代謝組學(xué)在重傷診治中的研究進(jìn)展

魏 斌，段紅杰，柴家科*

1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心 燒傷整形醫(yī)學(xué)部，北京 100048；2.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)北京總隊(duì)醫(yī)院 外一科，北京 100027

代謝組學(xué)定性和定量分析細(xì)胞特定時(shí)期的所有低分子量代謝產(chǎn)物(包括小分子底物、中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物),是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,廣泛應(yīng)用于疾病診斷、 醫(yī)藥研發(fā)及環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域。代謝組學(xué)可以表征疾病的代謝紊亂、發(fā)現(xiàn)新治療靶點(diǎn)、篩選診斷疾病或監(jiān)測(cè)治療活動(dòng)的生物標(biāo)志物,在臨床研究中主要用于臨床診斷、病因與病理機(jī)制研究、臨床用藥指導(dǎo)及臨床前動(dòng)物模型篩選,從而在多個(gè)層面實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。

早期代謝組學(xué)研究多采用核磁共振技術(shù)(nuclear magnetic resonance, NMR)[1]。NMR重復(fù)性好但靈敏度低于質(zhì)譜技術(shù)。NMR可檢測(cè)濃度為1～2 μmol/L,體積為0.5 mL的代謝物,但早期代謝物變化多發(fā)生在nmol/L甚至pmol/L水平,NMR無(wú)法分析。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS)比NMR優(yōu)點(diǎn)更多,如高靈敏度、高分辨率及檢測(cè)和量化代謝物的能力更廣泛。因此,LC-MS目前是代謝組學(xué)研究的首選分析技術(shù)[2]。

本文將就代謝組學(xué)近年來(lái)在嚴(yán)重創(chuàng)傷和燒傷中的應(yīng)用及研究進(jìn)展予以簡(jiǎn)述,以期為其臨床診治與尋找生物標(biāo)志物及藥物靶點(diǎn)提供線索,提高救治效率,并展望了燒沖復(fù)合傷代謝組學(xué)的問(wèn)題和挑戰(zhàn)。

1 創(chuàng)傷代謝組學(xué)研究進(jìn)展

全球每年有約580萬(wàn)人因重度創(chuàng)傷致死,約占總死亡率10%。絕大多數(shù)患者早期能存活,而后期常死于創(chuàng)傷并發(fā)癥,如多器官衰竭、急性呼吸窘迫綜合征、醫(yī)院感染及膿毒癥等。盡管創(chuàng)傷相關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物研究取得了一定進(jìn)展,當(dāng)前創(chuàng)傷類疾病的診斷和預(yù)后仍存在問(wèn)題,臨床缺乏可靠生物標(biāo)志物。而利用代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù),可為創(chuàng)傷性疾病提供新的診斷生物標(biāo)志物。目前應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)行創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)、嚴(yán)重外傷/休克以及燒傷的研究越來(lái)越多,彰顯出代謝組學(xué)在創(chuàng)傷研究中的巨大潛力。

1.1 創(chuàng)傷性腦損傷的代謝組學(xué)研究進(jìn)展

TBI破壞生理內(nèi)穩(wěn)態(tài),可導(dǎo)致代謝組學(xué)表現(xiàn)出“代謝危機(jī)”,出現(xiàn)復(fù)雜的代謝紊亂。危重患者可能有近2 500個(gè)代謝物受影響。分析尿液、腦脊液、血液等體液的代謝組,可了解TBI患者損傷的病理生理學(xué)機(jī)制。應(yīng)用1H-NMR定量波譜代謝組學(xué)分析輕重度TBI患者的尿液樣本,發(fā)現(xiàn)L-甲硫氨酸和胸腺嘧啶等代謝物與損傷嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān),而嘌呤代謝是TBI影響的主要通路[3]。以尿液代謝物作為生物標(biāo)志物,有助于客觀、快速地識(shí)別TBI的嚴(yán)重程度和預(yù)后判斷。此外,顱內(nèi)監(jiān)測(cè)和腦室外引流通常是臨床護(hù)理的必要條件,腦脊液也可作為TBI患者代謝組數(shù)據(jù)的來(lái)源[4]。Thomas等對(duì)716例TBI和非TBI對(duì)照患者血清進(jìn)行了全面的代謝組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)膽堿磷脂(溶血磷脂酰膽堿、醚磷脂酰膽堿和鞘磷脂)與TBI嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān),是TBI患者預(yù)后關(guān)鍵的潛在生物標(biāo)志物[5]。

