原發(fā)免疫性血小板減少癥患者PBMC中CD200/CD200R1表達(dá)及臨床意義*

臧艷 葉辛 錢寶華

原發(fā)免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）是臨床上最常見的出血性疾病之一，其病理特點(diǎn)是患者產(chǎn)生針對(duì)自身血小板的抗體，導(dǎo)致血小板破壞增多及生成障礙。常見的臨床表現(xiàn)為皮膚瘀點(diǎn)瘀斑，嚴(yán)重者可出現(xiàn)難以控制的內(nèi)臟和頭顱出血，嚴(yán)重危害患者的生命健康[1]。與大部分自身免疫性疾病相似，自身免疫穩(wěn)態(tài)的失衡是導(dǎo)致疾病的關(guān)鍵因素，其中眾多的免疫細(xì)胞均參與該過程，如自反應(yīng)性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核細(xì)胞等[2]。目前多數(shù)研究認(rèn)為T細(xì)胞功能紊亂在ITP的發(fā)病中起到?jīng)Q定性作用[3]，具體來說就是Th17亞型細(xì)胞的過多激活[4]，導(dǎo)致患者自身免疫亢進(jìn)。

CD200是一種Ⅰ型膜糖蛋白，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞與組織中，通過與其結(jié)構(gòu)相似的受體CD200R1來傳遞影響多種生理系統(tǒng)的應(yīng)答信號(hào)。與CD200不同，其受體CD200R1的表達(dá)更局限于髓系和淋巴系的細(xì)胞中[5]。已經(jīng)有許多研究顯示，CD200參與了多種疾病的發(fā)病機(jī)制，包括腫瘤、過敏性疾病及自身免疫性疾病。研究表明，CD200/CD200R1信號(hào)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者滑膜及外周血中存在表達(dá)量及功能的異常，參與了RA疾病的免疫調(diào)節(jié)及病理轉(zhuǎn)歸[6]。在另一種常見的自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者中也發(fā)現(xiàn)了CD200和CD200R1的信號(hào)異常，并參與了SLE疾病的免疫紊亂[7]。然而人們對(duì)于該信號(hào)通路分子是否在ITP疾病患者中表達(dá)異常以及是否與ITP的自身免疫紊亂有關(guān)仍不清楚。

基于上述研究進(jìn)展，本研究擬探討ITP患者外周血PBMC中CD200及其受體CD200R1的表達(dá)情況，分析其與ITP患者Th1/17細(xì)胞亢進(jìn)的關(guān)系，為深入理解ITP的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為可能的免疫調(diào)節(jié)治療方法提供潛在靶點(diǎn)。

材料與方法

1 研究對(duì)象 本研究共納入2014年9月～2016年5月上海長(zhǎng)海醫(yī)院新診斷的ITP患者共19例，其中男性7例，女性12例，平均年齡51.2歲。所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)關(guān)于ITP診斷達(dá)成的專家共識(shí)[8]。

與此同時(shí)，同期納入了與ITP患者組年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的19名健康體檢者為健康對(duì)照組。該研究通過上海長(zhǎng)海醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署了書面知情同意書。

2 試劑與儀器 人淋巴細(xì)胞分離液（Sigma，P7794），TRIzol（Invitrogen，15596018），PrimeScript RT Master Kit（Takara，RR036A），TNF-α，IFN-γ及IL-17 ELISA試劑盒（R&D DTA00D，DIF50，D1700），Sysmex XT-2100L全自動(dòng)血液分析儀，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI 7500）。

3 方法

3.1 臨床標(biāo)本收集：用枸櫞酸鈉抗凝采血管收集ITP患者組和健康對(duì)照組外周血各10 mL。

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PBMC中CD200/CD200R1的表達(dá)量：首先采用Ficoll密度梯度離心法分離每個(gè)標(biāo)本的PBMC，利用TRIzol法提取樣本總RNA，按照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄制備cDNA備用。采用SYBR Green嵌入染料法進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct方法計(jì)算CD200及CD200R1在ITP組和健康對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量。

3.3 采用ELISA法檢測(cè)TNF-α，IFN-γ及IL-17的蛋白濃度：離心后取得血漿標(biāo)本，按照試劑盒說明書步驟檢測(cè)TNF-α，IFN-γ及IL-17在血漿中的蛋白濃度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表達(dá)，兩組間的均數(shù)比較采用成組t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)，利用Spearman秩相關(guān)法進(jìn)行相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)置為α=0.05，所有分析均為雙側(cè)檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ITP患者PBMC中CD200及CD200R1表達(dá)量下調(diào)如圖1所示，與健康對(duì)照組相比，ITP患者PBMC中CD200及CD200R1的mRNA表達(dá)量均下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=36，P＜0.05；t=38，P＜0.05）。

