調(diào)環(huán)酸鈣協(xié)同硝酸鈣控制采后富士蘋果苦痘病

彭 勇，王君曉，馬玉榮，劉 佩，王慶國(guó)*

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，國(guó)家蘋果工程技術(shù)研究中心，山東 泰安 271018）

蘋果苦痘病是發(fā)生在成熟期及其貯藏過程中的一種生理性病害，其癥狀是果實(shí)的花萼端外皮層局部凹陷，形成褐色的斑點(diǎn)，果肉組織死亡，造成果皮組織凹陷[1-3]。蘋果苦痘病顯著影響蘋果的貯藏品質(zhì)和商品價(jià)值，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，制約了蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。

許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)蘋果苦痘病與組織鈣元素失調(diào)，尤其是與缺鈣有關(guān)，其病癥的發(fā)生常伴隨果實(shí)的低鈣含量[1]。然而，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，較低的總鈣含量與苦痘病的發(fā)生率不完全正相關(guān)[4-5]。而苦痘病的發(fā)生卻與果實(shí)內(nèi)部水溶性鈣、果膠鈣、磷酸鈣等各種形態(tài)鈣在細(xì)胞內(nèi)的分布及轉(zhuǎn)化有關(guān)。陳見暉等[3]研究發(fā)現(xiàn)蘋果貯藏期間，生理活性鈣（水溶性鈣和果膠鈣）向非生理活性鈣（磷酸鈣和草酸鈣等）的無(wú)效化轉(zhuǎn)變是導(dǎo)致果實(shí)生理失調(diào)的重要原因之一。鈣作為細(xì)胞內(nèi)的重要組分及調(diào)節(jié)物質(zhì)，有著重要的生理功能，細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)鈣的物質(zhì)都有可能與苦痘病的發(fā)生有關(guān)[6]。Falchi等[4]研究發(fā)現(xiàn)，脫落酸處理可降低蘋果果實(shí)苦痘病的發(fā)病率，并且能夠降低鈣反向轉(zhuǎn)運(yùn)體、鈣依賴蛋白激酶、焦磷酸酶等鈣相關(guān)酶的基因表達(dá)。因此，為了預(yù)防蘋果苦痘病的發(fā)生，鈣的調(diào)控仍是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

外源鈣處理在改善果實(shí)抗病性方面具有重要作用。硝酸鈣是一種含有硝態(tài)氮的鈣肥，可以快速補(bǔ)充樹體內(nèi)鈣素的缺乏，有利于提高果實(shí)的硬度、改善品質(zhì)。生產(chǎn)上，采前施用硝酸鈣可以增加果實(shí)組織中的鈣含量，預(yù)防采后蘋果苦痘病的發(fā)生[7-8]，裴健翔等[9]研究發(fā)現(xiàn)，采后浸硝酸鈣處理也可以提高蘋果的硬度，抑制多聚半乳糖醛酸酶的活性和纖維素的降解，維持果實(shí)較高的品質(zhì)。調(diào)環(huán)酸鈣作為一種新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可以抑制赤霉素（gibberellin，GA）的合成，抑制GA19和GA20的活性，抑制莖和葉片的生長(zhǎng)，并使植物具有較好的抗病害能力[10]。在對(duì)葡萄的研究中發(fā)現(xiàn)，調(diào)環(huán)酸鈣可以抑制葡萄樹梢的生長(zhǎng)，縮短節(jié)間長(zhǎng)度，并且可以抑制葡萄果實(shí)的膨大[11-12]。Freitas等[13]通過GA和調(diào)環(huán)酸鈣噴灑番茄實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，噴灑GA的果實(shí)，100%患蒂腐病，質(zhì)外體中的水溶性鈣含量低，膜質(zhì)裂解程度高；而噴灑調(diào)環(huán)酸鈣的果實(shí)，蒂腐病的發(fā)病率降低，質(zhì)外體中的水溶性鈣離子含量更高。然而，對(duì)于調(diào)環(huán)酸鈣調(diào)控蘋果苦痘病的研究較少，對(duì)于調(diào)環(huán)酸鈣復(fù)配鈣離子調(diào)控蘋果苦痘病也鮮有報(bào)道。

