RhD多肽抑制抗原抗體結(jié)合的效果*

吳凡 莊乃保 梁爽 梁延連 蘇宇清

RhD陰性血型作為一種特殊的稀有血型，在我國所占比例相對較少。近年來臨床上RhD陰性血需求量呈逐年增加趨勢，患者也常因術(shù)前無法找到合適匹配的血液而延誤治療。血型改造制備“通用血”是輸血研究的一個重要課題。多肽藥物的最新研究成果及高效價抗體可遮蔽Rh抗原的現(xiàn)象提示[1-5]，利用模擬多肽作為遮蔽物，可能會阻擋抗-D與紅細胞表面RhD抗原結(jié)合位點，逃避免疫攻擊（immune attack）達到血液通用的目的。本研究分析噬菌體表面展示技術(shù)篩選得到的RhD陽性噬菌體多肽的免疫遮蔽效果[6]，探討利用具有生物活性的多肽遮蔽抗-D與RhD抗原的結(jié)合位點，使用生物信息學分析有效多肽理化性質(zhì)及二級結(jié)構(gòu)，以期提高臨床輸血的安全性?，F(xiàn)報告如下。

材料與方法

1 實驗試劑 IgG型單克隆抗-D，上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司，批號：20171023；牛血清白蛋白（BSA），美國Amresco公司，批號：1652C18；熒光抗體FITC-標記山羊抗人IgG Fc（ab）2，美國Bio-rad公司，批號：STAR97PE；低離子鹽溶液（LISS），美國Bio-rad公司，批號：05761.77.30；微柱凝膠低離子抗人球蛋白卡，美國Bio-rad公司，批號：50531.28.17；抗人球蛋白（抗IgG，C3d）檢測試劑盒，上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司，批號：20175002；其他試劑為國產(chǎn)分析純。多肽，根據(jù)抗-D噬菌體克隆篩選推導出的4條較為有效12肽氨基酸序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成多肽[6]。多肽純度為95%。

表1 RhD噬菌體多肽合成

2 實驗儀器 SI500搖動式培養(yǎng)箱，英國Stuart Scientific公司； Labofuge 400R臺式冷凍離心機，德國Heraeus公司；Centrifuge 5417R微型冷凍離心機，德國Eppendorf公司；FACSCantoTM流式細胞儀，美國BD公司。ID-Incubator 37 SI保溫箱，瑞士Diamed AG公司；ID-Centrifuge 12 SII臺式離心機，瑞士Diamed AG公司；FL Auto顯微鏡細胞成像儀，美國Life technologies公司。

3 方法

3.1 多肽理化性質(zhì)及二級結(jié)構(gòu)分析：根據(jù)分子量、純度和質(zhì)量用生理鹽水溶解多肽，每條多肽分別配制成1 mg/50 μL、0.5 mg/50 μL、0.25 mg/50 μL、0.125 mg/50 μL共4個濃度。

有效多肽的分子質(zhì)量（mass）、等電點（isoelectric point）、不穩(wěn)定指數(shù)（instability index）、總平均疏水指數(shù)（grand averge of hydropathicity）使用在線工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protpatam/）進行分析。無規(guī)則卷曲（random coil）、抗原性（antigenic）使用在線工具EMBOSS（http：//emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss）進行分析。螺旋結(jié)構(gòu)疏水面（hydrophobic face）、疏水力（hydrophobic moment）使用在線工具hbiQuest（http：//heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParamsV2.py）進行分析。

3.2 多肽驗證：20 mg/mL IgG型單克隆抗-D 50 μL/孔加于微孔板中（即每孔1 mg），分別與50 μL 3.1中溶解的不同濃度的多肽混合，37℃輕振孵育30 min。用LISS溶液制備5‰洗滌O型RhD陽性紅細胞。加入5‰洗滌O型RhD陽性紅細胞25μL/孔，陽性對照孔加入20 mg/mL IgG型單克隆抗-D 50 μL及5‰洗滌O型RhD陽性紅細胞25 μL，陰性對照孔加入20 mg/mL IgG型單克隆抗-D 50 μL及5‰洗滌O型RhD陰性紅細胞25 μL，37℃輕振孵育30 min。取50 μL反應物至微柱凝膠低離子抗人球蛋白卡中，1 000 g離心10 min。判定結(jié)果。

3.3 多肽遮蔽濃度檢測：200 μg/mL的IgG型單克隆抗-D 50μL，分別與1 mg/50 μL、2 mg/50 μL的Peptide 4 50μL混合于已用0.5% BSA封閉的微孔板中，37℃孵育30 min。陽性對照孔加200 μg/mL的IgG型單克隆抗-D 50 μL與生理鹽水50 μL混合，陰性對照孔加生理鹽水100 μL。加入1%洗滌O型RhD陽性紅細胞50μL/孔，37℃孵育1 h。生理鹽水洗滌3次。最后一次洗滌后扣干，加入抗人球蛋白（抗IgG，C3d）100 μL/孔，1 000 g離心15 s，取10 μL/孔涂片，顯微鏡觀察凝集情況。