嚴(yán)重TBI如低血壓、缺氧和顱內(nèi)壓升高等疾病,臨床治療重點(diǎn)是糾正生理紊亂[6]。TBI生化指標(biāo)乳酸/丙酮酸比值(lactate/pyruvate ratio, LPR)升高,反映了能量代謝受損。LPR升高與TBI術(shù)后不良結(jié)局及死亡率相關(guān)。外源13C標(biāo)記的琥珀酸經(jīng)三羧酸循環(huán)在細(xì)胞內(nèi)代謝,利用NMR技術(shù)測(cè)量13C標(biāo)記的代謝物,發(fā)現(xiàn)局部琥珀酸鹽給藥改善了能量代謝,降低了LPR比值,證明琥珀酸鹽是TBI潛在的治療藥物[7]。

因此,代謝組學(xué)有望補(bǔ)充其他“組學(xué)”分析,解決TBI引起的復(fù)雜病理生物學(xué)問(wèn)題。如果未來(lái)有更大規(guī)模的臨床研究,將代謝組學(xué)測(cè)定的血漿生物標(biāo)志物用于TBI篩查和損傷后監(jiān)測(cè),可進(jìn)一步鑒定臨床預(yù)后相關(guān)代謝標(biāo)志物的價(jià)值。

1.2 嚴(yán)重外傷/休克的代謝組學(xué)研究進(jìn)展

創(chuàng)傷是戰(zhàn)斗中最常見(jiàn)的傷害,嚴(yán)重創(chuàng)傷的士兵可能會(huì)死于外傷性失血性休克(trauma hemorrhagic shock, THS)引起的并發(fā)癥。失血過(guò)多導(dǎo)致器官氧氣不足引發(fā)THS,進(jìn)而引發(fā)大規(guī)模的代謝紊亂和強(qiáng)烈的炎性反應(yīng),導(dǎo)致器官衰竭甚至死亡。利用豬創(chuàng)傷THS模型通過(guò)NMR和LC-MS聯(lián)合互補(bǔ)的代謝組學(xué)方法,發(fā)現(xiàn)與急性期反應(yīng)、炎性反應(yīng)、能量消耗、氧化應(yīng)激和腎功能障礙相關(guān)的幾種代謝物(如脂類、嘌呤、葡萄糖醛酸代謝物等),在休克30 min后發(fā)生了顯著變化,導(dǎo)致嚴(yán)重的代謝紊亂[8]。應(yīng)用基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)技術(shù),檢測(cè)嚴(yán)重外傷和失血性休克(hemorrhagic shock, HS)引發(fā)的血漿代謝異常,發(fā)現(xiàn)其代謝紊亂對(duì)臨床結(jié)局具有潛在影響,血漿乳酸和琥珀酸的水平是重傷患者死亡率的預(yù)測(cè)指標(biāo)[9-10]。

乳酸水平升高與創(chuàng)傷死亡率增加有關(guān),然而通過(guò)強(qiáng)陰離子間隙定量的未測(cè)定酸性代謝物可能具有更大的預(yù)測(cè)價(jià)值。進(jìn)行性失血性休克導(dǎo)致組織供氧不足,使細(xì)胞代謝從有氧代謝轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧代謝,并產(chǎn)生乳酸血癥[11]。缺氧導(dǎo)致電子傳遞鏈解偶聯(lián),出血性低氧血癥會(huì)促進(jìn)檸檬酸代謝物(如琥珀酸鹽)循環(huán)水平增加?；诙抠|(zhì)譜的代謝組學(xué)分析重傷患者血漿樣本,發(fā)現(xiàn)休克后代謝紊亂琥珀酸水平可能是比乳酸更敏感的生物標(biāo)志物,更能預(yù)測(cè)重傷患者的死亡率[12]。丙二酸二甲酯可減緩HS豬模型琥珀酸鹽和乳酸的積聚,有助于保持復(fù)蘇期間心臟充盈壓力和功能,從而在豬復(fù)蘇后更好地恢復(fù)其生理功能[13]。因此,丙二酸二甲酯具有治療HS的潛力。