本研究以苦痘病發(fā)病率較高的富士蘋果為試材，利用采后水壓浸鈣方法，通過調(diào)環(huán)酸鈣、硝酸鈣等處理，探討調(diào)環(huán)酸鈣協(xié)同硝酸鈣控制蘋果苦痘病的原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用富士蘋果于2016年10月23日采購(gòu)于山東省威海市文登區(qū)管理良好的果園，果實(shí)九成熟、全紅，達(dá)到商品采收標(biāo)準(zhǔn)。采摘后，當(dāng)天晚上運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，挑選大小均勻、無(wú)機(jī)械傷、無(wú)病蟲害的果實(shí)用于實(shí)驗(yàn)處理。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810PC紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AA-7200原子吸收分光光度計(jì) 日本島津公司；DW-HL388超低溫冰柜 中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；PAL-1數(shù)顯折光儀 日本ATAGO公司；FDK30硬度計(jì) 美國(guó)WAGNER公司；Allegra 64R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品準(zhǔn)備

將蘋果隨機(jī)分為4 組，分別用清水（對(duì)照）、調(diào)環(huán)酸鈣（80 mg/L）、硝酸鈣（7.08 g/L）、80 mg/L調(diào)環(huán)酸鈣結(jié)合7.08 g/L硝酸鈣進(jìn)行處理（質(zhì)量濃度的選擇根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及先前的水壓浸鈣結(jié)果）；為了保證鈣離子快速滲透至果實(shí)內(nèi)部，實(shí)驗(yàn)采用水壓浸鈣的方式，水壓裝置為直徑20 cm、高4.5 m的供水管，水深3 m，處理時(shí)間為1 min。浸鈣處理結(jié)束后用紙擦干果實(shí)表面，放置紙箱內(nèi)，紙箱內(nèi)附有聚乙烯保鮮袋，折口于20 ℃貯藏，于處理后0、2、6、15、25 d和40 d觀察取樣，并測(cè)定各指標(biāo)。

用于統(tǒng)計(jì)苦痘病發(fā)病率的果實(shí)，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30 個(gè)果實(shí)。用于硬度和可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定的果實(shí)，每個(gè)處理測(cè)定18 個(gè)，每個(gè)果實(shí)測(cè)定2 次。測(cè)定其他指標(biāo)時(shí)，于每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)取18 個(gè)果實(shí)，分別用削皮刀取蘋果果皮內(nèi)側(cè)的外皮層1～2 mm部位，混合均勻，迅速放置液氮中冷凍，-80 ℃貯藏。

1.3.2 苦痘病發(fā)病率和患病指數(shù)的測(cè)定

發(fā)病率以苦痘病發(fā)病的數(shù)量占總數(shù)量的比例來(lái)表示。

果實(shí)患病級(jí)別：按果面的病斑個(gè)數(shù)將果實(shí)患病級(jí)數(shù)分為6 個(gè)級(jí)別，病斑個(gè)數(shù)為0、1～5、6～10、11～15、16～20 個(gè)和多于20 個(gè)時(shí)，分別對(duì)應(yīng)果實(shí)的0、1、2、3、4、5 級(jí)?；疾≈笖?shù)按公式（1）計(jì)算。

1.3.3 外皮層鈣含量的測(cè)定

總鈣含量的測(cè)定參照汪良駒等[14]的方法，稱取5 g樣品，烘干至恒質(zhì)量，準(zhǔn)確稱取0.4 g干樣，加入10 mL消化液（V（濃硝酸）∶V（高氯酸）＝4∶1）過夜消化，放置電爐上加熱使樣品消解，加入0.5 g/100 mL氧化鑭溶液，搖勻，濾液存入10 mL的離心管中，用于總鈣含量的測(cè)定。采用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定總Ca含量。

