明膠-殼聚糖抗菌膜中啤酒花提取物的釋放行為

陳 婷，趙九陽，劉玉梅*

（新疆大學化學化工學院，煤炭清潔轉化與化工過程自治區(qū)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830046）

環(huán)境惡化是人類生存面臨最嚴峻的挑戰(zhàn)，塑料包裝生物降解性差，在環(huán)境中會產生大量塑料廢物。與其相比，利用可再生資源制備的生物聚合物，具有天然無毒、可再生和可生物降解性等優(yōu)點[1-2]?？墒秤帽∧な抢锰烊粊碓吹臒o毒原料制備的一類包裝材料，這類材料通常不含有生物有害成分，且容易降解；它不僅有助于解決環(huán)境問題，還可通過添加天然抗菌成分，在防止水分流失的同時，起到阻止和延緩氧化酸敗和微生物腐敗的效果，在延長食品保質期方面發(fā)揮重要作用[3]。因此，對于生物聚合物可食用薄膜的需求日益增長[4]。

目前，基于不同生物聚合物原料所制成的薄膜主要分為蛋白質膜、多糖膜、脂質膜及其復合膜[5]。明膠是膠原蛋白部分水解的產物，具有無毒性、生物降解性、生物相容性和低成本的獨特優(yōu)點[6-7]，但其阻水性能和力學性能較差，幾乎沒有任何抗菌活性，這是明膠基薄膜用于食品包裝的主要缺點[8]。為了克服這些限制，將明膠與其他生物材料復合，并添加適宜的抗菌劑，可以明顯改善薄膜的功能。殼聚糖是甲殼素脫N-乙酰基的產物，具有生物降解性、生物相容性、抗菌和抗氧化活性，無毒性、成膜能力佳[9-10]，且與明膠具有良好的生物混溶性。已有研究報道將其與明膠混合制備的復合膜可明顯改善單一薄膜的功能缺陷[11-13]。啤酒花是啤酒釀造的重要原料，其主要作用之一是為啤酒提供防腐抗菌功能。啤酒花浸膏是采用超臨界CO2萃取得到的啤酒花提取物，主要由α-酸和β-酸組成。許多研究表明啤酒花α-酸、β-酸和啤酒花浸膏具有很強的抗菌活性，且其主要成分α-酸、β-酸的抗菌活性存在一定的差異[14-17]。

前期研究表明，以啤酒花浸膏、α-酸或β-酸為抗菌劑制備的明膠-殼聚糖可食性薄膜用于包裝草莓等水果可明顯延長保鮮期，而抗菌薄膜中抗菌劑的釋放則與薄膜的防腐保鮮效果有著密切關系[18]?？咕鷦┯砂b介質擴散到食品中并最終達到平衡，從而發(fā)揮抗菌作用[19-20]。食品基質的特性會影響抗菌劑的釋放速率和釋放量，進而影響包裝材料對食品的保鮮效果；同時環(huán)境溫度、光照、輻射、氧氣等因素也會對抗菌膜的穩(wěn)定性產生一定影響[21]。已有不少研究關注薄膜中活性成分的釋放行為。Benbetta?eb等[22]將阿魏酸和酪醇加入到明膠-殼聚糖薄膜中，研究其在水性食品模擬液中的釋放行為；Rezaee等[23]將沒食子酸加入到明膠-殼聚糖薄膜中，研究其在食品脂肪模擬液中的釋放速率。因此，以食品模擬體系來研究包裝材料中抑菌劑的釋放行為對預測包裝材料對不同食品體系的抗菌效果非常重要。

本研究在前期工作基礎上，制備了含有啤酒花浸膏、α-酸或β-酸的明膠-殼聚糖可食性抗菌包裝膜，通過比較啤酒花浸膏、α-酸和β-酸在食品模擬液中的釋放行為，并以Peleg方程進行擬合，確定抗菌劑的釋放規(guī)律，以期為其進一步的開發(fā)應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（脫乙酰度＞90%） 上海藍季科技發(fā)展有限公司；明膠 天津致遠化學試劑有限公司；啤酒花浸膏（含質量分數52.5%的α-酸、質量分數19.3%的β-酸） 新疆三寶樂農業(yè)科技有限公司；α-酸、β-酸（純度≥95%）為實驗室自制，從啤酒花浸膏中分離得到[24]；甘油（純度≥98.0%） 西安化學試劑廠；乙酸、無水乙醇等均為分析純。