3.4 多肽遮蔽效果檢測：200 μg/mL的IgG型單克隆抗-D 50 μL，與2.5 mg/50 μL的Peptide 4 50 μL混合于用0.5% BSA封閉的微孔板中，37℃孵育30分鐘。陽性對照孔加200 μg/mL的IgG型單克隆抗-D 50μL與生理鹽水50 μL混合，陰性對照孔加生理鹽水100 μL。加入1%洗滌O型RhD陽性紅細胞20 μL/孔，37℃孵育1 h。生理鹽水洗滌3次。加入10 μg/mL熒光抗體 FITC-標記山羊抗人IgG Fc （ab）2 100 μL/孔，37℃避光孵育30 min。生理鹽水洗滌3次。最后一次洗滌后扣干，加生理鹽水300μL/孔稀釋。流式細胞儀檢測平均熒光強度。

4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標準差（ ±s）”表示，P＜0.001表示有統(tǒng)計學差異。

結(jié) 果

1 多肽理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)及抗原性 生理鹽水溶解后，Peptide 1呈弱混濁狀，超聲波助溶后溶解。Peptide 3呈強膠凍狀。Peptide 2、Peptide 4溶于生理鹽水。Peptide 1、Peptide 2、Peptide 3、Peptide 4的等電點值為6.71～10.00；親水性由強至弱依次為Peptide 3＞Peptide 1＞Peptide 2＞Peptide 4；在不穩(wěn)定性方面，Peptide 4最為穩(wěn)定（32.42），而Peptide 3最不穩(wěn)定（48.63）；無規(guī)則卷曲與抗原性均未在Peptide 1、Peptide 2、Peptide 3、Peptide 4中形成。

2 多肽驗證 在微柱凝膠低離子抗人球蛋白卡中Peptide 3因呈強膠凍狀不能通過微柱凝膠，未表現(xiàn)出明顯陰陽反應。隨著噬菌體多肽濃度增加，Peptide 1、Peptide 2、Peptide 4對IgG型單克隆抗-D與O型RhD陽性紅細胞的凝集有一定劑量效應，其中Peptide 4劑量效應最為明顯（圖1）。

表2 有效多肽理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)及抗原性特征比較

3 多肽有效遮蔽濃度 當Peptide 4濃度為1 mg/50 μL時，其對IgG型單克隆抗-D和RhD陽性紅細胞的凝集反應有一定的抑制效果，但仍有少量凝集；當Peptide 4濃度為2 mg/50 μL時，其抑制IgG型單克隆抗-D和RhD陽性紅細胞凝集反應的效果較為明顯，接近陰性對照（圖2）。

4 多肽遮蔽效果 陰性對照與陽性對照的熒光強度分別為180.9±3.4、586.0±4.8（n＝8）。Peptide 4遮蔽后熒光強度為190.7±3.5（n＝3），與陽性對照相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與陰性對照相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.1373）（圖3）。

討 論

RhD抗原是除ABO血型抗原外最具免疫性的紅細胞抗原。近年來，通過將生物化學與化學、材料科學、臨床輸血醫(yī)學結(jié)合，使用化學材料修飾改造紅細胞血型抗原的研究結(jié)果[7，8]，為制備無血型抗原的通用型紅細胞，降低因血型不合所致的輸血反應，提高輸血的安全性，進行了富有創(chuàng)新性的探討。用于RhD抗原化學修飾的大分子化學材料主要是聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）及其衍生物，但其有效性和安全性有待深入研究。

多肽因其功能明確、特異性高、副作用小、生產(chǎn)成本低等特性已廣泛應用于生物醫(yī)藥和診斷試劑中[9-11]。其在高靈敏檢測分析、診斷、蛋白質(zhì)相互作用、抗感染新藥研發(fā)及難治性病毒感染性疾?。ㄈ鏏IDS、HBV、HSV、Rabies virus等）與癌癥治療等方面顯示出廣闊的應用前景。多肽抗原易于制備、特異性強，具有更高的靈敏度和準確性，易于臨床應用，可以彌補抗體在診斷領(lǐng)域中的不足，是理想的檢測及治療的材料。目前運用多肽抗原進行抗體檢測的試劑有甲肝、乙肝、丙肝、庚肝等肝病病毒以及艾滋病病毒等[12-16]。本研究根據(jù)噬菌體表面展示技術(shù)篩選得到的陽性噬菌體氨基酸序列合成4條RhD噬菌體多肽[6]，從特異性、理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、氨基酸序列等多方面進行深入研究。

多肽具有廣泛的溶解性，但多肽紅細胞凝集抑制實驗的難點在于多肽的溶解。合適的多肽溶解方法是多肽實驗成功的重要因素。不合適的溶解會造成多肽的損失和實驗的失敗，然而尋找理想的溶解方法有時具有相當?shù)奶魬?zhàn)性。多肽的溶解性很大程度上取決于多肽的極性，其溶解原理為：酸性的多肽溶解于堿性溶液，而堿性多肽可溶解于酸性溶液，含有大量不帶電荷的極性氨基酸殘基或疏水性氨基酸的疏水性多肽和中性多肽可先溶解于少量有機溶劑中，如二甲