2 ITP患者血漿中TNF-α，IFN-γ及IL-17蛋白表達(dá)量上調(diào) 如圖2所示，與健康對(duì)照組相比，TNF-α，IFN-γ及IL-17蛋白表達(dá)量在ITP患者組中均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=33.11，P＜0.05；t=14.92，P＜0.05；t=37.16，P＜0.05）。

表1 CD200/CD200R1與ITP患者血小板計(jì)數(shù)的相關(guān)性分析

表2 CD200/CD200R1與TNF-α及IL-17表達(dá)量的相關(guān)性分析

3 ITP患者中CD200和CD200R1與血小板計(jì)數(shù)、TNF-α、IFN-γ及IL-17蛋白表達(dá)量的相關(guān)性分析如表1所示，CD200和CD200R1均與患者血小板計(jì)數(shù)間呈正相關(guān)。另如表2所示，ITP患者中CD200和CD200R1分別與TNF-α及IL-17的表達(dá)量間呈負(fù)相關(guān)。

4 監(jiān)測(cè)經(jīng)有效治療后ITP患者外周血PBMC中CD200/CD200R1的表達(dá)水平 共有11例患者經(jīng)地塞米松治療后，達(dá)到臨床完全緩解的標(biāo)準(zhǔn)。進(jìn)一步采集了這11例患者完全緩解后的外周血PBMC標(biāo)本。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，CD200/CD200R1的表達(dá)量較治療前均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.53，P＜0.000 1；t=7.225，P＜0.000 1）（圖3）。

討 論

目前，臨床上治療ITP的手段十分有限，大部分藥物治療只能做到緩解癥狀，難以根治[9]。其根本原因是疾病發(fā)病機(jī)制未完全闡明。雖然其病理表現(xiàn)僅為血小板減少導(dǎo)致患者出血風(fēng)險(xiǎn)增加，但其背后的機(jī)理十分復(fù)雜，涉及了復(fù)雜的免疫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，以及遺傳和環(huán)境的影響[10]。因此，深入研究ITP患者體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)失衡的具體機(jī)制具有重要的科學(xué)和臨床價(jià)值。

本研究首次發(fā)現(xiàn)CD200/CD200R1信號(hào)分子在ITP患者PBMC中表達(dá)異常，且與ITP患者的血小板計(jì)數(shù)的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前評(píng)價(jià)ITP患者臨床癥狀嚴(yán)重程度的指標(biāo)十分有限，血小板計(jì)數(shù)是一個(gè)較直觀的指標(biāo)?；颊哐“逵?jì)數(shù)越低時(shí)，直接反映血小板破壞過多及生成減少的狀態(tài)，而患者的凝血功能亦越低，出血癥狀及風(fēng)險(xiǎn)越重[11]。本研究中發(fā)現(xiàn)CD200/CD200R1與患者的血小板計(jì)數(shù)正相關(guān)，說明CD200/CD200R1信號(hào)分子與ITP的疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，未來可作為監(jiān)控ITP病情的潛在指標(biāo)。

已有研究表明，T細(xì)胞免疫失調(diào)是ITP發(fā)病的關(guān)鍵因素，患者通常呈現(xiàn)Th1/17型細(xì)胞因子表達(dá)亢進(jìn)，從而打破自身免疫耐受，產(chǎn)生自身抗體，導(dǎo)致疾病。CD200/CD200R1分子可以抑制免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，維持外周的免疫耐受。有研究表明CD200-/-的RA疾病模型小鼠的病理進(jìn)程顯著加速[12]。上調(diào)CD200的表達(dá)后RA疾病進(jìn)展被延緩或完全停止。這一作用是通過影響細(xì)胞因子的生成實(shí)現(xiàn)的，其可以減低促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平，如TNF-α、IL-1β、MMP-13及IFN-γ[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，CD200/CD200R1信號(hào)分子與TNF-α及IL-17的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，說明ITP患者中低表達(dá)的CD200/CD200R1可以使促炎性細(xì)胞因子TNF-α及IL-17的表達(dá)水平升高，加重患者的病理狀態(tài)。該結(jié)果與之前研究發(fā)現(xiàn)的ITP患者Th1/17亢進(jìn)是相符的。

綜上所述，CD200/CD200R1的表達(dá)及功能在ITP患者的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，其可能通過減少炎性因子分子的表達(dá)發(fā)揮抑制作用，調(diào)控患者的疾病進(jìn)程。本研究結(jié)果為未來評(píng)估ITP患者疾病狀態(tài)及靶向性免疫治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。