果蔬酵素中純菌種篩選及其在復(fù)合發(fā)酵中的應(yīng)用

肖夢月，曹新志*，張楷正，趙迎慶，胡琴，楊建剛

(1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644005；2.四川保寧壓酒有限公司， 四川 閬中 637400；3.山東鳳凰生物有限公司，山東 泰安 271000)

拐棗，學(xué)名枳椇，因其形似“萬”字又得名萬壽果。很多研究表明，拐棗中不僅含有蛋白質(zhì)、多糖、果糖、維生素等營養(yǎng)成分，還含有黃酮和多酚等生物活性物質(zhì)[1,2]。目前關(guān)于拐棗的研究不多，現(xiàn)有產(chǎn)品有限，主要有拐棗酒、拐棗飲料和拐棗醋，還有很多研究是關(guān)于其相關(guān)成分的提取和檢測[3-5]。酵素本意指酶，現(xiàn)在多指各種原料經(jīng)過微生物發(fā)酵后所得的產(chǎn)品，酵素產(chǎn)品在保留自身有益成分的同時能夠經(jīng)微生物發(fā)酵產(chǎn)生更多的有益成分，所以經(jīng)很多研究發(fā)現(xiàn)酵素具有改善人體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，提高免疫力，抗氧化，延緩衰老，預(yù)防與心血管和肥胖等相關(guān)的疾病的功效[6-8]。日本在20世紀(jì)80年代就已經(jīng)將酵素產(chǎn)品的生產(chǎn)作為技術(shù)來研究并進(jìn)入應(yīng)用階段，在日本，每天有超過2000萬人在服用酵素產(chǎn)品，食用酵素在日本一年的消費額可達(dá)1000億日元[9]。雖然拐棗營養(yǎng)價值極高，但因其形態(tài)特殊，并略帶澀味，所以直接食用拐棗的人群較少。目前將拐棗應(yīng)用于酵素產(chǎn)品的研究還比較少見，本研究將拐棗與果蔬混合制作酵素，有望提高拐棗的加工利用率，使拐棗中的有益成分更好地得以利用。

酵素的發(fā)酵工藝可分為3種：不外加菌自然發(fā)酵、滅菌后加菌發(fā)酵和在自然發(fā)酵的基礎(chǔ)上外加菌復(fù)合發(fā)酵[10]。在自然發(fā)酵的基礎(chǔ)上外加菌復(fù)合發(fā)酵可以有效綜合前兩種方式的優(yōu)缺點，解決自然發(fā)酵過程中的很多問題，并且外加菌發(fā)酵還可以增加有益物質(zhì)的含量[11-14]。本文從自然發(fā)酵拐棗果蔬酵素中篩選出純菌種，將篩選出的純菌種應(yīng)用于外加菌復(fù)合發(fā)酵酵素工藝，以期達(dá)到縮短發(fā)酵周期、降低發(fā)酵成本的目的。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

紅糖、白砂糖及各種果蔬原料：均購于宜賓某市場；沒食子酸、無水碳酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、磷酸氫二鈉(十二水)、鹽酸、磷酸二氫鈉(二水)：均為分析純，購于成都市科隆化工試劑廠；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、麥芽浸粉、酵母膏等：生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 培養(yǎng)基

乳酸菌通用(MRS)培養(yǎng)基[15]：牛肉膏6.0 g，蛋白胨6.0 g，酵母浸粉3.0 g，乙酸鈉3.0 g，磷酸氫二鉀1.2 g，吐溫-80(聚山梨酯-80)0.6 mL，葡萄糖12.0 g，MnSO4·4H2O 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.35 g，檸檬酸銨1.2 g，蒸餾水600 mL，pH 6.2±0.2，固體培養(yǎng)基加瓊脂15.0 g，(無菌)碳酸鈣9.0 g，121 ℃、0.1 MPa高壓滅菌20 min。

酵母膏胨葡萄糖瓊脂(YPD)培養(yǎng)基：蛋白胨12.0 g，酵母浸膏6.0 g，葡萄糖12.0 g，固體培養(yǎng)基加瓊脂15.0 g，蒸餾水600 mL，121 ℃、0.1 MPa高壓滅菌15 min。

1.3 主要儀器與設(shè)備

GZ-250-S生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；LS-75HD立式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江區(qū)醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司；ISO 9001恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；TG-16臺式高速離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；TGL-16B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-1000紫外可見分光光度計 上海翱藝儀器有限公司；Thermo 868 pH計 熱電(上海)科技儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 拐棗果蔬酵素工藝流程及操作要點

