補(bǔ)腎活血方調(diào)節(jié)COX-2、PGE2改善不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者分泌晚期蛻膜化水平的研究

馮曉玲，朱慧，常卓，張揚(yáng)，蔣莎，谷玥儒，賈紫千，吳儀

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Recurrent spontaneous abortion，RSA)是指與同一性伴侶妊娠20周前，連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，排除已知的病因，如解剖學(xué)因素、遺傳因素、免疫因素、內(nèi)分泌因素和感染因素等，仍有近40%～60%RSA是病因未知的，被稱(chēng)為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)[1-2]。近年來(lái)有研究認(rèn)為，RSA的發(fā)病與子宮內(nèi)膜的蛻膜化缺陷相關(guān)[3]。蛻膜化是月經(jīng)發(fā)生的前提，在正常月經(jīng)周期第23～24天時(shí)，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始蛻膜化，于月經(jīng)周期第28天蛻膜化基本完成由間質(zhì)細(xì)胞向蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。蛻膜化過(guò)程順利是胚胎植入、胎盤(pán)形成及妊娠維持的必備條件[4]。催乳素(Prolactin，PRL)和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1(Insulin-like growth factor binding protein-1，IGFBP-1)是衡量子宮內(nèi)膜蛻膜化水平的重要指標(biāo)，可調(diào)控子宮內(nèi)膜上皮的分化及胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能，防止受精卵氧化，以維持妊娠[5]。環(huán)氧合酶-2(COX-2)表達(dá)于著床前胚胎的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，能調(diào)控花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素E2(PGE2)[6]。研究表明，兩者均參與妊娠早期子宮內(nèi)膜蛻膜化和胚胎植入過(guò)程，影響胚胎著床、發(fā)育直至分娩，對(duì)女性生殖起到重要調(diào)控作用[7]。本文研究旨在明確URSA患者中COX-2、PGE2、蛻膜化水平的變化，并探索補(bǔ)腎活血方對(duì)URSA分泌晚期COX-2、PGE2、PRL及IGFBP-1水平的影響，從而在分子層面探究補(bǔ)腎活血方治療URSA的作用機(jī)制，為URSA疾病的病因?qū)W研究提供新思路，并對(duì)URSA疾病的臨床防治具有一定指導(dǎo)意義，值得推廣應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年3月—2019年2月在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門(mén)診及住院部治療的符合納入標(biāo)準(zhǔn)的腎虛血瘀型URSA患者共110例，其中現(xiàn)妊娠失敗需行清宮術(shù)患者 15 例(試驗(yàn)組1)，正常妊娠要求行人工流產(chǎn)術(shù)者 15 例(對(duì)照組1)，共收集蛻膜樣本 30 例。試驗(yàn)組1年齡平均(32.33±4.74)歲，孕周平均(9.30±1.75)周，對(duì)照組1年齡平均(33.80±3.74)歲，孕周平均(8.48±1.44)周，兩組受試者停經(jīng)周數(shù)、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。未孕患者80例(數(shù)字隨機(jī)法平均分為2組：試驗(yàn)組2給予補(bǔ)腎活血方，對(duì)照組2給予阿司匹林)。其中試驗(yàn)組2排除5例，對(duì)照組2排除20例，未計(jì)入統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。試驗(yàn)組2和對(duì)照組2年齡平均(30.75±4.02)歲，另選取正常未孕女性40例(空白組),空白組年齡平均(33.8±3.74)歲，各組受試者年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入、排除、脫落、剔除標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]。本實(shí)驗(yàn)已獲得黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

DEPC原液(廣州市藍(lán)博生物技術(shù)有限公司);TRLZOL Reagents(美國(guó)Invitrogen公司);無(wú)水乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司);三氯甲烷(天津市博迪化工有限公司);異丙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司);Human COX-2 Elisa kit試劑盒、Human PGE2 Elisa kit 試劑盒、Human IGFBP-1 Elisa kit試劑盒、Human PRL Elisa kit試劑盒等(碧云天生物公司)。

1.3 主要儀器

高速組織勻漿器T1000(德國(guó)IKA公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)BECKMANCOULTER 公司、型號(hào)：Alegra 21R);羅氏實(shí)時(shí)定量 PCR 儀(美國(guó) ThermoFisher Scientific公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(BioTek Instruments.Inc，型號(hào)：ELX808);318W型洗板機(jī)(上海三科儀器有限公司)等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 RT-PCR法檢測(cè)蛻膜中COX2、PGE2、PRL、IGFBP-1的mRNA

