellular ROS levels were measured by DCF analysis under fluorescence microscope (×200). A: control group; B: ox-LDL group; C: ox-LDL+HDLhealthygroup; D: ox-LDL+HDLSCADgroup; E: ox-LDL+HDLAMIgroup. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;&P<0.05vsD.

圖4 熒光DCF法測(cè)定巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS結(jié)果

Figure 5. The protein expression of ABCA1 and ABCG1 in the mouse peritoneal macrophages was determined by Western blot. A: control group; B: ox-LDL group; C: ox-LDL+HDLhealthygroup; D: ox-LDL+HDLSCADgroup; E: ox-LDL+HDLAMIgroup. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;&P<0.05vsD.

圖5 Western blot法檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞ABCA1和ABCG1蛋白的表達(dá)

8 不同來(lái)源HDL對(duì)巨噬細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，ox-LDL處理巨噬細(xì)胞后Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與單純ox-LDL處理組比較，HDLhealthy處理后Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，而經(jīng)HDLSCAD或HDLAMI處理后Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與HDLSCAD處理組比較，HDLAMI處理后Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，見圖7。

討 論

脂代謝異常與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病密切相關(guān)。LDL尤其是ox-LDL是巨噬細(xì)胞泡沫化的重要誘導(dǎo)劑。細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度沉積形成氧化固醇，后者可激活核肝X受體α和β上調(diào)ABCA1和ABCG1表達(dá)[8]。HDL是膽固醇從細(xì)胞內(nèi)流出必不可少的受體。新生的HDL顆粒在ABCA1的介導(dǎo)下從外周細(xì)胞攝取游離膽固醇，進(jìn)而進(jìn)一步酯化形成球形HDL顆粒(α-HDL)，α-HDL在ABCG1的介導(dǎo)進(jìn)一步獲取游離膽固醇，將膽固醇從巨噬細(xì)胞內(nèi)移出發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL后脂質(zhì)沉積增加，ABCA1和ABCG1表達(dá)上調(diào)，而來(lái)源于健康人群的HDL(HDLhealthy)可進(jìn)一步上調(diào)ABCA1和ABCG1表達(dá)，從而減輕泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。

在慢性炎癥性疾病如糖尿病、代謝綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及慢性腎臟疾病時(shí)，HDL發(fā)生“失功能”改變?！笆Чδ蹾DL”表現(xiàn)為HDL顆粒成分及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[10]。前期我們對(duì)337例患者(190例經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)為冠心病，127例冠狀動(dòng)脈造影正常)的HDL亞組及ApoA-I含量進(jìn)行分析，證實(shí)冠心病患者HDL成熟障礙，大顆粒HDL比例降低，小顆粒HDL比例增加，大顆粒HDL下降水平與ApoA-I水平呈正相關(guān)[11]。蛋白組學(xué)分析提示失功能HDL顆粒內(nèi)ApoA-I含量減少，SAA和MPO含量增加[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也已證明SAA和MPO可抑制膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)誘導(dǎo)脂質(zhì)沉積增加[13]，這表明，失功能HDL的成分改變可抑制正常的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)功能。本研究中我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與HDLhealthy處理相比，來(lái)源于冠心病患者的HDL(HDLCAD)反而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積增加，并下調(diào)ABCA1和ABCG1表達(dá)，提示冠心病患者來(lái)源的HDL損害了正常的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)功能，引起巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，但其分子機(jī)制尚不明確。

Figure 6. The apoptotic rate of the macrophages was analyzed by flow cytometry with annexin V/PI staining. A: control group; B: ox-LDL group; C: ox-LDL+HDLhealthygroup; D: ox-LDL+HDLSCADgroup; E: ox-LDL+HDLAMIgroup. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;&P<0.05vsD.

圖6 Annexin V/PI法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的凋亡

Figure 7. The protein expression of Bcl-2 and Bax in mouse peritoneal macrophages was determined by Western blot. A: control group; B: ox-LDL group; C: ox-LDL+HDLhealthygroup; D:ox-LDL+HDLSCADgroup; E: ox-LDL+HDLAMIgroup. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;&P<0.05vsD.

圖7 Western blot法檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)

HDL的氧化修飾是HDL失功能改變的重要機(jī)制。冠心病患者體內(nèi)氧化修飾高密度脂蛋白(ox-HDL)水平升高，且ox-HDL水平與冠狀動(dòng)脈狹窄程度呈正相關(guān)[14]。而HDL經(jīng)過(guò)氧化修飾后其改善內(nèi)皮功能和抗內(nèi)皮凋亡能力減弱[15]，具有促動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng)。HDL經(jīng)氧化修飾后產(chǎn)生抗原特異性表位，同ox-LDL一樣也容易被巨噬細(xì)胞吞噬。本研究中我們發(fā)現(xiàn)HDLhealthy可抑制泡沫細(xì)胞內(nèi)活性氧生成，而經(jīng)HDLCAD處理后泡沫細(xì)胞內(nèi)活性氧生成進(jìn)一步增加，推測(cè)與泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積密切相關(guān)。將HDLCAD尾靜脈注射至ApoE-/-小鼠體內(nèi)，可誘導(dǎo)斑塊進(jìn)展加速，并且HDLCAD可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白tBid的表達(dá)增加[16]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)HDLhealthy可減輕ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，提示健康人的HDL具有抗凋亡作用，而經(jīng)HDLCAD處理后巨噬細(xì)胞凋亡比例升高，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和bax表達(dá)失衡，提示HDLCAD喪失了正常的抗動(dòng)脈粥樣硬化功能，具有促動(dòng)脈硬化作用。

本研究中我們首次發(fā)現(xiàn)HDLCAD可促進(jìn)泡沫細(xì)胞脂質(zhì)沉積，并下調(diào)ABCA1和ABCG1表達(dá)，推測(cè)與HDLCAD誘導(dǎo)活性氧生成及促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡相關(guān)。但其詳細(xì)分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討，這也為HDL功能恢復(fù)研究提供了潛在的治療靶點(diǎn)。