1.2 儀器與設備

DF-Ⅱ型集熱式磁力加熱攪拌器 金壇市醫(yī)療儀器廠；FAH04N型電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；DPH-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京市永光明儀器儀器廠；KQ5200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV-5300PC型紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；Vertex 70傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）儀 德國Bruker公司；1430VP掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 德國里奧電鏡有限公司。

1.3 方法

1.3.1 明膠-殼聚糖可食性抗菌膜的制備

稱取2 g明膠溶解于50 mL水中，于60 ℃下攪拌30 min至完全溶解，再攪拌加入0.4 g甘油，30 ℃繼續(xù)攪拌1 h，制得質量濃度4 g/100 mL的明膠膜液。將1 g殼聚糖溶解于50 mL體積分數2%的乙酸溶液中，70 ℃下攪拌至完全溶解，再攪拌加入1.0 g甘油，30 ℃繼續(xù)攪拌1 h，制得質量濃度2 g/100 mL的殼聚糖膜液。將殼聚糖膜液與明膠膜液按質量比1∶1混合，30 ℃下攪拌1 h得到明膠-殼聚糖成膜液。結合預實驗結果，確定在上述成膜液中分別加入質量濃度為0.15 g/100 mL啤酒花浸膏、0.15 g/100 mLα-酸或0.20 g/100 mLβ-酸，30 ℃下攪拌1 h后靜置24 h，超聲脫氣2 h，將成膜液用流延法鋪在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，37 ℃下干燥20 h，得到明膠-殼聚糖抗菌膜，并以不含抗菌劑的明膠-殼聚糖薄膜為對照膜[25-26]。

1.3.2 明膠-殼聚糖可食性抗菌膜的FT-IR分析

使用FT-IR儀分析薄膜紅外光譜圖。分辨率4 cm-1，掃描范圍4 000～500 cm-1。

1.3.3 明膠-殼聚糖可食性抗菌膜的微觀結構觀察

將薄膜粘貼于金屬圓臺上，真空狀態(tài)下噴金，采用SEM觀察薄膜表面微觀結構。

1.3.4 抗菌劑標準曲線繪制

分別準確稱取10 mg啤酒花浸膏、α-酸或β-酸，用無水乙醇溶解并定容至100 mL，得抗菌劑標準溶液。分別移取抗菌劑標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，由于啤酒花浸膏中同時含有α-酸和β-酸，且α-酸含量明顯高于β-酸，為方便計算，啤酒花浸膏和α-酸均選取α-酸的最大吸收波長329 nm處測定吸光度，β-酸則在其最大吸收波長352 nm處測定吸光度。以吸光度（y）對抗菌劑溶液質量濃度（x，μg/mL）進行擬合，得到在0～10 μg/mL線性范圍內：啤酒花浸膏線性方程為y＝0.036 8x+0.004 6，R2＝0.999 3；α-酸線性方程為y＝0.023 0x+0.005 0，R2＝0.999 1；β-酸線性方程為y＝0.040 1x+0.004 9，R2＝0.999 0。

1.3.5 釋放實驗

根據GB/T 31604.1ü2015《食品安全國家標準 食品接觸材料及制品遷移試驗通則》中規(guī)定，選用體積分數10%的乙醇溶液為水性食品模擬液，體積分數50%的乙醇溶液為含乙醇類食品模擬液，體積分數95%的乙醇溶液為高脂肪類食品模擬液[27]完成釋放實驗。

裁取1 cmh2 cm（約10 mg）的抗菌膜片樣品置于100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL食品模擬液中，分別置于4、25、30 ℃恒溫環(huán)境下，間隔一定時間，準確移取1 mL釋放液分別于其最大吸收波長處測定吸光度，以相應模擬液為參比，依據1.3.4節(jié)中所得線性方程計算食品模擬液中各抗菌劑的質量濃度。按式（1）計算抗菌劑釋放量。

