CD40-腫瘤壞死因子受體相關因子抑制劑在動脈粥樣硬化治療中的研究進展

動脈粥樣硬化是心血管疾病的重要病理基礎，病變后期因斑塊破裂或出血致血栓形成，導致心肌梗死、卒中等心腦血管急性缺血事件。以他汀類為代表的調脂藥物，作為心血管疾病的二級預防，在臨床上廣泛應用。近期的大型臨床試驗證實瑞舒伐他汀不僅可降低血脂正?；颊叩牡兔芏戎鞍啄懝檀妓剑颐黠@減少患者發(fā)生心腦血管并發(fā)癥的風險[1]。然而，在臨床中尚未實現(xiàn)將低密度脂蛋白膽固醇降低至足以消除動脈粥樣硬化的目標[2]。臨床迫切需要調脂藥物之外的抗動脈粥樣硬化藥物。

動脈粥樣硬化被認為是慢性炎性疾病[3]，對炎性反應通路的調控是強有力的治療策略[4]。最新的CANOTSⅢ期試驗是抗炎藥物初次用于臨床的探索，結果表明抗白細胞介素(IL)-1β抗體卡那奴單抗(canakinumab)降低了既往有心肌梗死患者的主要復合終點(非致死性心肌梗死、非致死性卒中或心血管死亡)的發(fā)生率[5]。但該藥物僅在發(fā)生心肌梗死后的患者中進行了試驗，對動脈粥樣硬化的早期形成是否有干預作用仍不清楚。

CD40-CD40L是近年的研究熱點，該通路的抑制劑從單克隆抗體到小分子靶向藥物，主要作用于動脈粥樣硬化早期階段，即對斑塊形成起抑制作用，是動脈粥樣硬化早期預防和治療的潛在藥物。

1 CD40/CD40L抑制劑

CD40是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族成員，除B細胞外，CD40也在T細胞、樹突狀細胞、單核細胞、血小板、巨噬細胞、平滑肌細胞、內皮細胞上誘導表達。目前發(fā)現(xiàn)4種CD40L受體：整合素蛋白αMβ2 (Mac-1)、αⅡbβ3、α5β1，以及經典受體CD40。

研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化疾病的動物模型，高脂飲食的載脂蛋白E(ApoE)小鼠在經抗CD40L單克隆抗體治療后，動脈粥樣硬化斑塊的數量及嚴重程度均較對照組減輕，且動脈粥樣硬化斑塊中促炎M1型巨噬細胞的數量減少，與斑塊形成相關的炎性介質如血管細胞黏附分子1(VCAM-1)、細胞間黏附分子1(ICAM-1)的表達均減少，表明CD40/CD40L通路在斑塊形成的炎性免疫應答中起重要的作用，抗CD40L單克隆抗體治療通過消退現(xiàn)有斑塊及增加斑塊的穩(wěn)定性，改善動脈粥樣硬化[6]。基礎研究深入到基因水平，Lutgens等[7]的研究表明，CD40L基因敲除的ApoE-小鼠動脈粥樣硬化病變體積更小，表現(xiàn)為更加穩(wěn)定的斑塊表型，其特征是脂質積累少，病變處炎性細胞浸潤較少。進一步使用特殊的干擾小RNA(siRNA)對ApoE-小鼠的CD40進行沉默，可顯著降低小鼠動脈粥樣硬化病變的嚴重程度[8]。動物實驗結果表明CD40/CD40L抑制劑在抗動脈粥樣硬化中的有效作用，但由于該信號通路與免疫系統(tǒng)激活密切相關，導致早期的臨床試驗并未用于動脈粥樣硬化性疾病的治療。

CD40/CD40L抑制劑在免疫系統(tǒng)疾病和腫瘤中進行了臨床試驗，應用抗CD40抗體治療狼瘡性腎小球腎炎，患者血尿明顯減輕，但由于抗CD40抗體治療引發(fā)血小板聚集物的不穩(wěn)定而導致血栓栓塞和心肌梗死等急性栓塞事件，該試驗被迫提前終止[9]。在白血病、淋巴瘤等血液腫瘤治療中使用CD40抑制劑，其抗腫瘤效果未能達到預期目標，不良反應較多，包括免疫抑制和血栓風險，臨床試驗也被迫提前終止[10-11]。由于該通路的下游通路有多條，且與血小板、巨噬細胞、內皮細胞、免疫細胞等多種細胞相互作用，應針對特異性的下游通路和細胞研發(fā)抑制劑。