對(duì)有感染性休克的重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit, ICU)患者和無(wú)感染性休克的ICU患者對(duì)照的血清樣本,進(jìn)行靶向代謝組與炎性因子譜分析,發(fā)現(xiàn)在感染性休克ICU患者中,8種代謝物濃度升高:其中異丁酸鹽、肌醇、脯氨酸和尿素濃度增加,提示肝衰竭和腎損傷;3-羥基丁酸、O-乙酰肉堿、2-羥基丁酸增加,與炎性反應(yīng)增加引起的能量需求,以及疾病狀況相關(guān)的代謝需求相關(guān);苯丙氨酸升高是蛋白質(zhì)分解加快的結(jié)果,通常由感染和炎性狀態(tài)引起[14]。這些代謝物可用于ICU感染性休克的診斷和預(yù)后,且優(yōu)于傳統(tǒng)使用的ICU臨床評(píng)分系統(tǒng),預(yù)測(cè)能力出色。

1.3 燒傷的代謝組學(xué)研究進(jìn)展

燒傷仍然是世界范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。代謝紊亂是燒傷的主要并發(fā)癥,對(duì)嚴(yán)重?zé)齻颊叩呐R床結(jié)局產(chǎn)生負(fù)面影響。這些代謝異常包括肌肉萎縮、代謝亢進(jìn)、高血糖、高乳酸血癥、胰島素抵抗和線粒體功能障礙[15]。嚴(yán)重?zé)齻麜?huì)引起全身代謝和炎性紊亂,最終導(dǎo)致能量消耗,脂肪和葡萄糖分解代謝增加[16]。當(dāng)前,代謝組學(xué)研究是全面系統(tǒng)了解燒傷后患者的代謝變化規(guī)律和尋找臨床診斷重要代謝標(biāo)志物的有效手段。

研究報(bào)道應(yīng)用代謝組學(xué)鑒定燒傷患者血漿、血清中升高的細(xì)胞因子、細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白以及脂肪酸代謝物,可能具有預(yù)后價(jià)值[17]。40%全身表面積燒傷外加松樹(shù)皮煙霧吸入的豬重度燒傷模型,應(yīng)用NMR技術(shù)分析其動(dòng)脈血血清。在所檢測(cè)的38種水溶性代謝物中,80%以上其濃度隨時(shí)間顯著變化。由于脂肪酸分解代謝與氧化應(yīng)激等代謝途徑隨時(shí)間推移而增加,最終導(dǎo)致四種有機(jī)羧酸鹽(2-羥丁酸、3-羥丁酸、乙酰乙酸和異戊酸)的累積[17]。研究雖然沒(méi)有觀察到與死亡率相關(guān)的差異代謝變化,但是這四種有機(jī)羧酸鹽可作為燒傷復(fù)蘇或恢復(fù)的生物標(biāo)志物。

此外,基于1H-NMR代謝組學(xué)分析, ATP通過(guò)誘導(dǎo)小鼠低溫狀態(tài),可逆轉(zhuǎn)燒傷皮膚代謝譜的變化,改善燒傷深度的進(jìn)展,并減少膠原蛋白的降解,同時(shí)減輕了燒傷誘導(dǎo)的過(guò)度炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激,從而緩解了損傷和炎癥性疼痛[18]。因此ATP誘導(dǎo)的低溫可以減輕燒傷,并為熱燒傷后的急救治療提供新的思路。通過(guò)毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜(capillary electrophoresis-mass spectrometry,CE-MS)代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),小鼠受燒傷影響最大的代謝通路是嘌呤、谷胱甘肽、β-丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等代謝通路,燒傷可能導(dǎo)致小鼠骨骼肌谷氨酰胺分解和還原羧化增加。法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑既能逆轉(zhuǎn)燒傷引起的胰島素抵抗和線粒體功能障礙,也可逆轉(zhuǎn)氧化/還原煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+/NADH)比率以及氧化應(yīng)激和ATP耗竭[15]。因此,代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析表明,燒傷可誘導(dǎo)代謝組成分和代謝途徑的全局變化,多種代謝途徑中某些關(guān)鍵代謝物的豐度劇烈改變。