不同形態(tài)鈣含量的測(cè)定參照龔云池[15]和陳見暉[3]等的方法，準(zhǔn)確稱取0.5 g凍樣于15 mL離心管中，勻漿后浸提12 h，4 ℃、10 000hg離心10 min，吸取上清液，過濾后用于水溶性鈣含量的測(cè)定。將殘?jiān)瓷鲜霾襟E用10 mL 1 mol/L NaCl、10 mL體積分?jǐn)?shù)2%冰醋酸溶液、10 mL體積分?jǐn)?shù)5%鹽酸溶液分別逐級(jí)浸提得到果膠鈣、磷酸鈣和草酸鈣，采用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定各中形態(tài)的鈣含量。

1.3.4 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的測(cè)定

稱取0.5 g樣品加入5 mL、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提取，25 ℃超聲30 min，11 000hg離心10 min后取上清液備用。將30 μL樣品加入3 mL 2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）工作液（7 mmol/L ABTS溶液與4.9 mmol/L過硫酸鉀溶液按體積比1∶1混合），再將工作液分為兩部分，一部分黑暗條件保存約12～16 h，測(cè)定其在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度（At）；另一部分20 ℃避光反應(yīng)5 min后，測(cè)定其在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度（Ai），對(duì)照用乙醇代替ABTS（A0）。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率按公式（2）計(jì)算。

1.3.5 超氧化物歧化酶活力的測(cè)定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的測(cè)定參照趙曉梅[16]的方法并略有改動(dòng)，取1 g樣品，加入5 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8），冰浴提取，在4 ℃下10 000hg離心20 min，上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系：1 mL磷酸鹽緩沖液、2.5 mL混合液（包括130 mmol/L甲硫氨酸、750 μmol/L氮藍(lán)四唑、100 μmol/L EDTA-2Na）、1 mL酶液。在反應(yīng)體系中加入0.5 mL 20 μmol/L核黃素，置于日光燈下反應(yīng)13 min，取出后置于暗處終止反應(yīng)，于560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（AE）。以不照光管作為空白參比，不加酶液組為空白對(duì)照組（ACK）。定義抑制氮藍(lán)四唑光化還原50%為一個(gè)酶活力單位。SOD活力按公式（3）計(jì)算。

式中：V表示測(cè)定樣品總體積/mL；m表示樣品質(zhì)量/g；V1表示測(cè)定時(shí)樣品液用量/mL。

1.3.6 過氧化物酶活力的測(cè)定

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測(cè)定參照李賢宇等[17]的方法并略有改動(dòng)。準(zhǔn)確稱量1 g樣品，加入1 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），混勻后4 ℃下10 000hg離心20 min，上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系為2.5 mL反應(yīng)液（含28 μL愈創(chuàng)木酚、19 μL過氧化氫）、1 mL酶液，對(duì)照以1 mL磷酸緩沖液代替酶液，測(cè)定反應(yīng)體系470 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以每分鐘吸光度變化0.01為一個(gè)酶活力單位。POD活力按公式（4）計(jì)算。

式中：m表示樣品鮮質(zhì)量/g；VS表示測(cè)定時(shí)取用酶液體積/mL；t表示反應(yīng)時(shí)間/min；VT表示樣品總體積/mL。

1.3.7 丙二醛含量的測(cè)定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量參照Duan Xuewu等[18]的方法并略有改動(dòng)，準(zhǔn)確稱取1 g凍樣，加入5 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，4 ℃、10 000hg離心10 min。取1 mL上清液加入3 mL反應(yīng)液（0.5 g/100 mL硫代巴比妥酸溶液、用10 g/100 mL的TCA溶液配制），放入沸水中煮沸20 min，冷卻后分別在532 nm和600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，MDA含量按照公式（5）計(jì)算。

式中：V表示上清液的體積/mL；V1表示測(cè)定時(shí)所用上清液的體積/mL；m表示樣品鮮質(zhì)量/g。

1.3.8 硬度和可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

將不同時(shí)期取樣的蘋果削皮后，用FDK30硬度計(jì)測(cè)定赤道面果肉硬度，單位為kg/cm3。采用PAL-1數(shù)顯折光儀測(cè)定可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，SigmaPlot軟件作圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 調(diào)環(huán)酸鈣協(xié)同硝酸鈣處理對(duì)富士蘋果苦痘病發(fā)病率和患病指數(shù)的影響