2 CD40與巨噬細胞

巨噬細胞是斑塊內最豐富的免疫細胞。共刺激分子是炎性反應途徑重要的調節(jié)因子，CD40/CD40L信號通路在動脈粥樣硬化起始、發(fā)展中有重要作用[12]。因不同的活化信號驅動巨噬細胞表型轉化，巨噬細胞分為促炎M1型巨噬細胞和抗炎M2型巨噬細胞[13]。CD40主要表達在M1型巨噬細胞上，CD40與CD40L結合產生促炎性因子和趨化因子，如TNF、IL-1、IL- 6、IL-8、IL-12、趨化因子配體2(CCL2)等，造成與動脈粥樣硬化斑塊形成相關的局部炎性環(huán)境[14]。

2.1 CD40-TNF受體相關因子(TRAF)通路

研究發(fā)現(xiàn)，CD40信號通過與TRAF結合發(fā)揮作用，在動脈粥樣硬化形成中起重要作用[15]。TRAF共有7類，即TRAF1、2、3、4、5、6、7，CD40可結合其中5類，包括TRAF1、2、3、5、6。Missiou等[16]的研究表明，TRAF1缺乏小鼠通過限制單核細胞與血管壁的黏附抑制動脈粥樣硬化，表明TRAF1通路在動脈粥樣硬化的起始階段起到促進作用。與TRAF1通路的作用完全不同的是TRAF2、3、5通路，CD40與其相互作用在趨化其他種類的免疫細胞，如B細胞、樹突狀細胞中具有重要的作用，主要與CD40介導的免疫功能密切相關。TRAF5缺乏的小鼠通過促進巨噬細胞攝取低密度脂蛋白和炎性細胞釋放的介質，促進泡沫細胞的形成，加速動脈粥樣硬化的進展[17]。TRAF5通路是所有通路中唯一抗動脈粥樣硬化的保護路徑。CD40的C端尾部有1個近端結合位點TRAF6，已證明TRAF6是與動脈粥樣硬化和再狹窄相關的信號通路，缺乏CD40-TRAF6相互作用的小鼠白細胞向內皮細胞募集減少，斑塊處巨噬細胞含量降低[18]。CD40/CD40L抑制劑具有抗動脈粥樣硬化的作用，與阻斷下游TRAF1和TRAF6通路密切相關，特別是TRAF6通路。與此同時，下游通路TRAF2、TRAF3、TRAF5也被抑制，進而導致免疫抑制。TRAF6通路的發(fā)現(xiàn)，為抗動脈粥樣硬化的特異性治療提供了方向。

2.1.1 TRAF6抑制劑的發(fā)現(xiàn) 研究人員發(fā)現(xiàn)，小分子抑制劑(SMIs)可選擇性阻斷CD40與TRAF6之間的相互作用，且不影響CD40與TRAF2/3/5之間的相互作用，從而保留CD40介導的免疫功能，如免疫球蛋白的類型轉換和T細胞增殖[19-23]。使用SMIs治療可阻斷ApoE-小鼠早期動脈粥樣硬化的發(fā)展，并阻止已存在的動脈粥樣硬化的進展，還可通過增加膠原含量和更小的壞死核心來改善斑塊的穩(wěn)定性特征[23]。動物實驗結果提示，特異性通路的阻斷可成為抗動脈粥樣硬化的新途徑。同樣，在飲食誘導的肥胖模型中，通過SMIs阻斷CD40與TRAF6的相互作用，可降低脂肪組織炎性反應、骨質疏松和胰島素敏感性[21]，進一步表明了TRAF6通路抑制劑在糖脂代謝中的作用，其具體機制值得進一步探索。TRAF6抑制劑抗動脈粥樣硬化的主要機制是降低經典單核細胞表達CD40和整合素，抑制單核細胞向血管壁的募集，主要是在動脈粥樣硬化的起始階段起作用。

