p38絲裂原活化蛋白激酶通路在重癥急性胰腺炎中的作用

李海濤 張曉蘭 陳曉燕 李達(dá)周 王蓉 江傳燊 王雯

1解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院消化內(nèi)科，福州 350025；2福建醫(yī)科大學(xué)?？偱R床醫(yī)學(xué)院，福州 350025；3廈門(mén)大學(xué)附屬東方醫(yī)院，福州 350025

【提要】 將60只雄性SD大鼠分為對(duì)照組、急性壞死性胰腺炎(ANP)組、p38MAPK信號(hào)通路特異性抑制劑SB203580干預(yù)組。結(jié)果顯示，干預(yù)組大鼠胰腺病理?yè)p傷較ANP組顯著減輕，p38MAPKmRNA及蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，TNF-α表達(dá)也顯著下調(diào)。表明p38MAPK在ANP中發(fā)揮重要作用，抑制其表達(dá)可有效改善ANP的嚴(yán)重程度。

在重癥監(jiān)護(hù)室住院超過(guò)2周的重癥急性胰腺炎(SAP)患者中，有多達(dá)25%的患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥或病死[1]。因胰腺的炎癥反應(yīng)受到酶介導(dǎo)的細(xì)胞損傷的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致胰腺自身消化，釋放大量炎癥因子，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)[2]。細(xì)胞因子產(chǎn)生的一個(gè)密切相關(guān)的機(jī)制是蛋白激酶的激活[3- 4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPKs)在SAP發(fā)病機(jī)制中扮演了重要角色。磷酸化的p38MAPK (p-p38MAPK)是活化巨噬細(xì)胞的重要促炎成分[5]。p38 MAPK磷酸化先于核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)，而抑制p38 MAPK可以阻斷NF-κB磷酸化[6]，進(jìn)而抑制炎細(xì)胞因子(IL-1、IL-6)的釋放，改善SAP的癥狀[7]。本研究通過(guò)制備大鼠急性壞死性胰腺炎(acute necrotining pancretitis, ANP)模型，觀察p38MAPK信號(hào)通路特異性抑制干預(yù)后p38MAPK蛋白表達(dá)及TNF- α水平的變化，探討p38MAPK信號(hào)通路在ANP發(fā)病機(jī)制中的作用。

一、材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，體重250～300 g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究中心。在特定的無(wú)致病性條件下飼養(yǎng)，并提供足夠的無(wú)菌水和食物。60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、ANP組、p38MAPK信號(hào)通路特異性抑制SB203580干預(yù)組(干預(yù)組)，每組20只。建立模型之前，斷絕大鼠食物12 h，正常提供飲水。參照文獻(xiàn)[8]采用膽胰管逆行注射?；悄懰猁}1.5 ml/kg方法構(gòu)建ANP大鼠模型。干預(yù)組在制模前2 h尾靜脈注射9.5 mg/kg的SB203580。對(duì)照組未做任何處理。制模后12、24 h分兩批各處死10只大鼠，取胰腺組織，部分液氮冷凍，部分甲醛固定。

2．胰腺組織病理學(xué)檢查：取造模12 h后固定的胰腺組織，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。由3位病理醫(yī)師盲法讀片，對(duì)腺泡細(xì)胞壞死、間質(zhì)炎癥、水腫和出血程度進(jìn)行評(píng)分[9]。壞死：無(wú)壞死為0分，壞死面積<5%為1分，5%～<20%為2分，>20%為3分；炎癥：無(wú)炎癥為0分，輕度炎癥為1分，中度炎癥為2分，重度炎癥為3分；水腫：無(wú)或者極少為0分，小葉間隙水腫為1分，小葉內(nèi)水腫為2分，胰島呈孤立島狀為3分；實(shí)質(zhì)性出血：無(wú)出血為0分，輕度出血為1分，中度出血為2分，重度出血為3分?？偡肿罡邽?2分。

3．p38MAPK mRNA 表達(dá)檢測(cè)：取冷凍胰腺組織，采用Trizol試劑提取組織總RNA，應(yīng)用分光光度計(jì)法分析RNA的純度及濃度。采用qRT-PCR檢測(cè)組織p38MAPK mRNA 表達(dá)。先逆轉(zhuǎn)錄cDNA，RevertAid Reverse Transcriptase試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，按說(shuō)明書(shū)操作。再行PCR擴(kuò)增。引物由上海生工生物工程有限公司合成。p38MAPK正向引物5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′，反向引物5′-GAGCCAGTCCAAAATCCA-3′，β-actin正向引物5′-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCT-3′，反應(yīng)引物5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。引物序列均由Takara公司合成。PCR反應(yīng)條件：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。以公式2-△△CT計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

4．p38MAPK蛋白表達(dá)檢測(cè)：取冷凍胰腺組織，在10 mmol/L Hepes緩沖液(pH 7.5)中研磨，500 g離心去除細(xì)胞碎片，15 000 g離心后收集上清，采用Bradford法定量蛋白。取40 μg蛋白，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)p38MAPK蛋白表達(dá)。其中兔抗大鼠p38MAPK抗體購(gòu)自Caymann Chemical公司，工作濃度1∶100，HRP標(biāo)記小鼠抗兔IgG購(gòu)自Immune Chemical公司，工作濃度1∶20。由Fluorchem FC2 型熒光劑凝膠成像系統(tǒng)獲取條帶灰度值，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參β- actin條帶灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