1.4.1.1 工藝流程

果蔬清洗 風(fēng)干→去皮、去核→切丁→調(diào)配→裝罐密封→一次發(fā)酵→過濾→熟成。

1.4.1.2 操作要點

預(yù)處理：將拐棗(半干)、橘子、蘋果、梨、蘿卜、卷心菜、菠菜、檸檬、土豆、藕、西紅柿清洗干凈，于通風(fēng)處自然晾干水分后去皮、去核并切丁，將切好的果蔬按1∶1的比例混合得到混合果蔬。

調(diào)配：按比例加入菌種及糖，菌種在加入前進(jìn)行活化處理，酵母菌接種于YPD培養(yǎng)基中，于28 ℃搖床上，以轉(zhuǎn)速150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；乳酸菌于MRS培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)48 h。

裝罐密封：裝罐量為容積的80%，不可裝太滿。

一次發(fā)酵：前7 d每天攪拌1次。

過濾：一次發(fā)酵完成后用雙層紗布過濾。

熟成：將過濾后的一次發(fā)酵液密封后于常溫避光處二次發(fā)酵熟成，30 d左右完成。

1.4.2 檢測方法

1.4.2.1 還原力

參考毛酸漿酵素的還原力測定方法[16]，取經(jīng)離心處理的上清發(fā)酵液0.2 mL，加入2.5 mL濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.6)，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的鐵氰化鉀溶液，于50 ℃水浴20 min后快速冷卻，然后加入2.5 mL 20%的三氯乙酸溶液，于3600 r/min離心15 min后立即取上清液2.5 mL，加入去離子水2.5 mL和0.1%的三氯化鐵0.5 mL。以去離子水作參比在波長700 nm處測定吸光值。吸光值越大，說明還原能力越強(qiáng)，抗氧化效果越好。

1.4.2.2 SOD酶活力測定方法

參考國標(biāo)GB/T 5009.171-2003[17]，于25 ℃左右，取經(jīng)預(yù)處理并適當(dāng)稀釋的樣液0.2 mL于試管中，然后依次將2.35 mL濃度為0.1 mol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖溶液(pH為8.2，內(nèi)含1 mmol/L EDTA-2Na)、1.8 mL蒸餾水、0.15 mL 4.5 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后立即倒入石英比色皿中在波長325 nm條件下分別測定初始時和1 min后的吸光值，二者之差為A1，空白比色皿用10 mmol/L鹽酸調(diào)零，同樣用蒸餾水代替樣液測定鄰苯三酚的自氧化速率A0，SOD酶活性計算方式如下：

1.4.3 菌種的分離純化[18]

按酵素工藝制備自然發(fā)酵拐棗果蔬酵素，調(diào)配時加入50%的紅糖和50%的白砂糖，置于陰涼干燥處自然發(fā)酵3個月，取1 mL發(fā)酵中的自然發(fā)酵拐棗果蔬酵素原液，用無菌水逐級稀釋，得到101～107共7個梯度稀釋液。吸取100 μL各梯度的菌懸液分別涂布于MRS培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基上，其中，MRS培養(yǎng)基于37 ℃恒溫培養(yǎng)約48 h，YPD培養(yǎng)基于28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，倒置培養(yǎng)并隔一段時間進(jìn)行觀察。挑取具有明顯溶鈣圈和酵母菌特征的菌落，再在MRS培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。

1.4.4 菌種的篩選[19,20]

對疑似酵母菌的菌落直接水浸片鏡檢，對疑似乳酸菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色和顯微鏡下菌株形態(tài)觀察，并選擇具有典型酵母菌、乳酸菌和醋酸菌特征的菌株進(jìn)行斜面保藏和甘油管冷藏，甘油管冷藏按菌液和60%甘油1∶1的體積比接入甘油管內(nèi)并冷藏于低溫冰箱內(nèi)。對鏡檢未完全純化的菌株進(jìn)行二次劃線純化，并重復(fù)以上步驟。

1.4.5 分子生物學(xué)鑒定

1.4.5.1 菌株的活化

選擇典型的菌株，接種一環(huán)純化后的酵母菌單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24～48 h；乳酸菌單菌落接種于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h；乳酸菌取2 mL菌液于2 mL離心管(EP管)中，酵母菌需按不同提取方法取不同的量，離心后棄上清液，取沉淀。

