TLR-3激動(dòng)劑聯(lián)合TLR-9激動(dòng)劑對(duì)樹突狀細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)及免疫表型的影響*

沈季敏 劉欣 王興兵

急性髓系白血?。ˋcute myeloid leukemia，AML）起源于骨髓細(xì)胞，是一種進(jìn)展迅速的造血系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。近年來(lái)研究表明，白血病干細(xì)胞（leukemia stem cell，LSC）可能是造成白血病發(fā)生和發(fā)展、耐藥和復(fù)發(fā)的根本原因[2，3]。本實(shí)驗(yàn)選用CD34+白血病細(xì)胞作為靶細(xì)胞?；跇渫粻罴?xì)胞（Dendritic Cells，DCs）的免疫治療是目前清除AML微小殘留（Minimal Residual Disease，MRD）很有前景的一種治療手段[4]。尤其不能做異基因造血干細(xì)胞移植的有高危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者能從中獲益。DCs是目前已知的功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，能夠加工、處理并將抗原信息傳遞給T淋巴細(xì)胞，顯著刺激初始型T細(xì)胞增殖，引發(fā)一系列特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。目前，AML的免疫細(xì)胞治療已有一定的實(shí)驗(yàn)室和臨床研究[5]。利用DC遞呈腫瘤相關(guān)抗原，啟動(dòng)特異性抗腫瘤免疫受到廣泛關(guān)注，但由于腫瘤細(xì)胞可通過(guò)分泌某些可溶性細(xì)胞因子抑制DC的成熟和功能，所以人們嘗試?yán)妹庖咦魟┗蛲ㄟ^(guò)體外培養(yǎng)方法制備DC疫苗，用于促進(jìn)DC的成熟，增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)[6]。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是新近發(fā)現(xiàn)的天然免疫受體，表達(dá)于多種細(xì)胞，尤其是參與機(jī)體第一道防線的細(xì)胞，如DC、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，它們分別識(shí)別不同的外源性配體和/或內(nèi)源性配體[7]。TLR 結(jié)合配體后，能通過(guò)一系列蛋白質(zhì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和Jun/Fos，引起 IL-1、IL-6、IL-12、IL-8、TNF-α及IFN-γ等細(xì)胞因子的釋放，同時(shí)上調(diào)DC表面MHCⅠ、Ⅱ類分子和CD80、CD86等協(xié)同刺激分子的表達(dá)，促進(jìn)DC成熟[8]。本研究擬通過(guò)TLR3激動(dòng)劑poly（I∶C）聯(lián)合TLR9激動(dòng)劑（CpG ODN）促進(jìn)負(fù)載凋亡CD34+白血病細(xì)胞的DC成熟，研究TLR激動(dòng)劑對(duì)負(fù)載CD34+白血病細(xì)胞的DC的細(xì)胞形態(tài)及免疫表型的影響，從而優(yōu)化免疫佐劑的選擇和DC疫苗制備方案。

材料與方法

1 主要試劑 胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索來(lái)寶 （solarbio） 公司，CD14磁珠、CD34磁珠購(gòu)自德國(guó)美天旎公司，CD11c-APC、CD14-PE、CD86-PE購(gòu)自 eBioscience公司；細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4、TNF-α均購(gòu)自PeprTech 公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自 Hyclone 公司；poly I：C、CpG ODN 購(gòu)自上海生工生物公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DC的培養(yǎng)：抽取完全緩解期AML患者的新鮮外周血，肝素抗凝，分離PBMC，磁珠分選出CD14+單核細(xì)胞。用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液分選的單核細(xì)胞的濃度調(diào)整為2×106/mL，置于6孔培養(yǎng)板中，加入GM-CSF 1000 U/mL、IL-4 500 U/mL，每48 h半量換液及添加細(xì)胞因子，48 h后同時(shí)加入TNF-α50 U/mL，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37℃含5% CO2的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察每日細(xì)胞形態(tài)，第5天收集細(xì)胞。