膿毒癥也是嚴(yán)重?zé)齻颊咚劳龅闹匾?綠膿桿菌是導(dǎo)致膿毒癥的主要因素,而降鈣素原(procalcitonin,PCT)是膿毒癥早期診斷的生物標(biāo)志物[19]。利用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(GC-TOF-MS)分析熱損傷和感染綠膿桿菌小鼠血清的代謝組學(xué),發(fā)現(xiàn)五種代謝物(反式-4-羥基脯氨酸、5-氧化脯氨酸、甘油-3-半乳糖苷、吲哚-3-乙酸酯和吲哚-3-丙酸酯)的組合,可作為燒傷患者早期診斷綠膿桿菌引起膿毒癥的生物標(biāo)志物[20]。因此,PCT 和以上五種代謝物組合,可作為嚴(yán)重?zé)齻颊吒腥灸摱景Y及預(yù)后的特定生物標(biāo)志物,為早期臨床診斷提供新的研究工具和思路。

2 嚴(yán)重復(fù)合傷的代謝組學(xué)研究進(jìn)展

復(fù)合傷是兩種或兩種以上不同致傷因素同時(shí)或相繼作用導(dǎo)致的機(jī)體損傷,主要分為燒沖復(fù)合傷、放射復(fù)合傷以及化學(xué)復(fù)合傷等。致傷因素包括熱能(火燒傷、沸水)、放射線、機(jī)械力(爆炸沖擊波、高強(qiáng)度擠壓)、激光及化學(xué)物中毒等。復(fù)合傷的病情嚴(yán)重且復(fù)雜、疾病進(jìn)展快。與其他單一損傷相比,復(fù)合傷大大增加了并發(fā)癥和死亡風(fēng)險(xiǎn)。目前復(fù)合傷大部分研究集中在其病理機(jī)制和臨床治療等方面,而代謝組學(xué)在復(fù)合傷病人和動(dòng)物模型中的相關(guān)研究較少。

燒沖復(fù)合傷是和平、戰(zhàn)時(shí)及恐怖襲擊事件中常見(jiàn)致命性損傷之一,由熱力及沖擊波兩種致傷因素共同導(dǎo)致。現(xiàn)代戰(zhàn)爭(zhēng)大批量高爆炸性武器的使用及恐怖爆炸事件等,勢(shì)必導(dǎo)致大量嚴(yán)重的燒沖復(fù)合傷。燒沖復(fù)合傷除皮膚燒傷外,肺臟是主要受累器官,具有致傷因素多、容易發(fā)生漏診或誤診、傷情重、處理矛盾多、死亡率高等特點(diǎn),救治困難。研究報(bào)道瓦斯爆炸導(dǎo)致大鼠多臟器系統(tǒng)損傷,應(yīng)用LC-MS代謝組學(xué)方法分析瓦斯爆炸致大鼠復(fù)合傷的血清代謝組,發(fā)現(xiàn)組間代謝譜差異明顯,并鑒定出烏頭酸、檸檬酸、煙酰胺、丙酮酸等18個(gè)差異代謝物,其機(jī)制可能與丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、煙酸和煙酰胺代謝等12條代謝通路有關(guān)[21]。通過(guò)基于 LC-MS 的大鼠血清代謝組學(xué)分析急性爆炸性肺損傷(acute blast lung injury explosive,ABLI),發(fā)現(xiàn)9種代謝物顯著變化,2-氨基己二酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、膽酸和L-組氨酸在暴露組中顯著增加,檸檬酸和烏頭酸在暴露后顯著降低,確定了肺循環(huán)生物標(biāo)志物的變化,為爆炸引起的 ABLI 提供了新的潛在治療機(jī)制[22]。肺損傷的致病機(jī)制及臨床治療干預(yù)措施的研究是治療燒沖復(fù)合傷的關(guān)鍵,研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶抑制劑烏司他丁對(duì)重度燒沖復(fù)合傷造成的大鼠急性肺損傷有治療作用,對(duì)燒沖復(fù)合傷造成的凝血、纖溶功能紊亂有很好的調(diào)節(jié)作用,同時(shí)能減輕大鼠燒沖復(fù)合傷早期肺組織水腫和病理?yè)p害,其機(jī)制可能與烏司他丁能增加肺組織保護(hù)性蛋白的表達(dá)、提高大鼠對(duì)損傷的耐受力有關(guān)[23]。