1.4.5.2 酵母菌18S rDNA分子生物學(xué)鑒定

酵母菌通用引物：(1.1 kb)18S rDNA正向引物NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，反向引物NS4：5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′；(1.8 kb)18S rDNA正向引物NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，18S rDNA反向引物NS8：5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×Taq MasterMix 12.5 μL；DNA模板2 μL；Primer F，10 μmol/L，0.5 μL；Primer R，10 μmol/L，0.5 μL；無菌超純水9.5～25 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，于4 ℃保存。

1.4.5.3 乳酸菌16S rDNA分子生物學(xué)鑒定

細(xì)菌通用引物：(1.6 kb)16S rDNA正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×Taq MasterMix 12.5 μL；DNA模板2 μL；Primer F，10 μmol/L，0.5 μL；Primer R，10 μmol/L，0.5 μL；無菌超純水9.5～25 μL。

PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)，72 ℃ 8 min，于4 ℃保存。

送樣測序：PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR是否成功及片段大小。使用EditSeq結(jié)合Chromas軟件對所測序列進(jìn)行裁剪后，將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，分析序列同源性，并選擇相似度較高的序列，采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.6 復(fù)合拐棗果蔬酵素工藝優(yōu)化

1.4.6.1 單因素試驗

a.發(fā)酵菌種的選擇

經(jīng)預(yù)處理后將拐棗與混合果蔬按照1∶4的比例混合，調(diào)配時加入30%的混合糖，將樣品進(jìn)行編號1～4，分別加入酵母菌2%、乳酸菌2%、混合菌2%、混合菌4%。在溫度為30 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，每天取發(fā)酵液測定pH，直至pH穩(wěn)定后結(jié)束發(fā)酵進(jìn)行還原力和SOD酶活力的測定。

b.加糖量的選擇

前處理方式不變，將樣品進(jìn)行編號1～4，分別在調(diào)配時加入20%混合糖(紅糖與白砂糖的比例為1∶1)、30%的混合糖、40%的混合糖、50%的混合糖，每個樣品均添加2%的混合菌種，然后在30 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，每天取發(fā)酵液測定pH，直至pH穩(wěn)定不再下降后取發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)行還原力和SOD酶活力的測定。

c.發(fā)酵溫度的選擇

前處理方式不變，調(diào)配時加入30%的混合糖與2%的混合菌，將樣品進(jìn)行編號1～4，分別在25，30，35，40 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，每天取發(fā)酵液測定pH，直至pH穩(wěn)定不再下降后取發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)行還原力和SOD酶活力的測定。

1.4.6.2 正交試驗

在單因素的基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗(見表1)，考察加糖量、發(fā)酵溫度和接種量3個因素共同作用對拐棗果蔬酵素的影響，發(fā)酵結(jié)束后對發(fā)酵液的還原力和SOD酶活性進(jìn)行測定，每個樣品重復(fù)測定3次，最后結(jié)果取平均值，根據(jù)測定結(jié)果最終選擇出最優(yōu)工藝條件。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment for optimization of fermentation process

1.4.7 驗證試驗及發(fā)酵過程中pH值、還原力和SOD酶活性的變化規(guī)律

按照正交試驗所得到的最優(yōu)工藝，重新制作一批樣品，并每天取發(fā)酵液測定其pH值、還原力和SOD酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 純菌種的篩選結(jié)果

表2 酵母菌和乳酸菌菌落及菌株形態(tài)特征Table 2 The colonies and morphological characteristics of yeast and lactic acid bacteria

將分離出來的疑似酵母菌和疑似乳酸菌的菌種分別進(jìn)行純化，挑取單菌落鏡檢，根據(jù)表2的酵母菌和乳酸菌菌落及菌株形態(tài)特征選取形態(tài)不同的菌株進(jìn)行保藏，分別挑選出2株酵母菌和1株乳酸菌進(jìn)行生物學(xué)鑒定。

2.2 生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.2.1 酵母菌測序結(jié)果

將所得序列剪切后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，J-1-1及J-1-2與釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)的同源性為100%，故鑒定為釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)，其中酵母菌J-2-1和J-1-1的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

圖1 酵母菌J-1-1和J-2-1基于18S rRNA序列 進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of Saccharomyces J-1-1 and J-2-1 based on 18S rRNA sequence

2.2.2 乳酸菌鑒定結(jié)果

圖2 乳酸菌R-2-1基于16S rRNA序列進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Lactobacillus R-2-1 based on 16S rRNA sequence

檢測發(fā)現(xiàn)R-2-1與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的同源性為100%，故鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，菌株R-2-1的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