2.2 CD34+白血病細(xì)胞的分選：采集初治的AML患者骨髓血，密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，磁珠分選出CD34+白血病細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，1h后加入去甲氧柔紅霉素（15 ng/mL）和蛋白酶體抑制劑（bortezomib，0.25 μM），18小時(shí)后，收集細(xì)胞。洗滌2次后，與DC按1∶2混合培養(yǎng)2 h。

2.3 TLR激動(dòng)劑刺激培養(yǎng)DC：將負(fù)載凋亡CD34+白血病細(xì)胞的DC稀釋成1×106/mL，實(shí)驗(yàn)分為四組：A對(duì)照組：僅加入培養(yǎng)介質(zhì)；B組：加入TLR3激動(dòng)劑（poly I∶C，50 μg/mL）；C組：TLR9激動(dòng)劑（CpG DNA，1 μmol/L）；D組：加入TLR3激動(dòng)劑（poly I∶C，50 μg/mL）聯(lián)合TLR9激動(dòng)劑（CpG DNA，1 μmol/L），72 h后收集細(xì)胞。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC細(xì)胞表型變化：收集各組細(xì)胞，離心（400 g，5 min，20℃）棄去上清，同超凈臺(tái)中取總細(xì)胞數(shù)約1×105置于流式管中，離心（400 g，5 min，20℃）棄上清，用PBS-E溶液漂洗2次，然后取分別加入5μL抗人CD11c、CD86，于37℃避光標(biāo)記30 min，用PBS-E液洗滌細(xì)胞2次，最后用0.5 mL的PBS-E溶液懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定DC細(xì)胞表面CD11c、CD86的表達(dá)情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)比較在方差齊性時(shí)采用方差分析，兩兩均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，應(yīng)用FlowJo軟件分析流式結(jié)果、Graphpad prism 5軟件作圖，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 倒置顯微鏡40倍鏡下觀察 分離得到的CD14+單核細(xì)胞體積小，形態(tài)呈圓形，表面無(wú)突起，第3天，細(xì)胞體積增大，部分細(xì)胞懸浮，同時(shí)有小的突起；培養(yǎng)至第5天，可見(jiàn)大量細(xì)胞懸浮，細(xì)胞表面可見(jiàn)多個(gè)突起，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組第8天生長(zhǎng)狀態(tài)明顯較對(duì)照組好，且D組DC胞體體積更大，細(xì)胞膜表面有更明顯的分枝狀突起，呈集落分布，提示DC成熟度更高。圖1為DC培養(yǎng)形態(tài)變化過(guò)程。

2 CD14+PBMC細(xì)胞純度檢測(cè) 因患者依從性，及最終經(jīng)藥物化療可達(dá)到完全緩解且可順利收集到標(biāo)本等各種因素，最終納入本研究的臨床初發(fā)急性髓系白血病例數(shù)為3例，從PBMC中分選的CD14+細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)純度為（97.62±1.32）%（見(jiàn)圖2）；待細(xì)胞成熟后再次檢測(cè)DC表面CD14表達(dá)情況，其陽(yáng)性表達(dá)為（3.74±1.35）%，而CD11c陽(yáng)性表達(dá)為（76.36±1.52）%（見(jiàn)圖3）。

3 DC表面CD11c檢測(cè)結(jié)果 四組試劑組間CD11c經(jīng)方差分析比較P值為0.006，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中B、C、D三個(gè)亞組DC成熟后其表面CD11c表達(dá)分別是（95.86±1.57）%、（93.80±3.37）%、（98.83±1.56）%均高于A組（86.70±4.05）%，A、B兩組均數(shù)t檢驗(yàn)P值為0.04，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但A、C兩組P值為0.13，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；B、C兩組均數(shù)t檢驗(yàn)P值為0.13，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；B與D兩組均數(shù)比較、C與D兩組均數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；A與D兩組均數(shù)比較，P值為0.02，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