圖 1 調(diào)環(huán)酸鈣協(xié)同硝酸鈣對(duì)富士蘋果苦痘病發(fā)病率（A）和患病指數(shù)（B）的影響Fig. 1 Effect of prohexadione-calcium combined with calcium nitrate on bitter pit incidence (A) and index (B) of Fuji apple

由圖1A可知，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，苦痘病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。貯藏期間，單一調(diào)環(huán)酸鈣處理果實(shí)發(fā)病率與對(duì)照組果實(shí)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。在貯藏后期，硝酸鈣處理及其結(jié)合調(diào)環(huán)酸鈣處理能顯著降低蘋果苦痘病的發(fā)病率。貯藏25 d時(shí)，硝酸鈣處理及其結(jié)合調(diào)環(huán)酸鈣處理的蘋果果實(shí)苦痘病發(fā)生率分別比對(duì)照組低21.67%和41.67%；貯藏至40 d時(shí)，硝酸鈣處理及其結(jié)合調(diào)環(huán)酸鈣處理組的發(fā)病率比對(duì)照組分別低15.62%和50.00%。上述結(jié)果表明，單一調(diào)環(huán)酸鈣處理對(duì)富士蘋果苦痘病沒有控制效果，硝酸鈣及其結(jié)合調(diào)環(huán)酸鈣處理控制苦痘病效果顯著，且調(diào)環(huán)酸鈣協(xié)同硝酸鈣復(fù)合處理效果最好。

由圖1B可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同處理組間的果實(shí)苦痘病患病指數(shù)均呈現(xiàn)出整體上升的趨勢(shì)。在整個(gè)貯藏期間，單一調(diào)環(huán)酸鈣處理組果實(shí)苦痘病患病指數(shù)與對(duì)照果實(shí)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。貯藏前25 d，果實(shí)的患病指數(shù)上升較快，同對(duì)照相比，硝酸鈣和調(diào)環(huán)酸鈣結(jié)合處理能夠顯著降低貯藏后期果實(shí)的患病指數(shù)（P＜0.05）。由此可見，單一調(diào)環(huán)酸鈣處理對(duì)降低富士蘋果果實(shí)苦痘病的患病指數(shù)沒有效果，采后水壓浸硝酸鈣和與調(diào)環(huán)酸鈣結(jié)合處理能夠有效降低貯藏期間富士蘋果果實(shí)的患病指數(shù)，且調(diào)環(huán)酸鈣協(xié)同硝酸鈣處理效果更好。

2.2 調(diào)環(huán)酸鈣協(xié)同硝酸鈣處理對(duì)富士蘋果總鈣含量的影響

圖 2 調(diào)環(huán)酸鈣協(xié)同硝酸鈣對(duì)富士蘋果外皮層總鈣含量的影響Fig. 2 Effect of prohexadione-calcium combined with calcium nitrate on total calcium content of Fuji apple

由圖2可知，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，富士蘋果外皮層中的總鈣含量呈上升趨勢(shì)。在0 d時(shí)（處理后取樣），各處理組外皮層的總鈣含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），結(jié)果表明，浸鈣處理對(duì)增加外皮層中總鈣含量的效果明顯。在整個(gè)貯藏期間，硝酸鈣和結(jié)合處理的外皮層總鈣含量顯著高于其他兩組，且結(jié)合處理的外皮層中總鈣含量顯著高于硝酸鈣處理，表明調(diào)環(huán)酸鈣在外皮層中能夠協(xié)同硝酸鈣作用，促進(jìn)鈣離子的吸收。

2.3 調(diào)環(huán)酸鈣協(xié)同硝酸鈣處理對(duì)富士蘋果水溶性鈣、果膠鈣、磷酸鈣和草酸鈣含量的影響

由圖3A可知，貯藏期間，富士蘋果外皮層中水溶性鈣含量呈上升趨勢(shì)。貯藏0 d時(shí)，各處理組水溶性鈣含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），以結(jié)合處理組水溶性鈣含量最高。貯藏25 d時(shí)，硝酸鈣處理組和結(jié)合處理組的水溶性鈣含量達(dá)到最高值，分別比對(duì)照高8.91、9.64 μg/g。單一調(diào)環(huán)酸鈣處理對(duì)增加外皮層中鈣含量的效果有限。

