葡萄糖酸鈣和氯化鈣制備的血小板凝膠上清對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作用的比較

劉素蕊 楊曉亞 高裕華 王更銀

近年來，富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）的應(yīng)用已不再局限于生理性止血、凝血及參與維持毛細(xì)血管的完整性等方面，它在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)及整形燒傷領(lǐng)域中所發(fā)揮的控制炎癥，促進(jìn)血管、組織愈合等作用也引起了廣泛關(guān)注[1]。其發(fā)揮作用的關(guān)鍵在于PRP中的高濃度血小板被激活后釋放活性顆粒，其中的生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)創(chuàng)傷部位的修復(fù)。20世紀(jì)70年代，PRP首次分離并應(yīng)用于臨床手術(shù)患者[2]。PRP可由全血手工離心或血細(xì)胞分離機(jī)制備，其血小板濃度通常是全血中生理濃度的4～8倍[3，4]。PRP中加入激活劑，促使血小板激活形成凝膠（PRP gel）并釋放胞內(nèi)的多種生物活性分子，釋放液稱為PRP releasate，能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移等行為[5-8]，在細(xì)胞組織工程領(lǐng)域意義重大。但目前，制備PRP releasate的實(shí)驗(yàn)流程并不統(tǒng)一，使得對(duì)研究結(jié)果的解釋缺乏比較意義。例如針對(duì)PRP的激活劑種類較多，包括凝血酶和/或葡萄糖酸鈣及氯化鈣等[9-11]。此外，激活所用的凝血酶多來源于?；蜇i，還需考慮其在人體內(nèi)的致敏性。有研究表明，在沒有外源性凝血酶存在的情況下，PRP中含有的內(nèi)源性凝血酶原在Ca存在的情況下，也可以活化形成凝血酶，最終形成PRP releasate[12]。所以，本實(shí)驗(yàn)在沒有應(yīng)用凝血酶的情況下以FBS培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照組，比較葡萄糖酸鈣注射液和CaCl2注射液兩種激活劑制備的PRP releasate對(duì)ucMSCs遷移和黏附等的影響，以期對(duì)PRP releasate和ucMSCs的聯(lián)合應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 材料 留取輸血傳染病檢測(cè)為陰性的健康新生兒臍帶，分離培養(yǎng)ucMSCs。

2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基，Hyclone；胰蛋白酶，索萊寶；特級(jí)胎牛血清，BI；Transwell板，Corning；Matrigel，BD；Anti- Cdc42、Rac1、RhoA、integrinβ1，Abcam。

3 PRP releasate制備 PRP（含血小板1 000×109/L）中加入10%葡萄糖酸鈣或5% CaCl2注射液（10∶1），室溫作用40～60 min以凝固，離心留取上清，分別命名為葡萄糖-PRP releasate和CaCl2-PRP releasate。以FBS培養(yǎng)組作為對(duì)照。

4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 饑餓24 h的ucMSCs加入Transwell板（8-μm pore size，6.5 mm diameter）的上層小室，細(xì)胞數(shù)目為2×104。10% PRP releasate或FBS加入下層孔室。18 h后，棉簽拭去上層膠，將遷移至底層的細(xì)胞固定，結(jié)晶紫染色，對(duì)三組細(xì)胞計(jì)數(shù)。

5 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 以1∶300的濃度將Matrigel膠包被96孔培養(yǎng)板。風(fēng)干12 h，PBS洗去多余的膠。將10%PRP releasate或FBS培養(yǎng)24 h的ucMSCs消化重懸后接種已包被的96孔板。分別在30 min、50 min兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用PBS將未貼壁的細(xì)胞洗去，甲醛固定15 min后吉姆薩染色，鏡下計(jì)數(shù)三組的貼壁細(xì)胞。

6 Western blotting 以PRP releasate或10% FBS培養(yǎng)ucMSCs 48 h，PBS洗滌3次。提取細(xì)胞蛋白，檢測(cè)Rho家族分子Cdc42、RhoA和Rac1的表達(dá)。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0軟件，數(shù)據(jù)由 ±s表示，3組比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞遷移能力 在下層小室加入兩種PRP releasate和FBS作為趨化劑后，與對(duì)照FBS組相比，PRP releasate可促進(jìn)細(xì)胞遷移（P＜0.05）。并且相較于CaCl2，葡萄糖-PRP releasate促遷移作用更顯著（P＜0.05）。見圖1。

2 細(xì)胞黏附 與對(duì)照組相比，兩種PRP releasate促黏附能力更強(qiáng)，但葡萄糖酸鈣和CaCl2兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