收集蛻膜，立即用無(wú)菌生理鹽水沖洗，用無(wú)菌剪刀剪去血塊，放入無(wú)菌器皿中，使用液氮迅速冷凍，放置在實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱中保存。

提取RNA(在冰上進(jìn)行)并測(cè)定純度。反轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格按照美國(guó) Thermo Scientific公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(PGE2：F 5'ATGGGACCTCCAAGCTCTTAG3'，R 5'GGAAGTTTGTGTTGCATCTTGTGT3'。COX-2：F 5'AGCAGGCAGATGAAATACCAGTCT3'，R 5'ATACAGCTCCACAGCATCGATGT3'。PRL：F 5'ATGGAAGTCCCGACCAGAC3'，R 5'ATTGAGGAGCAAACCAAACG3'。IGFBP-1：F 5'CTGCGTGCAGGAGTCTGA3'，R 5'CCCAAAGGATGGAATGATCC3'。GAPDH：F 5'ACAGTCAGCCGCATCTTC3'，R 5'CTCCGACCTTCACCTTCC3')。使用BIOTOOL的2x SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒，反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，40Cycles；60 ℃，30 s。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線。通過(guò)比較Ct方法定量結(jié)果，并且靶基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。

1.4.2 ELISA法檢測(cè)血清COX2、PGE2、PRL、IGFBP-1水平

試驗(yàn)組2、對(duì)照組2和空白組入組后月經(jīng)第26天抽取靜脈血，分離血清后凍存?zhèn)溆?，隨即試驗(yàn)組2給予補(bǔ)腎活血方(丹參15 g，桑寄生15 g，菟絲子15 g，黃芪15 g，續(xù)斷15 g，阿膠10 g)，每日100 mL水煎服，早晚分服(中藥湯劑由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥局和煎藥室提供)。對(duì)照組2給予阿司匹林，100 mg/日口服(意大利Bayer S.p.A.公司)。4周后再次留取靜脈血，分離血清凍存。

常溫解凍血清，標(biāo)記10孔的標(biāo)準(zhǔn)品于酶標(biāo)板上，稀釋濃度分別為：90，60，30，15，7.5 U/L(COX-2試劑盒)；360，240，120，60，30 ng/mL(PGE2試劑盒)；18，12，6，3，1.5 ng/mL(PRL試劑盒)；18，12，6，3，1.5 ng/mL(IGFBP -1試劑盒)。加入需測(cè)定樣品10 μL，37 ℃溫育30 min；棄去酶標(biāo)板中的液體，晾干，而后將洗滌液加入所有孔中，靜置30 s，棄液，重復(fù)5次；在樣品孔中加入50 μL的酶標(biāo)試劑，用移液器重復(fù)吹打多次直至其混合均勻，重復(fù)溫育、洗滌；將50 μL的顯色劑A、B依次加入微孔中，混合均勻，避光，37 ℃條件下顯色15 min；于每個(gè)微孔中加入 50 μL終止液終止反應(yīng)；使用ELX808全自動(dòng)酶標(biāo)儀，在450 nm波長(zhǎng)條件下，依照次序測(cè)量每個(gè)微孔的OD值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 蛻膜組織中COX-2、PGE2、PRL、IGFBP-1的mRNA 水平比較

試驗(yàn)組1蛻膜組織中COX-2、PGE2、PRL、IGFBP-1的mRNA水平均低于對(duì)照組1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

表1 試驗(yàn)組1和對(duì)照組1蛻膜組織中 COX-2、PGE2、PRL、IGFBP-1的mRNA水平比較

2.2 血清中COX-2、PGE2、PRL、IGFBP-1水平比較

治療前試驗(yàn)組2和對(duì)照組2血清COX2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；試驗(yàn)組2治療后血清COX2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平表達(dá)與治療前相比升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療后試驗(yàn)組2血清COX2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平高于對(duì)照組2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2)。治療后試驗(yàn)組2和對(duì)照組2相比血清COX2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平更接近于空白組(見(jiàn)圖1)。

表2 試驗(yàn)組2和對(duì)照組2血清COX-2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平比較

圖1 各組血清COX-2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平比較

2.3 COX-2、PGE2與蛻膜化因子PRL、IGFBP-1相關(guān)性

COX-2、PGE2與蛻膜化因子PRL、IGFBP-1之間存在顯著且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性(P<0.05，見(jiàn)表3)。