由圖3B可知，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，外皮層中果膠鈣含量呈上升趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，整個(gè)貯藏期間，單一調(diào)環(huán)酸鈣處理顯著降低了外皮層的果膠鈣含量，而硝酸鈣和結(jié)合處理顯著提高果膠鈣含量，并且結(jié)合處理增加果膠鈣含量的效果顯著高于硝酸鈣處理；貯藏25 d時(shí)，結(jié)合處理組的果膠鈣含量比對(duì)照組高10%（P＜0.05）。由此表明，調(diào)環(huán)酸鈣能夠有效地協(xié)同硝酸鈣增加外皮層中的果膠鈣含量，從而有效維持果實(shí)的硬度。

由圖3C可知，貯藏期間，外皮層中磷酸鈣含量變化較小，這與劉劍鋒等[19]研究發(fā)現(xiàn)浸鈣對(duì)磷酸鈣含量沒有顯著影響的結(jié)果是一致的。幾種處理比較來(lái)看，以結(jié)合處理的磷酸鈣含量最低，而其他處理與對(duì)照差異不顯著，尤其是在貯藏后期。由圖3D可知，外皮層中草酸鈣含量整體呈先上升后下降趨勢(shì)，貯藏2 d時(shí)，硝酸鈣和結(jié)合處理提高草酸鈣含量的效果顯著高于對(duì)照，貯藏2～25 d期間，草酸鈣含量整體呈下降趨勢(shì)，以結(jié)合處理的草酸鈣含量最高，對(duì)保持草酸鈣含量效果最好。

圖 3 調(diào)環(huán)酸鈣協(xié)同硝酸鈣對(duì)富士蘋果外皮層中水溶性鈣（A）、果膠鈣（B）、磷酸鈣（C）和草酸鈣（D）含量的影響Fig. 3 Effect of prohexadione-calcium combined with calcium nitrate on water soluble calcium (A), pectin calcium (B), phosphate calcium (C)and oxalate calcium (D) contents of Fuji apple

2.4 調(diào)環(huán)酸鈣協(xié)同硝酸鈣處理對(duì)富士蘋果抗氧化活性的影響

由圖4A可知，貯藏0～6 d，蘋果外皮層ABTS陽(yáng)離子自由基清除率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，貯藏6～25 d期間，ABTS陽(yáng)離子自由基清除率保持相對(duì)穩(wěn)定。單一調(diào)環(huán)酸鈣處理的蘋果外皮層ABTS陽(yáng)離子自由基清除率顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明調(diào)環(huán)酸鈣處理對(duì)提高外皮層的抗氧化活性具有一定的效果。在整個(gè)貯藏期間，硝酸鈣處理和結(jié)合處理組的外皮層ABTS陽(yáng)離子自由基清除率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且結(jié)合處理組的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率最高，表明調(diào)環(huán)酸鈣能夠協(xié)同硝酸鈣提高外皮層的抗氧化活性，降低果實(shí)遭受氧化應(yīng)激損傷的可能性，保持膜的完整性。

由圖4B可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，外皮層的POD活力呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。貯藏25 d時(shí)，硝酸鈣處理和結(jié)合處理組蘋果外皮層POD活力均顯著高于對(duì)照組。除了第0天外，單一調(diào)環(huán)酸鈣處理組POD活力在貯藏期間與對(duì)照組差異不顯著。

由圖4C可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD活力呈先上升后下降的趨勢(shì)，且在貯藏2 d達(dá)到最高值。硝酸鈣處理和結(jié)合處理組的外皮層中SOD活力均顯著高于對(duì)照組，并且結(jié)合處理提高SOD活力的效果明顯高于硝酸鈣處理，但單一的調(diào)環(huán)酸鈣處理對(duì)外皮層SOD活力影響不明顯。貯藏后期，SOD活力逐漸降低，可能與細(xì)胞受到損傷導(dǎo)致的總抗氧化能力降低有關(guān)。