燒沖復(fù)合傷的早期研究重點(diǎn)是其病理生理變化。如應(yīng)用大鼠燒沖復(fù)合傷模型研究心肌損傷相變化,利用分子生物學(xué)和細(xì)胞組化等方法檢測(cè)心肌損傷以及鈣蛋白酶的變化[24],發(fā)現(xiàn)燒沖復(fù)合傷后大鼠出現(xiàn)心肌損傷,鈣蛋白酶表達(dá)升高、活性增強(qiáng)。但是燒沖復(fù)合傷的損害程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單純沖擊傷或燒傷,會(huì)引發(fā)相較于單純沖擊傷或燒傷更為復(fù)雜多變的生化應(yīng)答,導(dǎo)致代謝組劇烈改變。重傷代謝組學(xué)的諸多研究成果表明,應(yīng)用即時(shí)的代謝組學(xué)分析,可以密切監(jiān)測(cè)患者傷后不同階段的生化狀態(tài)變化,篩選用于臨床決策的生化標(biāo)志物,并可能快速找出救治的新靶點(diǎn)。鑒于代謝組學(xué)技術(shù)可以全面、快速的反映機(jī)體代謝變化規(guī)律,故在病情復(fù)雜且進(jìn)展迅速的嚴(yán)重復(fù)合傷領(lǐng)域具有非常廣闊的研究前景。

3 問(wèn)題與展望

重傷患者的病情復(fù)雜,代謝狀態(tài)高度紊亂,單一代謝物或生化分子標(biāo)志物無(wú)法實(shí)時(shí)反映出病情的復(fù)雜變化,而應(yīng)用代謝組學(xué)分析技術(shù)可全面、快速實(shí)時(shí)反映機(jī)體的代謝變化,有助于改善臨床診治策略。如何找到危重病和創(chuàng)傷的早期發(fā)展趨勢(shì),以及對(duì)診斷、預(yù)后和治療可靠的臨床分子標(biāo)志物;根據(jù)以往研究的代謝物和信號(hào)途徑,如何利用復(fù)雜的代謝組學(xué)信息,從指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)的數(shù)據(jù)中提取有價(jià)值的信息是非常棘手的挑戰(zhàn)。未來(lái)需要研究有效算法來(lái)降低數(shù)據(jù)維度,同時(shí)剖析疾病復(fù)雜生物過(guò)程背后的奧秘。而隨著可用數(shù)據(jù)變得越來(lái)越多,如何集成和綜合這些數(shù)據(jù)必然成為挑戰(zhàn)。運(yùn)用超級(jí)計(jì)算機(jī)的強(qiáng)大算力和人工智能、大數(shù)據(jù)技術(shù),可以更好的利用代謝組學(xué)等不同組學(xué)技術(shù)監(jiān)測(cè)危重患者傷后不同階段的生化狀態(tài),分析代謝物與機(jī)體生理/病理變化關(guān)系,從中梳理分析出有意義的臨床相關(guān)數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)重癥臨床診治的新靶點(diǎn)和分子標(biāo)志物。

近幾年,人工智能領(lǐng)域已經(jīng)從理論研究轉(zhuǎn)向現(xiàn)實(shí)應(yīng)用。臨床醫(yī)學(xué)的人工智能輔助工具可以改善管理決策,多組學(xué)技術(shù)和人工智能算法的同步發(fā)展,推動(dòng)了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。人工智能可以利用各種來(lái)源的信息內(nèi)容,為我們對(duì)疾病的理解開(kāi)辟新的視野,并為準(zhǔn)確診斷和制定更精確的治療策略提供機(jī)會(huì)。有研究[25]表明,機(jī)器學(xué)習(xí)算法可以通過(guò)分析組學(xué)數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療。盡管存在許多挑戰(zhàn),但仍有大量研究在解決這些問(wèn)題,并促進(jìn)基于人工智能的多組學(xué)分析的臨床轉(zhuǎn)化。預(yù)計(jì)以人工智能為基礎(chǔ)的多組學(xué)技術(shù)將推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)模式的轉(zhuǎn)變。到目前為止,對(duì)于給定的特定數(shù)據(jù)集,選擇要使用的最優(yōu)算法并沒(méi)有黃金標(biāo)準(zhǔn)。事實(shí)上,數(shù)據(jù)集結(jié)構(gòu)微小的變化可能導(dǎo)致所選算法和函數(shù)顯著的不同結(jié)果,為了更好地了解算法如何與數(shù)據(jù)集的特征相互作用,應(yīng)進(jìn)一步的深入研究。隨著臨床實(shí)踐中越來(lái)越多地產(chǎn)生新的多組學(xué)數(shù)據(jù),人工智能技術(shù)將提供更有意義的信息來(lái)指導(dǎo)臨床決策,最終推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。