番茄MYB-related 2基因克隆及過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

郝娟 段學(xué)粉 郭仰東 張喜春

摘 要 為分析SlMYB-related 2基因的生物學(xué)功能及為其抗冷害作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，從俄羅斯栽培番茄Bolgogragsky（實(shí)驗(yàn)室種質(zhì)編號(hào)25）中克隆SlMYB-related 2基因編碼區(qū)序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，然后構(gòu)建基因過(guò)表達(dá)載體。結(jié)果表明，在俄羅斯栽培番茄Bolgogragsky的cDNA中克隆了SlMYB-related 2基因，全長(zhǎng)1 248 bp，編碼415個(gè)氨基酸，并構(gòu)建了基因過(guò)表達(dá)載體pBI-SlMYB-related 2。說(shuō)明SlMYB-related 2基因?qū)Ψ牙浜τ许憫?yīng)，進(jìn)一步推測(cè)其可能影響番茄御冷機(jī)制。

關(guān)鍵詞 番茄;MYB-related 2;過(guò)表達(dá)載體;冷害

中圖分類(lèi)號(hào)：S641.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.32.102

番茄（Solanum lycopersicum）為管狀花目茄科番茄屬的一年生或多年生草本植物，受到人們的普遍喜愛(ài)，是全世界栽培較為廣泛的果菜。番茄是喜溫作物，不耐低溫，因此由低溫脅迫造成的損失尤其嚴(yán)重。近年來(lái)，植物低溫冷害問(wèn)題越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是指含有MYB結(jié)構(gòu)域的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝以及相應(yīng)的生物脅迫與非生物脅迫。在番茄中，轉(zhuǎn)錄因子S1MYBL2抑制了CHI酶的活性，使其下調(diào)，導(dǎo)致果皮中類(lèi)黃酮含量下降，最終使番茄的顏色變?yōu)榉奂t色。在蘋(píng)果中，MdMYBl、MdMYBl0和MdMYBA通過(guò)調(diào)節(jié)花青素的合成控制果皮和果肉的紅色性狀[1]。葡萄中VvMYBA2和VvMYBAl與啟動(dòng)子相結(jié)合，抑制了花青素的合成，導(dǎo)致葡萄的顏色變?yōu)榫G色[2]。擬南芥中的Atmyb2在高鹽條件下，表達(dá)量上升，刺激了干旱基因rd22和AtADHI的表達(dá)，增強(qiáng)了擬南芥對(duì)干旱的耐受力。在低溫脅迫中，擬南芥AtMYB 15對(duì)植物的耐低溫能力起負(fù)調(diào)控作用，過(guò)表達(dá)AtMYB15后，降低擬南芥對(duì)低溫的耐受力[3]。研究表明，在冷應(yīng)激下，誘導(dǎo)MdMYB88和MdMYB124作用于CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1（MdCCA1）的上游和直接通過(guò)與其啟動(dòng)子的AACCG基序結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)其表達(dá)，從而提高蘋(píng)果細(xì)胞的耐寒性[3]。

本試驗(yàn)以番茄基因SlMYB-related 2為研究對(duì)象，克隆了基因的CDS區(qū)，并通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析該基因的保守結(jié)構(gòu)域及蛋白質(zhì)性質(zhì)，然后通過(guò)構(gòu)建該基因的過(guò)表達(dá)載體，進(jìn)一步探究SlMYB-related 2基因在番茄御冷機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為俄羅斯栽培番茄Bolgogragsky（實(shí)驗(yàn)室種質(zhì)編號(hào)25）。大腸桿菌菌株DH5α，PBI121載體來(lái)自于實(shí)驗(yàn)室保存，DNA marker、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)于天根生化科技有限公司;Trizol? Reagent （Ambion）購(gòu)于美國(guó)生命技術(shù)公司;TransScript?反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;PrimeSTAR Max Premix、Xba Ⅰ、Sma Ⅰ、T4 DNA連接酶及各種限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)于寶生物（Takara）工程（大連）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因生物信息學(xué)分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基因保守域預(yù)測(cè)，在PlantCARE網(wǎng)站進(jìn)行啟動(dòng)子分析，利用ExPasy Translate軟件推導(dǎo)出SlMYB-related 2全長(zhǎng)cDNA的氨基酸序列，使用ExPasy Protparam軟件分析其理化性質(zhì)。使用InterProScan、Consered Domains、Expasy Prosite軟件進(jìn)行SlMYB-related 2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及功能位點(diǎn)分析;使用PHDsec program軟件進(jìn)行SlMYB-related 2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，SWISS-MODEL軟件進(jìn)行SlMYB-related 2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。