由圖4D可知，貯藏前期，蘋果外皮層MDA含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，貯藏6～15 d，MDA含量快速增加，并且對(duì)照組和調(diào)環(huán)酸鈣處理組的果實(shí)MDA含量顯著高于硝酸鈣處理組和結(jié)合處理組，結(jié)合處理組的MDA含量最低，表明結(jié)合處理組的果實(shí)膜質(zhì)氧化程度低，果實(shí)受到的氧化損傷小。

圖 4 調(diào)環(huán)酸鈣協(xié)同硝酸鈣對(duì)蘋果ABTS陽(yáng)離子自由基清除率（A）、POD活力（B）、SOD活力（C）、MDA含量（D）的影響Fig. 4 Effect of prohexadione-calcium combined with calcium nitrate on ABTS cation free radical scavenging activity (A), POD activity (B),SOD activity (C), and MDA content (D) of Fuji apple

2.5 調(diào)環(huán)酸鈣協(xié)同硝酸鈣處理對(duì)富士蘋果硬度和可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖 5 調(diào)環(huán)酸鈣協(xié)同硝酸鈣對(duì)富士蘋果硬度（A）和可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）的影響Fig. 5 Effect of prohexadione-calcium combined with calcium nitrate on firmness (A) and soluble solids content (B) of Fuji apple

由圖5A可知，與貯藏初期相比，貯藏15 d后對(duì)照組和調(diào)環(huán)酸鈣處理組硬度明顯下降，對(duì)照組和調(diào)環(huán)酸鈣處理組硬度下降近30%，而硝酸鈣處理及結(jié)合處理組蘋果果肉硬度在15 d內(nèi)變化較小。這表明，硝酸鈣及結(jié)合處理能夠有效維持果實(shí)硬度，延緩果實(shí)衰老。

由圖5B可知，貯藏0 d，各處理組蘋果可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所差異，調(diào)環(huán)酸鈣處理和其與硝酸鈣結(jié)合處理組的可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于其他處理組，表明調(diào)環(huán)酸鈣在一定程度可提高富士蘋果可溶性固形物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單獨(dú)硝酸鈣處理對(duì)可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響不大。經(jīng)過15 d貯藏，各處理組果實(shí)可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，但各處理組之間沒有顯著性差異（P＞0.05），表明呼吸作用加速了糖類物質(zhì)的消耗，導(dǎo)致可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降。

3 討 論

鈣離子作為一種必需營(yíng)養(yǎng)素，在調(diào)節(jié)植物的生理功能方面起著重要的作用，本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)環(huán)酸鈣結(jié)合硝酸鈣處理可以顯著降低蘋果苦痘病的發(fā)病率和患病指數(shù)，效果好于單一硝酸鈣處理。并且，調(diào)環(huán)酸鈣結(jié)合硝酸鈣處理對(duì)于提高蘋果外皮層總鈣含量的效果更好。研究表明采后鈣離子處理可以提高果實(shí)中的鈣含量，降低苦痘病的發(fā)生率，鈣離子向細(xì)胞內(nèi)的滲透是鈣含量增加的直接原因[20-21]。但是，即使細(xì)胞內(nèi)有充足的鈣，仍有可能發(fā)生鈣缺乏癥，鈣離子在細(xì)胞內(nèi)的分配和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鈣處理后，蘋果生理活性鈣（水溶性鈣和果膠鈣）含量明顯增加，尤其是調(diào)環(huán)酸鈣結(jié)合硝酸鈣處理組生理活性鈣含量增加最為明顯，這與其他學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)鈣離子可以增加果實(shí)內(nèi)水溶性鈣含量、降低鈣缺乏癥的發(fā)生[3,22]的結(jié)果是一致的。并且，調(diào)環(huán)酸鈣結(jié)合硝酸鈣處理降低了外皮層中磷酸鈣含量，維持了較高的草酸鈣含量。磷酸鈣和草酸鈣作為非生理活性鈣，起到維持鈣庫(kù)穩(wěn)定、解除毒害的作用，結(jié)合處理組中較低的磷酸鈣含量表明調(diào)環(huán)酸鈣和硝酸鈣結(jié)合處理可以維持鈣庫(kù)穩(wěn)定，而較高的含量草酸鈣具有解毒作用。草酸鈣含量與果實(shí)內(nèi)的有機(jī)酸密切相關(guān)，蘋果中含有較多的有機(jī)酸，會(huì)溶解細(xì)胞壁的中膠層，促使細(xì)胞裂解死亡，而鈣離子會(huì)和有機(jī)酸結(jié)合形成不溶性的鈣鹽沉淀，從而防止有機(jī)酸含量過高對(duì)細(xì)胞的損害，這可能是結(jié)合處理組中苦痘病發(fā)生率較低的原因之一[3]，但不同種類果實(shí)鈣處理的效果不同，王永博等[23]發(fā)現(xiàn)用硝酸鈣處理梨果實(shí)能夠增加果皮中草酸鈣含量，對(duì)磷酸鈣含量并沒有顯著性影響。