3 Western blot 葡萄糖-PRP releasate促進(jìn)Rho家族三個(gè)分子的表達(dá)（P＜0.05）；CaCl2-PRP releasate對(duì)Rac1和RhoA的影響次之（P＜0.05），但對(duì)Cdc42的表達(dá)影響與FBS組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

討 論

PRP經(jīng)激活后形成的PRP releasate可以釋放多種因子，廣泛應(yīng)用于骨科、燒傷整形等學(xué)科[13]。因制備方法不同，前期獲得的PRP中血小板數(shù)目及白細(xì)胞含量存在較大差別，并因此分為不同類型的成品[14-16]。結(jié)合我科兼具血站功能這一優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)采用了機(jī)采血小板作為PRP releasate的制備來源，取材方便、可操作性強(qiáng)，避免了制備質(zhì)量的波動(dòng)性；此外，為降低不同獻(xiàn)血員采集后PRP之間的差異，我們將9位同血型獻(xiàn)血者隨機(jī)分為3組，采集的PRP各留取2 mL混合用來制備PRP releasate。

為了更好地貼近PRP releasate臨床應(yīng)用，激活劑應(yīng)該最大限度減少可能對(duì)人體產(chǎn)生的不利影響，以商品化的10%葡萄糖酸鈣注射液和5%CaCl2注射液來制備PRP releasate較符合這一要求。就制備過程而言，10%葡萄糖酸鈣促使PRP凝膠的形成較CaCl2快，約需30～40 min，5% CaCl2則需50～60 min。但前者析出上清的時(shí)間快，最終收集的上清體積稍少，剩余的固體凝膠體積較大。經(jīng)過分子量和體積比的計(jì)算，相同體積的5% CaCl2中Ca含量還要稍高于10%葡萄糖酸鈣。這也更加說明了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的明顯差異。有研究表明[12]，葡萄糖酸鈣注射液比CaCl2注射液更加安全、便捷，我們的實(shí)驗(yàn)也得出相似的結(jié)論。究其原因，Ca2＋的適宜濃度及兩種激活劑的化學(xué)成分對(duì)細(xì)胞是否有影響值得考慮。

ucMSCs近年來受到廣泛的關(guān)注，是組織工程方面極具應(yīng)用前景的一種細(xì)胞。它除了具有MSCs的所有特性[17-19]，還具有自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：取材簡(jiǎn)易，與倫理道德的約束無沖突，更低的免疫原性、更快的克隆形成能力和更短的倍增時(shí)間[20，21]。因此，尋求ucMSCs與PRP releasate的最佳培養(yǎng)方式，替代傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)中的補(bǔ)充試劑FBS，使ucMSCs進(jìn)一步發(fā)揮細(xì)胞治療、組織修復(fù)的作用極具意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在對(duì)細(xì)胞遷移方面，葡萄糖酸鈣-PRP releasate的效果更明顯。然而，兩種來源的PRP releasate對(duì)ucMSCs黏附的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PRP releasate中復(fù)雜的因子成分及相關(guān)信號(hào)調(diào)控值得更進(jìn)一步的研究。

細(xì)胞遷移和黏附是細(xì)胞發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵步驟。Cdc42、Rac1和RhoA是Rho GTPases家族中研究最多、最深入的三個(gè)分子，分別調(diào)節(jié)細(xì)胞板狀偽足、絲狀偽足和張力絲等肌動(dòng)蛋白的聚合，與細(xì)胞遷移和黏附密不可分[22]。Western檢測(cè)結(jié)果揭示了葡萄糖酸鈣-PRP releasate明顯促進(jìn)Rho家族分子Cdc42、Rac1和RhoA的表達(dá) （P＜0.05），提示ucMSCs遷移和黏附的能力增強(qiáng)與Rho家族三個(gè)分子的調(diào)控可能存在密切關(guān)系。我們的前期研究結(jié)果也顯示，特定的細(xì)胞因子通過促進(jìn)Rho家族分子Cdc42的表達(dá)，從而增強(qiáng)ucMSCs的增殖、遷移和黏附[23]。

綜上，兩種激活劑提取的PRP releasate所含因子濃度的差異，以及不同培養(yǎng)濃度上清對(duì)細(xì)胞的影響還值得進(jìn)一步研究。兩種PRP releasate對(duì)Cdc42、Rac1和RhoA三個(gè)分子的不同作用與對(duì)遷移和黏附的差異間的關(guān)系，也是我們下一步的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容之一。依據(jù)已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果，相較CaCl2而言，葡萄糖酸鈣激活的PRP releasate能夠更好地促進(jìn)ucMSCs遷移，從而為PRP與ucMSCs的聯(lián)合移植應(yīng)用提供了體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)。