鏈脲佐菌素誘導小鼠糖尿病腎病模型的建立

王友娣 王李卓 高家林

【摘 要】目的：構建糖尿病腎病小鼠模型。方法：選取120只健康雄性小鼠，隨機分成對照組（n=50）和糖尿病腎病組（n=70），對照組采用正常飲食喂養(yǎng)，糖腎組予以高糖高脂飲食喂養(yǎng)加鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射。收集對照組和糖腎組小鼠血液、尿液和腎臟標本，測定血尿液生化指標，腎臟病理切片染色觀察形態(tài)學改變情況，最終確定糖腎小鼠造模成功。結果：糖腎組小鼠隨機血糖高達16.7mmol/l，尿蛋白呈陽性，血肌酐較對照組明顯增高。病理切片染色顯示糖腎組小鼠腎臟腎小球萎縮，腎小管基底膜增厚，腎臟纖維化水平明顯升高。結論：高糖高脂飲食聯合STZ腹腔注射是構建小鼠糖尿病腎病模型的有效方法。

【關鍵詞】糖尿病腎病;血糖;血肌酐

【中圖分類號】R692【文獻標識碼】A【文章編號】1005-0019（2020）01--01

全世界糖尿病發(fā)病率的增加伴隨著糖尿病并發(fā)癥的同時增加，包括視網膜病變、神經病變和腎病。在這些并發(fā)癥中糖尿病腎病可能是最常見且危害最大的，導致大量的死亡率[1]。盡管近幾十年來對糖尿病腎病的研究已經消耗巨大的公共衛(wèi)生資源，但其分子發(fā)病機制仍不清楚，近20多年來還沒有新的藥物用于治療糖尿病腎病[2]，此外，除了相對粗略的臨床指標尿蛋白和血肌酐水平外，尚無可靠的生物標記物可在臨床表現明顯的糖尿病腎病發(fā)生之前對高危患者進行鑒別[3]。而在這些領域取得進展的一個重要障礙是缺乏有效復制人類糖尿病腎病主要特征的動物模型[4]。這種模型可以用來確定發(fā)病機制，確定藥物靶點和試驗新的治療方法。小鼠由于其具有遺傳易操作性，被廣泛應用于臨床模型中，包括糖尿病腎病（DN）[5]。本研究采用高糖高脂飲食喂養(yǎng)加STZ腹腔注射[6]誘導糖尿病腎病小鼠模型，通過生化指標以及腎臟形態(tài)學檢測來判斷小鼠糖尿病腎病模型是否構建成功。

一、材料與方法

1.實驗材料：（1）實驗動物：健康雄性C57/BL6小鼠120只，8周齡，體重25-30g，購買于南京青龍山動物場，由皖南醫(yī)學院SPF級動物房專門飼養(yǎng)。（2）儀器：全自動生化分析儀（皖南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院）;血糖儀（美國強生公司）;代謝籠（皖南醫(yī)學院藥理實驗室）;冰凍切片機（美國Thermo公司）。（3）主要試劑：葡萄糖（西隴化工股份有限公司）;STZ（美國Sigma公司）;檸檬酸（上海生工生物工程股份有限公司）。

2.方法：選取120只健康雄性小鼠（8周齡，25-30g），隨機分成對照組（50只）和糖尿病腎病組（70只）。適應性喂養(yǎng)一周后，分別稱量對照組和糖腎組小鼠初始體重，提取小鼠腎臟、血液，進行病理切片和血生化指標檢測。隨后糖腎組小鼠給予高脂飲食喂養(yǎng)，對照組進行正常飼養(yǎng)。四周后稱量并記錄小鼠體重，留取24h尿液測量尿白蛋白、尿肌酐等生化指標。禁食12小時后隨機選取對照組、糖腎病組小鼠各3只，測量小鼠空腹血糖，之后采用眼眶取血法取血，用以測量生化指標。剩余糖腎組小鼠給予腹腔注射小劑量的STZ（35mg/kg，1mol/L的檸檬酸緩沖液中，濃度為1%，PH4.5），誘導部分胰島素缺陷，注射時間控制在30min內。對照組給予注射相同體積的檸檬酸緩沖液。之后糖腎組繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)，對照組正常飲食喂養(yǎng)。STZ注射后0-3周，每周稱量小鼠的體重、記錄體重變化?？崭範顟B(tài)下測量小鼠尾靜脈血糖并留取24h尿液。當小鼠空腹血糖≥11.1mmol/L時，可初步認為糖尿病小鼠模型成功，留24h尿液后殺鼠取血，測量生化指標。待血糖≥16.7mmol/L后，且尿蛋白陽性可認為糖尿病腎病小鼠模型構建成功。