表3 COX-2、PGE2與蛻膜化因子PRL、IGFBP-1相關(guān)性比較

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)為當(dāng)代育齡期女性常見(jiàn)疾病，且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響女性身心健康。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因、病機(jī)復(fù)雜，包括夫妻雙方及胚胎染色體異常、內(nèi)分泌失調(diào)、免疫因素、胚胎種植部位及生殖道結(jié)構(gòu)異常、生殖道感染、血栓前狀態(tài)等因素相關(guān)[9]。子宮內(nèi)膜蛻膜化是指子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞受到蛻膜化誘導(dǎo)因子的刺激，使子宮內(nèi)膜增殖分化成特殊組織，有利于胚胎的植入及胎盤(pán)的形成，是維持妊娠的必須條件[10]。女性子宮內(nèi)膜的周期性改變是先天性的生物學(xué)特征，同理處于這種循環(huán)中的重要一節(jié)的蛻膜化改變屬于自動(dòng)發(fā)生的，與女性是否受孕無(wú)關(guān)；子宮內(nèi)膜蛻膜化后的發(fā)展可分為2種：若女性未受孕，蛻膜化的內(nèi)膜由于黃體的萎縮導(dǎo)致的激素水平突然降低而出現(xiàn)的撤退性出血，月經(jīng)期過(guò)后，子宮內(nèi)膜立即進(jìn)入下一個(gè)周期；若卵子與精子成功結(jié)合，女性受孕，則蛻膜化的內(nèi)膜繼續(xù)增殖和分泌，為接下來(lái)的胚胎植入和胎盤(pán)發(fā)育做準(zhǔn)備，形成母胎界面中母體面的主要成分；有研究人員認(rèn)為，子宮內(nèi)膜蛻膜化是早孕是否成功的關(guān)鍵因素之一[11]。子宮內(nèi)膜蛻膜化對(duì)女性妊娠有著至關(guān)重要的作用，如楊慧等人通過(guò)體外誘導(dǎo)正常人和RSA患者內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化進(jìn)行對(duì)比研究，它們認(rèn)為復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展的重要原因，即蛻膜化異常[12]。目前，PRL及IGFBP-1已被廣泛認(rèn)可為衡量蛻膜化水平的標(biāo)志性指標(biāo)[13]。PRL由垂體分泌，作用于妊娠黃體，一定量的PRL，能促進(jìn)子宮內(nèi)膜蛻膜化形成，增加子宮內(nèi)膜容受性，避免母胎排斥，是維持妊娠的關(guān)鍵。同時(shí)，PRL也是蛻膜化的產(chǎn)物，分化良好的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞又可以分泌更多的PRL，維持妊娠[14]。IGFBP-1是分泌期子宮內(nèi)膜的產(chǎn)物，在蛻膜化基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[15]，調(diào)控子宮內(nèi)膜基底細(xì)胞有絲分裂，既作為蛻膜化產(chǎn)物，又可促進(jìn)和維持蛻膜化水平。