4 DC表面CD86檢測(cè)結(jié)果 四組試劑組間CD86比較P值為0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中B、C、D三個(gè)亞組DC成熟后其表面CD86表達(dá)分別是（88.73±3.27）%、（87.17±3.07）%、（97.94±0.90）%均比A組（74.97±5.17）%高，A與B、A與C兩組均數(shù)t檢驗(yàn)P值為分別為0.02、0.04，差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B、C兩組均數(shù)t檢驗(yàn)P值為0.65，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；B、D兩組均數(shù)t檢驗(yàn)P值分別為0.003，C、D兩組均數(shù)t檢驗(yàn)P值為0.009，差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1、圖5。

討 論

癌癥免疫治療是近幾年尤為熱門的治療方式，腫瘤免疫治療的主要策略是探索腫瘤特異性抗體的治療潛力和細(xì)胞免疫效應(yīng)機(jī)制。針對(duì)白血病患者的免疫治療，旨在產(chǎn)生抗白血病T細(xì)胞反應(yīng)，可為消除AML中微小殘留（MRD）細(xì)胞提供一種新的治療方法。白血病細(xì)胞有幾種逃避免疫系統(tǒng)的途徑，包括MHCⅡ類表達(dá)缺失，低水平表達(dá)的共刺激分子以及細(xì)胞抑制因子。目前臨床上已開發(fā)出幾種用于癌癥免疫治療的方法，包括樹突狀細(xì)胞的治療性免疫接種。本課題組成員近年來(lái)在AML的免疫逃逸機(jī)制方面做了一定的研究，發(fā)現(xiàn)AML患者免疫功能受損可能與AML細(xì)胞分泌的可溶性因子直接抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的凋亡有關(guān)[9]。

表1 不同方法刺激誘導(dǎo)DC成熟后表面標(biāo)志物的表達(dá)（n=3）

樹突狀細(xì)胞有未成熟與成熟兩種狀態(tài)，未成熟DC起到抗原吞噬作用，而成熟DC起到抗原呈遞作用，在腫瘤免疫應(yīng)答中占有核心地位。DC的來(lái)源有骨髓血、臍血和外周血，本研究采用的DC前體細(xì)胞是Ficoll-Hypaque梯度離心法獲得PBMC，再經(jīng)MACS磁珠分選出CD14+外周單個(gè)核細(xì)胞，使用GM-CSF、IL-4 兩種細(xì)胞因子促進(jìn)CD14+PBMC向DC的分化，并培養(yǎng)未成熟的DC。未成熟DC可在TNF刺激下發(fā)展為高表達(dá) MHC-II類分子、CD83、CD86、CD80的成熟的DC[10]，CD14主要在單核細(xì)胞表面表達(dá)，但不在DC表面表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)磁珠分選的方法獲得的DC前體細(xì)胞CD14+PBMC純度很高，經(jīng)流式檢測(cè)其純度可達(dá)到95%以上，而后誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC數(shù)量多，相對(duì)于傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)法，此法可更快速制備DC，可以為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供大量DC。CD11c是DC表面上的特征蛋白，它在未成熟和成熟的DC表面上高度表達(dá)。CD11c是用于實(shí)驗(yàn)研究中確定所研究CD11c是否為DC的重要鑒定標(biāo)志，本研究中誘導(dǎo)的細(xì)胞中CD14陽(yáng)性表達(dá)降為（3.74±1.35）%，但CD11c的陽(yáng)性表達(dá)率可高達(dá)90%（圖2），提示誘導(dǎo)得到的細(xì)胞絕大多數(shù)為DC。本實(shí)驗(yàn)中，poly（I∶C）單藥誘導(dǎo)、CpG ODN單藥誘導(dǎo)、兩者聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC成熟后其表面CD11c表達(dá)均比空白組高，這進(jìn)一步說(shuō)明隨著DC由不成熟向成熟狀態(tài)發(fā)展，其CD11c的表達(dá)會(huì)進(jìn)一步升高。