2.1.2 TRAF6抑制劑納米顆粒靶向巨噬細胞 納米顆粒作為藥物的載體，在心血管疾病中應用廣泛。Duivenvoorden等[24]直接在ApoE-小鼠中注射以重組高密度脂蛋白(r-HDL)納米顆粒為載體的他汀類藥物，通過共聚焦成像技術，顯示該納米載體藥物在動脈粥樣硬化斑塊中富集，準確定位于斑塊中的巨噬細胞。類似的，研究人員通過將TRAF6抑制劑整合到r-HDL納米顆粒中，將TRAF6抑制劑特異性靶向作用于巨噬細胞。動物實驗驗證，TRAF6抑制劑納米顆粒治療6周可明顯減輕ApoE-小鼠早期動脈粥樣硬化的發(fā)生，這種療法可以阻斷CD40與TRAF6的相互作用，尤其是阻斷巨噬細胞在動脈粥樣硬化起始階段的重要作用。接受治療的小鼠動脈粥樣病變部位巨噬細胞數量減少，斑塊過渡到更穩(wěn)定的表型[22]。該抑制劑尚未用于人體，其安全性已在非人類靈長動物體內得到驗證，表明以納米顆粒為載體的rHDL-TRAF6抑制劑是安全的，并且在非人類靈長類動物中具有良好的生物分布，在小鼠和非人類靈長動物中均未觀察到納米顆粒的毒性作用[25]。該納米顆粒的靶向作用及分布需要進一步的實驗驗證，評估以納米顆粒為載體的TRAF6抑制劑的有效性、靶向性、安全性是未來的研究方向。

3 CD40/CD40L抑制劑對血小板的作用

在血小板中，CD40L至少與2個受體相互作用，包括CD40和αⅡbβ3整合素，通過與αⅡbβ3整合素結合，激活TRAF-2/Rac1/P38途徑，誘導P選擇素的表達和血小板的活化，導致血小板脫顆粒和聚集[26]。血小板CD40/CD40L在介導血小板誘導的動脈粥樣硬化炎性反應中起關鍵作用[27]。

α5β1整合素是一種血小板可溶性CD40L(sCD40L)受體。Simic等[28]首次使用抗α5β1阻斷抗體，證實α5β1整合素在血小板活化中的作用，顯示sCD40L與α5β1相互作用可導致血小板活化，該阻斷劑的應用降低了血小板的活化，減輕了動脈粥樣硬化中的炎性反應。另一種治療策略是利用CD40L與Mac-1的相互作用，也稱為CD11B/CD1整合素，它在神經滋養(yǎng)細胞、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞和巨噬細胞中大量表達[29]。腹腔內應用一種小肽可防止CD40L與Mac-1的相互作用，并通過減少炎性反應部位的白細胞活化來減輕小鼠動脈粥樣硬化[30]。CD40/CD40L抑制劑在血小板抗動脈粥樣硬化中的作用目前研究較少，主要集中在動物實驗。通過活體顯微鏡監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)缺乏CD40的血小板導致白細胞向頸動脈的募集減少，伴隨VCAM-1、血小板內皮細胞黏附分子、P-選擇素的表達減少，表明血小板CD40通過激活白細胞對內皮細胞的募集和活化，在動脈粥樣硬化的炎性反應中起關鍵作用，從而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[31]。

4 展望

CD40/CD40L抑制劑的免疫抑制和血栓風險限制了其臨床應用。CD40-TRAF6小分子抑制劑特異性阻斷CD40下游TRAF6，而保留CD40與TRAF2、3、5之間的免疫作用，免疫抑制風險下降，同時不影響血小板之間的相互作用，血栓風險下降，為抗動脈粥樣硬化治療開辟了新途徑。

在動脈粥樣硬化的進程中，血管內皮損傷和炎性反應導致內皮通透性增加，利用納米技術，將CD40-TRAF6小分子抑制劑制備為rHDL納米顆粒，該納米顆粒僅對斑塊處巨噬細胞有親和力，而不被體內淋巴細胞吸收[32]。靶向TRAF6的納米免疫療法是未來抗動脈粥樣硬化免疫療法的研究方向。

血小板CD40/CD40L在介導血小板誘導的動脈粥樣硬化炎性反應中起關鍵作用。血小板CD40通過激活白細胞和活化內皮細胞在炎性反應中起關鍵作用，通過增加VCAM-1、血小板內皮細胞黏附分子、VE-鈣黏蛋白和P-選擇素的表達，促進動脈粥樣硬化。血小板CD40通路抑制劑在抗動脈粥樣硬化中作用機制需要進一步探索。

CD40-TRAF抑制劑尚未應用于臨床，藥物的安全性、有效性、靶向性需要更多的實驗驗證。隨著研究的深入，需要解決免疫治療導致的免疫抑制和感染問題，權衡藥物的益處和風險，這將成為未來科研的熱點和難點。