環(huán)氧合酶COX是參與前列腺素及其衍生物合成的重要限速酶，包括COX-1、COX-2和COX-3同工酶，其中COX-2的表達(dá)對(duì)胚胎的種植及蛻膜化起到促進(jìn)作用，其水平隨著滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入不斷增加，因此COX-2的高表達(dá)是維持妊娠的重要條件。COX-2屬于誘導(dǎo)型，是一種即刻早期反應(yīng)基因，在多數(shù)組織中不體現(xiàn)，活性較為穩(wěn)定，但在一些應(yīng)激刺激條件下活性度增高，產(chǎn)生一系列反應(yīng)物質(zhì)參與人體生理或病理活動(dòng)[16]；如通過(guò)COX-2缺陷雌性小鼠的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，COX-2表達(dá)異常會(huì)引起排卵障礙、蛻膜化不完全、胚胎著床失敗和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等疾病[17]。COX-2催化花生四希酸產(chǎn)生的PGE2，可促進(jìn)胚胎種植部位血管再生及局部血流量增加[18-19]。前列腺素廣泛存在于人體多種組織中，如卵巢、子宮、肝臟、血小板、紅細(xì)胞等，并且不同器官中不同時(shí)期前列腺素的功能不同，且在分泌晚期PGE2及其信號(hào)通路上游物質(zhì)COX-2含量顯著增加[20]；PGE2是調(diào)節(jié)子宮肌肉收縮的有效刺激物，若PGE2表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致子宮收縮調(diào)節(jié)失衡，繼而異常子宮出血、痛經(jīng)、不孕癥、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等疾病出現(xiàn)的可能性增加[21]；于浩等人認(rèn)為COX-2是子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程中的關(guān)鍵影響因素[22]；COX-2催化出的PGE2能夠增加子宮內(nèi)膜血管通透性，參與蛻膜化的過(guò)程[23]。紀(jì)蓓蓓等人發(fā)現(xiàn)，在未孕女性外周血清中可測(cè)得PGE2，并可作為差異性比價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)，且未孕女性外周血中PGE2濃度與孕期女性相比有明顯差異[24]。有研究報(bào)告稱(chēng)，在反復(fù)妊娠失敗的著床期子宮內(nèi)膜中監(jiān)測(cè)出COX-2，并與流產(chǎn)密切相關(guān)[25]。試驗(yàn)結(jié)果顯示腎虛血瘀型不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的流產(chǎn)蛻膜組織中COX-2、PGE2、IGFBP-1、PRL的表達(dá)水平較正常女性低；COX-2、PGE2與蛻膜化因子PRL、IGFBP-1之間存在顯著且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性，證實(shí)了URSA患者的低蛻膜化水平與COX-2、PGE2的低表達(dá)相關(guān)，推測(cè)兩者變化可能會(huì)影響蛻膜化水平。

中醫(yī)將URSA歸屬于“滑胎”范疇，腎為先天之本，主藏精氣，可固攝胎元，腎虛為滑胎的根本，腎虛沖任不固，系胎無(wú)力，則屢孕屢墮。血瘀則胞脈氣血運(yùn)行不暢，瘀血阻滯，新血不能下注胞胎而胎失所養(yǎng)、胎元不實(shí)。在子宮內(nèi)膜蛻膜化過(guò)程中，經(jīng)常觀察到大量的血管重塑，細(xì)胞增殖和分化，以及分泌的突然增加等[5]?，F(xiàn)代研究認(rèn)為腎虛血瘀型URSA為血栓前狀態(tài)所致，引起蛻膜及胎盤(pán)微血栓形成，影響胎盤(pán)血供，形成絨毛膜后或蛻膜下血腫，刺激子宮收縮而誘發(fā)流產(chǎn)[26]。補(bǔ)腎活血方具有促進(jìn)血液流通，維持分泌功能，防止免疫異常導(dǎo)致的損傷；補(bǔ)充腎氣，促進(jìn)氣血流通，改善血瘀狀態(tài)；促進(jìn)蛻膜化的正常進(jìn)展，推動(dòng)其生長(zhǎng)發(fā)展，維持子宮環(huán)境的平衡，抑制針對(duì)胎兒的母體免疫排斥[27]。西醫(yī)多應(yīng)用阿司匹林抗血栓形成，對(duì)其用于治療URSA仍存在爭(zhēng)議。中醫(yī)認(rèn)為URSA患者多以腎虛為本，血瘀為標(biāo)，治則以補(bǔ)腎祛瘀，活血安胎為主。補(bǔ)腎活血方：丹參15 g，桑寄生15 g，菟絲子15 g，黃芪15 g，續(xù)斷15 g，阿膠(烊化)10 g。方中丹參，活血祛瘀，具有抗血栓、改善微循環(huán)的作用；菟絲子、續(xù)斷、桑寄生，補(bǔ)腎安胎, 可調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)、抑制宮縮、抗凝血等；黃芪、阿膠補(bǔ)氣養(yǎng)血，促進(jìn)血液流通。觀察結(jié)果顯示，補(bǔ)腎活血方治療后，腎虛血瘀型不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)未孕患者分泌晚期血清中COX-2、PGE2、IGFBP-1、PRL表達(dá)水平較入組時(shí)顯著提高，與正常女性相比無(wú)明顯差別。

綜上所述，同正常女性相比URSA患者蛻膜化水平較低，可能與COX-2、PGE2表達(dá)異常降低有關(guān)。補(bǔ)腎活血方體內(nèi)干預(yù)可在未孕時(shí)提高血清中COX-2、PGE2、IGFBP-1、PRL水平，改善蛻膜化進(jìn)程，提高蛻膜化水平，從而達(dá)到補(bǔ)腎活血，祛瘀安胎的目的，利于妊娠的維持。