小茴香飲片的粉末均勻化研究*

王新慧，李 敏，柴 欣，王躍飛，楊 靜

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

小茴香為傘形科植物茴香（Foeniculum vulgare Mill.）的干燥成熟果實(shí)，始載于《唐本草》，味辛，溫，具有散寒、理氣和胃的功效[1]。鹽小茴香具有暖腎，散寒的功效，用于寒疝腹痛、睪丸偏墜、?，F(xiàn)代藥理研究證明，小茴香具有顯著的抑菌、調(diào)節(jié)胃腸機(jī)能、利尿等作用，同時(shí)還具有利膽、保肝、促滲、抗癌、抗氧化抗突變及性激素樣等作用[2-5]。

中藥“標(biāo)準(zhǔn)飲片”作為中藥提取物和中成藥生產(chǎn)中的原料，可以全面的表征中藥飲片特征屬性，進(jìn)而完整控制飲片中藥效物質(zhì)，更專屬、更準(zhǔn)確地分別評(píng)價(jià)生、制飲片質(zhì)量，保障中藥飲片的安全性、有效性、質(zhì)量可控[6-7]。粉碎工藝的優(yōu)化是標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化過(guò)程的重要環(huán)節(jié)，是后續(xù)一系列對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)飲片內(nèi)涵屬性研究的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)以出粉率和紫丁香苷（SG）、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷（QG）的含量為指標(biāo)，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，采用“蛛網(wǎng)模式”[8-9]優(yōu)選生小茴香和鹽小茴香標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化工藝，為制定生小茴香和鹽小茴香標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化技術(shù)規(guī)范提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ACQUITYTMUPLC system 超高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；XS 205 型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司），AL 204 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；DL 180E 型智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司；功率：180W，頻率：50 kHz）；TGL-16C 型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Milli-Q 型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；HYC-940 醫(yī)用冷藏箱（青島海爾特種電器有限公司）；藥篩：1～9 號(hào)（上虞市沖壓篩具廠）；FW80 型粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。微量進(jìn)樣器（平頭10 μL，上海高鴿工貿(mào)有限公司），硅膠G 板（200 mm×100 mm，青島海洋化工分廠）。

1.2 試劑 生小茴香購(gòu)自河北春開(kāi)制藥股份有限公司，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定為傘形科植物茴香（Foeniculum Vulgaer Mill.）的干燥成熟果實(shí)。鹽小茴香：嚴(yán)格按照2015 版《中華人民共和國(guó)藥典》鹽炙法（通則0213）炮制。紫丁香苷（批號(hào)111574-201605）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷（批號(hào)R24S7F21842）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，HPLC 分析純度均≥95%。茴香醛（批號(hào)110838-201106）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、甲酸均為色譜純，水為超純水。本文中小茴香是生小茴香和鹽小茴香的統(tǒng)稱；紫丁香苷簡(jiǎn)稱為SG；槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷簡(jiǎn)稱為QG。

2 方法

2.1 色譜條件 超高效液相色譜條件色譜柱ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：甲醇（B）-0.1%甲酸水（A），梯度洗脫（0～7 min，95% →63.5% A；7～12 min，63.5% →15% A）；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：2 μL[10]。

薄層色譜條件按照2015 版《中華人民共和國(guó)藥典》中薄層色譜法（通則0502）實(shí)驗(yàn)，吸取樣品和對(duì)照品溶液各1～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17∶2.5）為展開(kāi)劑，展至8 cm，取出，晾干，噴以二硝基苯肼試液，日光下檢視。

2.2 對(duì)照品溶液制備 分別取SG、QG 對(duì)照品適量，精密稱定，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。分別取上述SG、QG 對(duì)照品儲(chǔ)備液500 μL、700 μL，置于5 mL 容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為99.30 mg/mL、123.8 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液，供定量分析用。

取茴香醛對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL 含1 μL的溶液，作為對(duì)照溶液，供薄層鑒別用。