佐劑和抗原共同遞送到DC是啟動(dòng)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵。Poly（I∶C）是TLR3激動(dòng)劑，TLR3主要由RNA病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的雙鏈RNA（dsRNA）所觸發(fā)，從而誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，以及樹突狀細(xì)胞的成熟[11]。CpG ODN屬于TLR9受體激動(dòng)劑，能夠刺激漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞成熟和分泌IFN-α，誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ并誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞。Zheng及其同事[12]發(fā)現(xiàn)CpG與poly（I∶C）的佐劑效應(yīng)是在他們的小鼠腫瘤模型中獲得顯著腫瘤消退所必需的。在一項(xiàng)Ⅰ期實(shí)驗(yàn)中[13]，29例患者接受CpG-28（TRL9激動(dòng)劑）治療，用于研究TRL9激動(dòng)劑的臨床安全性，原發(fā)性癌癥為惡性膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤或黑色素細(xì)胞瘤、室管膜瘤和結(jié)直腸癌，結(jié)果顯示了良好的臨床耐受性。

最初的一項(xiàng)研究[14]提示白血病轉(zhuǎn)化的靶點(diǎn)是白血病原始細(xì)胞—白血病干細(xì)胞，通過(guò)對(duì)股骨移植的NSG小鼠更大樣本量的仔細(xì)檢測(cè)，證實(shí)了原始研究的基本結(jié)論：幾乎在所有的樣本中，LSC都存在于CD34+CD38-這一細(xì)胞群中，盡管如此，仍有近一半的樣本中（＞100個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本），LSCs至少還在一個(gè)其他亞群中被發(fā)現(xiàn)（通常是CD34+CD38+細(xì)胞群）[15]。人們還發(fā)現(xiàn)了LSC其他的表面抗原表達(dá)特征，如CD123+[16]、CD47-[17]、CD33+、CD133、CD96+[18]、IREM-1+和CLL-1+[19]等，這表明LSC的抗原表達(dá)是不確定的、多樣的。故本實(shí)驗(yàn)選用CD34+白血病細(xì)胞作為靶細(xì)胞。

本研究應(yīng)用TLR3激動(dòng)劑聯(lián)合TLR9激動(dòng)劑刺激培養(yǎng)負(fù)載CD34+白血病細(xì)胞的DC成熟，CD11c、CD86的表型較刺激前表達(dá)顯著增高，同時(shí)四組之間均數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些結(jié)果表明，DC逐漸向成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)化，TLR3與TLR9激動(dòng)劑對(duì)DC的成熟有促進(jìn)作用；同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中結(jié)果顯示，TLR9激動(dòng)劑單藥誘導(dǎo)組較空白對(duì)照組與較TLR3與TLR9激動(dòng)劑聯(lián)合刺激組的DC表面CD11c陽(yáng)性表達(dá)相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TLR3激動(dòng)劑單藥誘導(dǎo)組TLR3與TLR9激動(dòng)劑聯(lián)合刺激組的DC表面CD11c陽(yáng)性表達(dá)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TLR3激動(dòng)劑單藥誘導(dǎo)組與TLR9激動(dòng)劑單藥誘導(dǎo)組的DC表面的CD11c、CD86陽(yáng)性表達(dá)相比差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與樣本數(shù)較少有關(guān)，但CD11c的表達(dá)是明顯增高的，空白對(duì)照組與TLR3與TLR9激動(dòng)劑聯(lián)合刺激組的DC表面CD11c陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，空白對(duì)照組與TLR3與TLR9激動(dòng)劑聯(lián)合刺激組的DC表面CD86陽(yáng)性表達(dá)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且TLR3激動(dòng)劑單藥誘導(dǎo)組較空白對(duì)照組與TLR3與TLR9激動(dòng)劑聯(lián)合刺激組的DC表面CD86陽(yáng)性表達(dá)相比差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聯(lián)合刺激組CD11c、CD86的表型較單藥刺激組表達(dá)顯著增高。

綜合以上結(jié)果，說(shuō)明poly（I∶C）與CpG ODN聯(lián)合應(yīng)用可以激活TLR信號(hào)通路，促進(jìn)DC的成熟，提示TLR3激動(dòng)劑與TLR9激動(dòng)劑在促DC成熟時(shí)可能具有協(xié)同作用；TLR3激動(dòng)劑及TLR9激動(dòng)劑作為DC佐劑，具有臨床應(yīng)用前景。本課題將進(jìn)一步研究其誘導(dǎo)CD8+CTL生成，增強(qiáng)CTL細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷功能。