3.本次實驗數據采用SPSS18.0軟件處理，計數資料采用[n（%）]表示，行檢驗，計量資料采用（）表示，行T檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

二、結果

1.兩組小鼠血生化指標比較：與對照組小鼠相比糖尿病腎病小鼠的空腹血糖、空腹HbA1c、腎臟指數均升高，血漿白蛋白下降，且具有統(tǒng)計學意義。

2.正常小鼠與糖尿病腎病小鼠腎臟形態(tài)學差異

接下來我們對糖尿病腎病小鼠腎臟進行形態(tài)學染色，分別采取了HE、PAS、MASSON、PASM染色，結果發(fā)現與正常小鼠相比較糖尿病腎病小鼠系膜細胞及基質彌漫性增生，腎小球萎縮硬化，腎臟纖維化程度明顯。腎小球系膜增生系膜區(qū)隱約可見嗜復紅蛋白沉積。腎小管上皮細胞顆粒變性或空泡變性。皮髓質交界區(qū)和腎盂黏膜見灶性淋巴細胞浸潤。

討論

目前，糖尿病腎病在全球發(fā)病率劇增，有研究預測至2035年全球的糖尿病患病人數將達到5.92億，且糖尿病腎病是發(fā)達國家中與糖尿病相關的最常見并發(fā)癥和死亡的主要原因。然而近幾十年來，臨床上尚無能針對性治療糖尿病腎病的藥物或其他治療方法[2，7]。因此，探索糖尿病腎病的發(fā)病機制并研究出有效的藥物治療糖尿病腎病迫在眉睫。這些都需要建立可靠的糖尿病腎病動物模型，為研究提供實驗基礎。

動物模型可用于揭示人類疾病的發(fā)病機制，因為它們提供了臨床研究中無法實現的精細實驗策略[8]。根據美國國立衛(wèi)生研究院資助的糖尿病并發(fā)癥聯合動物模型公布了一個糖尿病腎病嚙齒動物模型的三個關鍵標準：①肌酐清除率從初始開始下降50%以上;②白蛋白尿（增高50倍）;③特征性病理改變，包括系膜基質的擴張，任何程度的小動脈透明樣變，基底膜增厚和間質纖維化。在許多領域，包括糖尿病研究，小鼠可以說是人類疾病臨床前研究的首選實驗模型。選擇小鼠模型的優(yōu)點包括它們相對低成本，繁殖力強，妊娠時間短，最重要的是遺傳操作的易處理性[9]。

本研究采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)小鼠5周后低劑量STZ注射（35mg/kg，1mol/L的檸檬酸緩沖液中，濃度為1%，PH4.5）誘導小鼠部分胰島素缺陷，待小鼠空腹血糖≥11.1mmol/l時可初步認為糖尿病模型構建成功，以后繼續(xù)喂養(yǎng)高糖高脂飼料直至血糖超過16.7mmol/l，血生化檢測出現大量蛋白尿，腎組織形態(tài)學染色提示系膜細胞和基質彌漫增生，腎小管上皮細胞顆粒變性、空泡變性，皮髓質交界區(qū)和腎盂粘膜見灶性淋巴細胞單核細胞浸潤，均提示早中期糖尿病腎病模型形成，也表明高糖高脂飲食聯合STZ誘導是構建糖尿病腎病小鼠模型的有效方法。糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展是一個慢性過程，一旦進入終末期腎衰將無法逆轉，因此早中期糖尿病腎病的防治將尤為重要[10]。但國內外近幾年對早中期糖尿病腎病治療的研究仍未取得明顯療效，這其中一個重要原因便是缺乏能精確模擬人體糖尿病腎病重要特征的動物模型[11]。而本研究構建的早中期糖尿病腎病小鼠模型腎功能損傷較嚴重，且具有明顯的腎臟病理特征，為糖尿病腎病的研究提供了穩(wěn)定的實驗基礎。

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