此外，鈣離子的分配和轉(zhuǎn)移涉及Ca-ATPases、Ca2+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)體、Ca2+通道等的作用[24-25]，研究發(fā)現(xiàn)GA處理可以延長(zhǎng)果蔬的貯藏期[26-27]，但GA誘導(dǎo)了較高的Ca-ATPases基因表達(dá)和活力，影響鈣的分配和轉(zhuǎn)移，增加了臍腐病的發(fā)生率[13,28]，而調(diào)環(huán)酸鈣作為GA的抑制劑，降低了番茄臍腐病的發(fā)生率，主要原因是增加了鈣離子的吸收和水溶性鈣的含量，降低了Ca-ATPases基因表達(dá)，減少了質(zhì)膜損傷[13]。雖然，研究表明采前葉面噴施調(diào)環(huán)酸鈣對(duì)降低苦痘病的發(fā)生率有一定效果[29]，但本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)單一調(diào)環(huán)酸鈣預(yù)防富士蘋果采后苦痘病的效果并不理想，對(duì)于調(diào)環(huán)酸鈣抑制蘋果苦痘病的機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。

研究表明，果蔬采后鈣離子處理可以維持細(xì)胞膨壓，保護(hù)膜的完整性，降低膜質(zhì)的氧化代謝，從而延長(zhǎng)果蔬的貯藏壽命[21,30]。汪良駒等[14]研究表明苦痘病蘋果果實(shí)的MDA含量比正常的高2 倍左右，患苦痘病蘋果果實(shí)細(xì)胞膜脂氧化程度明顯高于健康果實(shí)。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照和其他處理相比，調(diào)環(huán)酸鈣協(xié)同硝酸鈣處理可以顯著提高果實(shí)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力，降低MDA含量，維持較高的POD和SOD活力。但是，抗氧化體系與細(xì)胞內(nèi)鈣含量之間的關(guān)系仍不確定，Saure[31]認(rèn)為番茄臍腐病的發(fā)病不是因?yàn)槿扁}，而是氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的結(jié)果。調(diào)環(huán)酸鈣結(jié)合硝酸鈣處理能夠有效降低蘋果外皮層中的MDA含量，提高果實(shí)的抗氧化活性，說(shuō)明了其有利于維持細(xì)胞功能的穩(wěn)定，保證鈣離子的有效性，從而降低苦痘病的發(fā)生。

從果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)來(lái)看，調(diào)環(huán)酸鈣結(jié)合硝酸鈣處理可以維持果實(shí)較高的硬度，但單獨(dú)調(diào)環(huán)酸鈣處理對(duì)硬度影響不大，這可能與鈣離子的濃度有關(guān)。調(diào)環(huán)酸鈣是否可以調(diào)節(jié)果實(shí)內(nèi)可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)還需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

采后調(diào)環(huán)酸鈣結(jié)合硝酸鈣處理可以顯著降低蘋果果實(shí)貯藏期間苦痘病的發(fā)病率和患病指數(shù)，提高果實(shí)內(nèi)總鈣和生理活性鈣的含量，效果好于單一的硝酸鈣處理。并且，調(diào)環(huán)酸鈣結(jié)合硝酸鈣處理可以維持果實(shí)較高的POD和SOD活力，提高果實(shí)對(duì)氧化應(yīng)激損傷的防護(hù)能力，進(jìn)而降低細(xì)胞膜的脂質(zhì)氧化程度，維持細(xì)胞膜的完整性。