5．ELISA法檢測(cè)TNF-α水平：取上述胰腺組織上清，采用ELISA法檢測(cè)上清中TNF-α水平。ELASA試劑盒(Catalog#KRC 3013)購(gòu)自Biosource公司，按說(shuō)明書(shū)操作，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。上酶標(biāo)儀測(cè)各孔在波長(zhǎng)450 nm處的吸光值(A450值)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本的TNF-α水平，取均值。

二、結(jié)果

1．胰腺病理形態(tài)改變及病理評(píng)分：對(duì)照組大鼠胰腺組織無(wú)明顯病理改變；造模24 h后ANP組大鼠出現(xiàn)血性腹水，鏡下見(jiàn)胰腺水腫、壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；干預(yù)組胰腺組織病理學(xué)變化較ANP組顯著減輕(圖1)。 對(duì)照組大鼠胰腺病理評(píng)分為0分，ANP組24、48 h胰腺病理評(píng)分分別為(3.6±0.04)、(3.7±0.02)分，干預(yù)組分別為(0.23±0.01)、(0.38±0.07)分。SB203580干預(yù)后病理?yè)p傷顯著減輕(P值均<0.05)。

注：ANP為急性壞死性胰腺炎

圖1對(duì)照組(1A)、ANP組(1B)、干預(yù)組(1C)大鼠的胰腺組織病理改變(HE ×200)

2．胰腺組織p38MAPK mRNA、蛋白表達(dá)量變化：12 h時(shí)對(duì)照組、ANP組、干預(yù)組大鼠胰腺組織p38MAPKmRNA表達(dá)量分別為1.00±0.09、2.36±0.12、1.84±0.14，24 h時(shí)分別為0.98±0.08、2.58±0.09、1.60±0.08；12 h時(shí)對(duì)照組、ANP組、干預(yù)組大鼠胰腺組織p38MAPK蛋白表達(dá)量分別為0.28±0.04、0.65±0.08、0.37±0.03，24 h時(shí)分別為0.25±0.04、0.63±0.07、0.34±0.02(圖2)。ANP組大鼠胰腺組織p38MAPKmRNA及蛋白表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，干預(yù)組顯著低于ANP組，但仍顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為28.67、42.02，8.92、25.74，15.96、17.33；13.08、14.91，10.36、12.60，5.69、6.36。P值均<0.05)。

3．胰腺組織TNF-α水平的變化：對(duì)照組大鼠胰腺組織12、24 h的TNF-α水平分別為(33.43±7.12)、(36.03±2.19)ng/L，ANP組分別為(180.38±13.42)、(220.65±18.42)ng/L，干預(yù)組分別為(110.51±12.22)、(150.29±9.22)ng/L。ANP組大鼠胰腺組織TNF- α水平顯著高于對(duì)照組，干預(yù)組顯著低于ANP組，但仍顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為30.98、38.20，11.38、10.39，17.34，19.23。P值均<0.05)。

注：ANP為急性壞死性胰腺炎

圖2對(duì)照組、ANP組、干預(yù)組大鼠12(1～3)、24(4～6) h時(shí)胰腺組織p38MAPK蛋白表達(dá)量

討論急性胰腺炎(AP)的早期事件包括非感染性的急性炎癥階段。細(xì)菌進(jìn)入胰腺組織，并由此產(chǎn)生繼發(fā)性炎癥是隨后發(fā)生的事件。胰腺實(shí)質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子最早發(fā)生在AP發(fā)生的前30 min內(nèi)[10]。早期產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，如TNF-α和IL-1β，導(dǎo)致局部炎癥遞質(zhì)的急劇上升，這些遞質(zhì)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，使機(jī)體處于一個(gè)超炎癥狀態(tài)[11]。因此，無(wú)論何種誘因，胰腺內(nèi)最初的局部器官特異性急性炎癥都會(huì)轉(zhuǎn)化為以多器官功能障礙為特征的全身性疾病。炎癥性遞質(zhì)，尤其是細(xì)胞因子，在這個(gè)過(guò)程中起著重要作用。

近年來(lái)，p38MAPK通路在AP發(fā)病機(jī)制中的作用受到廣泛關(guān)注[12]。盡管有研究表明，雨蛙肽誘導(dǎo)的大鼠AP實(shí)驗(yàn)中，抑制p38MAPK會(huì)進(jìn)一步加重病癥，提示p38MAPK可能在該模型中起保護(hù)作用，而不是有害作用[13]，但大多數(shù)研究則認(rèn)為p38MAPK激活加重AP。在雨蛙肽誘導(dǎo)的急性水腫性胰腺炎和CDE飲食誘導(dǎo)的小鼠ANP中，給予p38MAPK抑制劑CNI-1493可以有效改善胰腺壞死、高淀粉酶血癥、高脂血癥，并上調(diào)TNF-α基因表達(dá)[14]。p38MAPK還可通過(guò)G蛋白耦聯(lián)受體被激活，并通過(guò)激活核轉(zhuǎn)錄因子ATF-2、NF-κB等在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子TNF-α等產(chǎn)生[15]。本研究結(jié)果顯示，在ANP大鼠模型中，給予SB203580干預(yù)可以有效抑制p38MAPK表達(dá)，下調(diào)TNF-α表達(dá)，減輕胰腺病理?yè)p傷程度，為p38MAPK抑制劑臨床應(yīng)用于SAP的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突