2.3 供試品溶液的制備 取小茴香粉末0.5 g，精密稱定，置于25 mL 的容量瓶中，加適量50%甲醇，密塞，超聲處理（功率144 W，頻率50 kHz）20 min，放冷，50%甲醇定容至刻度，搖勻，14 000 r/min 離心10 min，取上清液，過(guò)濾，取續(xù)濾液1 mL，加1 mL 蒸餾水，混勻，供定量分析用。

取小茴香粉末2 g，加乙醚20 mL，超聲處理（功率144 W，頻率50 kHz）10 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)尤燃淄? mL 使溶解，供薄層鑒別用。

2.4 不同目數(shù)的小茴香飲片粉末分布及對(duì)指標(biāo)成分的影響研究 取生小茴香和鹽小茴香各100 g，粉碎機(jī)單次粉碎10 s，采用《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)藥篩制備不同粒度的粉末，稱取不同藥篩上未通過(guò)該藥篩的樣品粉末重量，分別計(jì)算其比例。按“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品A ～H（生小茴香飲片粉末）和樣品A'～H'（鹽小茴香飲片粉末）制備含量測(cè)定和薄層鑒別樣品，按“2.1”色譜條件測(cè)定供試品溶液中SG、QG 的含量，薄層色譜條件鑒別不同粒度小茴香飲片粉末。

2.5 基于“蛛網(wǎng)模式”的小茴香飲片粉碎工藝正交實(shí)驗(yàn)研究 以粉碎時(shí)間、粉碎次數(shù)、投料量（以投料藥材占粉碎室的體積計(jì)）為因素，以出粉率、化合物含量為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，借鑒本課題組研究的“蛛網(wǎng)模式”[11]原理，優(yōu)選最佳粉碎工藝。Ga、G'a 分別代表生小茴香和鹽小茴香中出粉率，SG 和QG 的總量為Za 和Z'a，其中a 為不同粉碎方式（9 個(gè)正交實(shí)驗(yàn)組，a 為1～9）的小茴香飲片粉末樣品。

為了消除不同指標(biāo)取值范圍差異對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的影響，需對(duì)不同變量指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理。生小茴香和鹽小茴香樣品中最大出粉率為Ga（max）和G'a（max）；SG 和QG 的最高總含量為Za（max）和Z'a（max）。將所得指標(biāo)的數(shù)值分別除以其最大值，得到出粉率的歸一化結(jié)果分別為Qa 和Q'a，SG、QG總量的歸一化結(jié)果分別為Ha 和H'a。計(jì)算公式1、2如下所示。

通過(guò)計(jì)算Qa 和Ha（Q'a 和H'a）組成的陰影部分面積，優(yōu)選生小茴香和鹽小茴香飲片的最佳粉碎方式，其歸一化面積分別為S 和S'，計(jì)算公式3、4如下所示。

2.6 小茴香飲片最佳粉碎工藝研究驗(yàn)證 取生小茴香和鹽小茴香，以確定的小茴香最佳粉碎工藝制備小茴香標(biāo)準(zhǔn)飲片粉末，計(jì)算出粉率；按“2.3”項(xiàng)下方法制備小茴香飲片粉末供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定供試品溶液中SG、QG 的含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同目數(shù)的小茴香飲片粉末分布及對(duì)指標(biāo)成分的影響研究 由圖1 所示，小茴香飲片粉末全部通過(guò)10 目篩，生品中56.29%粉末通過(guò)24 目篩，鹽品粉末中75.99%通過(guò)24 目篩；生品粉末中33.49%通過(guò)50 目篩，鹽品粉末中43.17%通過(guò)50 目篩；生品鹽品中均未有粉末通過(guò)200 目篩。由結(jié)果可以看出經(jīng)過(guò)高溫炮制之后的小茴香飲片，質(zhì)地更為疏松，更利于粉碎。SG 和QG 指標(biāo)含量隨標(biāo)準(zhǔn)篩目數(shù)增加，含量增加。薄層色譜結(jié)果顯示生品鹽品中茴香醛的含量隨標(biāo)準(zhǔn)篩目數(shù)增加，斑點(diǎn)顏色加深。鹽品中茴香醛斑點(diǎn)強(qiáng)度弱于生品中茴香醛強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 不同目數(shù)小茴香飲片粉末質(zhì)量（A）、指標(biāo)成分含量（B）、指標(biāo)成分質(zhì)量（C）的折線圖