基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、二甲基甲酰胺（N，N-Dimethylformamide，DMF）、醋酸、乙腈、甲醇、丙醇或異丙醇，然后加蒸餾水稀釋。含有甲硫氨酸或半胱氨酸的多肽不能用DMSO溶解，因為DMSO可能造成側(cè)鏈氧化。Peptide 1、Peptide2均為強堿性多肽（等電點值為10.00），Peptide 3、Peptide 4為酸性多肽（等電點值分別為6.71、6.74）。堿性多肽可先嘗試用蒸餾水溶解；如果不溶于水，接著嘗試用少量10%～25%醋酸溶解，如果仍然失敗的話，可添加少量不飽和脂肪酸（Tallow Fatty Acid，TFA）（10～50）μL增溶，如果多肽一點都不溶，可用DMSO并以超聲波助溶，最后用水稀釋至理想濃度。酸性多肽也可先嘗試用蒸餾水溶解；如果不溶于水，加入NH4OH（＜50 μL）助溶，并用去離子水稀釋至1 mL。然而，紅細胞膜滲透脆性大，凝集實驗時需要充分考慮用于溶解多肽的溶劑是否會破壞紅細胞，影響結(jié)果判讀，而上述蒸餾水以及有機溶劑均不適用于紅細胞相關(guān)實驗。本研究采用生理鹽水溶解多肽，但在陽性噬菌體狀態(tài)表現(xiàn)出明顯特異性的氨基酸序列[6]，在合成噬菌體多肽Peptide 3后卻不溶于生理鹽水，呈強膠凍狀，嚴重影響多肽的驗證試驗。分析多肽不溶的主要原因是形成二級結(jié)構(gòu)，而鹽更會促進二級結(jié)構(gòu)形成。

4條RhD噬菌體多肽總平均疏水指數(shù)均為負數(shù)，分別為-0.850、-0.683、-1.358、-0.050，表現(xiàn)出較強的親水性。在抗原、抗體結(jié)合的過程中，多肽完整而穩(wěn)定的空間立體構(gòu)象是決定能否穩(wěn)定結(jié)合的重要因素。Peptide 1、Peptide 4不穩(wěn)定指數(shù)值分別為38.87、32.42，為穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定指數(shù)＜40）?？乖灶A測分析結(jié)果顯示4條多肽均無抗原性，可避免經(jīng)此多肽輸入人體后產(chǎn)生針對該多肽的抗體，對本研究的目的而言是有利的（表2）。

微柱凝膠法檢測血型的原理是：經(jīng)過離心，未凝集的紅細胞可通過凝膠的分子篩，到達凝膠底部，判斷為陰性；而凝集的血塊體積增大不能順利通過凝膠的分子篩，根據(jù)凝塊的大小所達到凝膠柱的位置不一樣，從而可判斷陽性的強弱。Peptide 3因呈強膠凍狀而凝結(jié)于微柱凝膠低離子抗人球蛋白卡上層，紅細胞被不能充分溶解的噬菌體多肽阻擋，不能通過微柱凝膠低離子抗人球蛋白卡的凝膠，影響了結(jié)果的判斷。Peptide 1、Peptide 2隨著濃度增加，IgG型單克隆抗-D與紅細胞反應凝集程度減少，凝塊有所減小，但遮蔽效果并不太理想。Peptide 4表現(xiàn)出抑制IgG型單克隆抗-D與RhD陽性紅細胞發(fā)生凝集反應的劑量效應，但多肽濃度為1.0 mg/50 μL時仍未達到完全抑制（圖1）。

顯微鏡觀察可見，Peptide 4遮蔽濃度為1 mg/50 μL時，IgG型單克隆抗-D與RhD抗原的反應仍有少量凝集；當遮蔽濃度增加至2 mg/50 μL時，其抑制IgG型單克隆抗-D與RhD抗原的反應效果較為明顯（圖2）。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與陽性對照相比，2.5 mg/50 μL濃度的Peptide 4對IgG型單克隆抗-D與O型RhD陽性紅細胞的凝集具有抑制作用（圖3），達到了遮蔽效果。

本研究初步體現(xiàn)了RhD噬菌體多肽免疫遮蔽抗-D與RhD抗原反應的應用價值和潛在的應用前景，為今后RhD蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究及抗原性改造等做出一定的理論探索。然而，對于已產(chǎn)生大量抗-D抗體的個體，此多肽的遮蔽效果還有待提高，以減少個體輸入量。多肽作為藥物輸入人體后，也可能會產(chǎn)生復雜的變化從而影響其穩(wěn)定性和特異性，如何計算輸入量達到理想的遮蔽效果等許多問題需進一步深入研究。