2.3 發(fā)酵菌種的選擇結(jié)果

圖3 不同菌種添加量對SOD酶活力和還原力的影響Fig.3 The effects of different strains' additive amount on SOD enzyme activity and reduction ability

由圖3可知，混合菌種添加的發(fā)酵效果均優(yōu)于單菌種添加，且只添加乳酸菌(第2組)的發(fā)酵效果要明顯優(yōu)于只添加酵母菌的(第1組)。其中第3組添加混合菌種量2%和第4組添加混合菌種量4%的發(fā)酵效果有差異，說明適宜的菌種種類與菌種添加量對酵素的品質(zhì)有很大影響。

2.4 加糖量的選擇結(jié)果

圖4 不同糖添加量對SOD酶活力和還原力的影響Fig.4 The effects of different sugar additive amount on SOD enzyme activity and reduction ability

由圖4可知，糖的添加量對酵素的SOD酶活力和還原力均會產(chǎn)生很大影響，隨著糖添加量的增大，SOD酶活力出現(xiàn)先增大后降低的現(xiàn)象，這可能是過高的糖添加量反而會抑制微生物的生長繁殖，最終導(dǎo)致所產(chǎn)酶活力下降。還原力隨著糖添加量的增大一直增大，這可能是由于糖添加量增多，被微生物分解成還原糖的量也越大，所以最終導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束時還原力很大。

2.5 溫度的選擇結(jié)果

由圖5可知，過高的溫度和過低的溫度均不利于酵素的發(fā)酵，隨著溫度的升高，拐棗果蔬酵素的SOD酶活力和還原力出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在35 ℃時SOD酶活力和還原力均達(dá)到最大值，這可能與所添加的酵母菌和植物乳桿菌的最適溫度有關(guān)系。

圖5 溫度對SOD酶和還原力的影響Fig.5 The effect of temperature on SOD enzyme and reduction ability

2.6 正交試驗結(jié)果

表3 發(fā)酵工藝正交試驗結(jié)果與分析Table 3 The results and analysis of orthogonal experiment for fermentation process

由表3極差值分析可知，影響酵素樣品SOD酶活力的因素主次順序為A>C>B，發(fā)酵溫度是影響酵素樣品SOD酶活力的最主要因素，這可能是由于溫度極大地影響了微生物的生長繁殖，因而影響了酵素的產(chǎn)物組成。影響酵素樣品還原力的主次順序為A>B>C，溫度對還原力的影響最大。對于SOD酶活力和還原力而言，兩種指標(biāo)均越大越好，所以從兩種指標(biāo)都可得出最優(yōu)組合是A2B2C3。

2.7 驗證試驗結(jié)果與發(fā)酵過程中各指標(biāo)變化規(guī)律

由圖6可知，在正交試驗所得最佳工藝條件下發(fā)酵，即發(fā)酵溫度35 ℃，混合糖添加量30%，接種酵母菌和植物乳桿菌按1∶1比例混合的混合菌4%，所得的拐棗果蔬酵素pH為3.64，SOD酶活力為252 U/mL，還原力為1.690，發(fā)酵時間為5 d。在發(fā)酵過程中前3 d pH值變化最明顯，然后趨于平穩(wěn)，在第6天有少許上升。還原力和SOD酶活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中還原力在第3天達(dá)到最大值，然后逐漸下降至比較平穩(wěn)。

圖6 發(fā)酵過程中各指標(biāo)的變化Fig.6 The changes of indexes during fermentation

3 結(jié)論

拐棗的營養(yǎng)豐富，目前應(yīng)用拐棗制作酵素的報道比較少見，自然發(fā)酵的拐棗果蔬酵素發(fā)酵周期長，加糖量多。本試驗從自然發(fā)酵的拐棗果蔬酵素中分離篩選出3株純菌種，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，2株酵母菌皆為釀酒酵母，1株乳酸菌為植物乳桿菌。將篩選出來的酵母菌和乳酸菌應(yīng)用于拐棗果蔬酵素的復(fù)合發(fā)酵工藝，通過單因素試驗和正交試驗最終得到最優(yōu)工藝為發(fā)酵溫度35 ℃，混合糖添加量30%，兩菌種各添加2%。在此工藝條件下發(fā)酵5 d所得的拐棗果蔬酵素SOD酶活力為252 U/mL，還原力為1.690，色澤呈淺紅棕色，口味酸甜，有拐棗固有風(fēng)味且無澀味。比較未添加拐棗的酵素，其含有更多的黃酮類和多酚類物質(zhì)，且更不易被雜菌污染。