圖2 不同生小茴香飲片粉末（A）、鹽小茴香飲片粉末（B）薄層色譜圖

3.2 基于“蛛網(wǎng)模式”的小茴香飲片粉碎工藝正交實(shí)驗(yàn)研究 結(jié)合小茴香飲片粉末目數(shù)分布的結(jié)果和2015 版《中華人民共和國(guó)藥典》小茴香項(xiàng)下的相關(guān)規(guī)定，采用中國(guó)藥典規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)藥篩三號(hào)篩制備小茴香標(biāo)準(zhǔn)飲片粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備小茴香飲片粉末供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定供試品溶液中指標(biāo)成分的含量。以粉碎時(shí)間、粉碎次數(shù)、投料量（以投料藥材占粉碎室的體積計(jì)）為因素，以出粉率、化合物含量為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選最佳粉碎工藝，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

按“2.5”項(xiàng)下計(jì)算公式對(duì)小茴香粉末出粉率、化合物含量進(jìn)行歸一化處理，計(jì)算其歸一化面積，結(jié)果見(jiàn)圖3。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)助手對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以歸一化面積（S）為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，考察因素對(duì)生小茴香飲片研究結(jié)果的歸一化面積的影響為：粉碎次數(shù)＞粉碎時(shí)間＞投料量，最佳粉碎工藝為A3B3C3，即投料量為1/2 粉碎室的體積，單次粉碎時(shí)間40 s，粉碎3 次，過(guò)50 目篩，即得?？疾煲蛩貙?duì)鹽小茴香飲片研究結(jié)果的歸一化面積的影響為：粉碎次數(shù)＞投料量＞粉碎時(shí)間，最佳粉碎工藝為A3B2C3，即投料量為1/2 粉碎室的體積，單次粉碎時(shí)間40 s，粉碎2 次，過(guò)50 目篩，即得。

3.3 生小茴香和鹽小茴香飲片最佳粉碎工藝驗(yàn)證研究 采用“2.6”項(xiàng)下方法，采用最佳粉碎工藝制備小茴香標(biāo)準(zhǔn)飲片粉末，計(jì)算出粉率及SG、QG 的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

綜上可知，采用最佳粉碎工藝制備的生小茴香飲片的出粉率84.93%，RSD 為1.44%（n=3）；SG、QG的總含量為3.473 mg/g，RSD 為1.01%（n=3），說(shuō)明生小茴香最佳粉碎工藝穩(wěn)定、可行。采用最佳粉碎工藝制備的鹽小茴香飲片的出粉率92.01%，RSD為0.57%（n=3）；SG、QG 的總含量為1.740 mg/g，RSD 為1.50%（n=3），說(shuō)明鹽小茴香最佳粉碎工藝穩(wěn)定、可行。

表1 小茴香飲片粉碎工藝正交實(shí)驗(yàn)表

表2 小茴香飲片最佳粉碎工藝驗(yàn)證結(jié)果

圖3 基于“蛛網(wǎng)模式”對(duì)小茴香飲片粉碎工藝研究結(jié)果

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)利用“蛛網(wǎng)模式”的研究方法，通過(guò)出粉率、指標(biāo)成分的總含量計(jì)算歸一化面積（S），采用正交實(shí)驗(yàn)法以S 為指標(biāo)對(duì)小茴香進(jìn)行粉末均勻化工藝研究。經(jīng)粉碎工藝放大驗(yàn)證，該方法可行，為小茴香的標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化技術(shù)規(guī)范制定提供參考依據(jù)。