1.2.2 基因克隆

利用Trizol法提取葉片RNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板擴(kuò)增SlMYB-related 2基因的全長(zhǎng)CDS，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：cDNA 1μL，正向引物2 μL，反向引物1 μL，PrimeSTAR Max Premix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。條件為94 ℃預(yù)變性5 min，

94 ℃變性30 s，54.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，34個(gè)循環(huán)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收相應(yīng)的目的片段。

1.2.3 植物過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

切膠回收所得DNA和pLB中間載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)卡那霉素篩選后挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以pLB-Simple Vector特異引物為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

挑取分別含有pLB-MYB-related 2和pBI121質(zhì)粒的陽(yáng)性單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，再分別提取質(zhì)粒。將pLB-MYB-related 2和pBI121質(zhì)粒分別進(jìn)行Xba Ⅰ和Sma Ⅰ雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)回收純化后過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含Kan的培養(yǎng)基平板上挑取陽(yáng)性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlMYB-related 2基因生物信息學(xué)分析

2.1.1 保守域分析

番茄MYB-related 2基因CDS序列長(zhǎng)1 248 bp，編碼415個(gè)氨基酸。在基因編碼的氨基酸序列第44～100位存在典型的MYB轉(zhuǎn)錄因子的保守域，myb_SHAQKYF;且在第142～187位存在Myb_CC_LHEQLE轉(zhuǎn)錄激活域，均表明SlMYB-related 2符合植物MYB轉(zhuǎn)錄因子的基本特征。在第137～292位存在MscS蛋白超家族，表明SlMYB-related 2可能與細(xì)胞膜的作用有關(guān)。

2.1.2 編碼蛋白親疏水性分析

利用軟件ExPasy protscale對(duì)SlMYB-related 2編碼蛋白進(jìn)行了親疏水性分析。結(jié)果顯示，SlMYB-related 2最大值為1.422，在第82個(gè)氨基酸殘基處;最小值為?2.667，在第301個(gè)氨基酸殘基處。

2.1.3 編碼蛋白結(jié)構(gòu)與功能域分析

利用PRABI Lyon Gerland軟件進(jìn)行SlMYB-related 2編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)SlMYB-related 2中α-螺旋占34.7%，延伸鏈占7.47%，無(wú)規(guī)卷曲占56.14%，β-折疊占1.69%。使用ExPasy Prosite進(jìn)行功能位點(diǎn)分析。結(jié)果顯示，SlMYB-related 2功能位點(diǎn)位于41～101位，氨基酸序列為T(mén)DAKPRLKWTPDLHERFIEAVTQLGGADkAtPKSVLKLMGIQGLTLYHLKSHLQKYRLSKN。

2.2 基因克隆

以番茄葉片cDNA為模板，對(duì)SlMYB-related 2基因進(jìn)行克隆，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的條帶（圖1），1%瓊脂糖凝膠電泳條帶與目的片段長(zhǎng)度基本一致。

2.3 植物過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

提取pBI121和pLB-SlMYB-related 2質(zhì)粒，分別用Sma I和Xba I進(jìn)行雙酶切，回收目的片段后用T4 DNA連接酶連接構(gòu)建pBI-SlMYB-related 2過(guò)表達(dá)載體。利用PCR進(jìn)行驗(yàn)證，如圖2所示，得到預(yù)期大小約為1 258 bp的基因片段，說(shuō)明該植物過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建正確。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，如圖3所示，目的基因無(wú)突變等錯(cuò)誤，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)論與討論

據(jù)世界糧農(nóng)組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)是世界上番茄產(chǎn)量最大的國(guó)家，但番茄的不耐低溫為番茄產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。低溫會(huì)影響番茄的生長(zhǎng)發(fā)育，從而進(jìn)一步影響其外觀品質(zhì)和口感。

本試驗(yàn)克隆得到番茄SlMYB-related 2，全長(zhǎng)1 248 bp，

編碼415個(gè)氨基酸。經(jīng)生物信息分析學(xué)可知，其含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子保守域，一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域且存在MscS蛋白超家族，由此可以推測(cè)其亞細(xì)胞定位結(jié)果，為蛋白質(zhì)互作位置提供依據(jù)方向，從而探究該基因在番茄御冷機(jī)制中如何發(fā)揮作用。pBI121質(zhì)粒是一種適用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體，是雙元T-DNA載體。本試驗(yàn)先將

SlMYB-related 2基因序列構(gòu)建到pLB中間載體上，再將其與pBI121同時(shí)進(jìn)行雙酶切、連接構(gòu)成植物超表達(dá)載體pBI-SlMYB-related 2，經(jīng)驗(yàn)證其準(zhǔn)確無(wú)誤可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。這一結(jié)果表明，本試驗(yàn)構(gòu)建的pBI-SlMYB-related 2過(guò)表達(dá)載體在進(jìn)行植物基因表達(dá)和功能研究中具有一定的使用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯：趙中正）