式中：ρ為t時刻食品模擬液中抗菌劑質量濃度/（μg/mL）；V為食品模擬液體積/mL；m為膜片質量/g。

1.3.6 釋放模型的建立

Peleg模型（式（2））主要用于根據實驗數據預測釋放動力學。

式中：MF,t為t時刻時抗菌劑釋放量/（mg/g）；t為釋放時間/min；k1是模型的動力學常數，與釋放過程開始時的質量轉移率成反比關系；k2為1/MF,e（MF,e為釋放平衡時的抗菌劑釋放量），是與漸近值有關的模型常數[28-29]。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

以Origin 8.6軟件進行釋放實驗的數據處理并作圖。所有實驗平行測定3 次，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 明膠-殼聚糖可食性抗菌膜的FT-IR分析結果

圖 1 明膠-殼聚糖可食性抗菌膜的FT-IR圖Fig. 1 Fourier transform infrared spectroscopy spectra of gelatinchitosan composite edible film

如圖1所示，明膠-殼聚糖對照薄膜的FT-IR光譜中，3 297 cm-1處的特征峰歸屬于游離水的O-H和酰胺A的N-H伸縮振動；2 941 cm-1處的特征峰為酰胺B的C-H不對稱伸縮振動；1 650 cm-1處的特征峰為C＝O伸展以及酰胺I的N-H基團彎曲振動；1 557 cm-1處的特征峰為酰胺II，是由N-H基團的彎曲振動和C-N基團的伸縮振動引起的；1 259 cm-1處的特征峰為酰胺III，是由C-N和N-H基團的平面振動和明膠中甘氨酸的-CH2基團振動引起的[30-31]。在1 039 cm-1處的特征峰是增塑劑（甘油的羥基基團）和聚合物結構（多糖）之間所形成氫鍵的相互作用[32]。而當明膠-殼聚糖膜中加入抗菌劑后，其酰胺A吸收帶均有所增強且增寬，表明抗菌劑中也有N-H伸縮振動。添加抗菌劑后，酰胺I、II、III帶均向低波數方向移動，表明3 種抗菌劑均和明膠-殼聚糖膜發(fā)生分子間相互作用。以上結果表明，抗菌劑成功地加入到明膠-殼聚糖可食性薄膜中。

2.2 明膠-殼聚糖可食性抗菌膜的微觀結構

圖 2 明膠-殼聚糖可食性抗菌膜表面的SEM圖（10 000×）Fig. 2 Scanning electron microscope graphs of gelatin-chitosan edible films (10 000 ×)

可食性薄膜的微觀結構反映了其均一性和致密性。由圖2A可知，明膠-殼聚糖對照膜的表面盡管有一些細小的顆粒，但仍然可以觀察到連續(xù)光滑的平面，這表明明膠與殼聚糖之間具有良好的相容性。由圖2B～D可知，在明膠-殼聚糖可食性薄膜中加入3 種不同抗菌劑后，其對薄膜表面結構的影響不盡相同。其中，添加啤酒花浸膏的明膠-殼聚糖薄膜表面明顯粗糙且出現一些紋路，這可能與啤酒花浸膏的疏水性有關，但相對而言，薄膜表面結構仍然較均一；而添加了α-酸的薄膜表面可觀察到細小顆粒明顯增多，這可能是由于α-酸并不能與明膠-殼聚糖形成均相體系，而是分散在膜中，這在添加疏水性更強的β-酸的明膠-殼聚糖薄膜中表現更為明顯，該薄膜表面β-酸的棒狀晶體清晰可見，說明疏水性強的添加劑不易于薄膜基材形成網絡緊密的結構。Ramziia等[33]將原花青素添加到明膠-殼聚糖薄膜中也出現類似的結果。

2.3 抗菌劑在食品模擬液中的釋放行為

抗菌劑從薄膜中釋放的主要影響因素包括薄膜基材溶脹性、抗菌劑因極性和溶解度等，這些因素的差異導致抗菌劑在食品模擬液中的擴散不同。

圖 3 啤酒花浸膏在不同食品模擬液中的釋放曲線Fig. 3 Release curves of hop extract in different food simulants

如圖3所示，啤酒花浸膏在不同食品模擬液中的釋放速率均較快，釋放初期呈快速上升趨勢，釋放達到平衡后趨于平緩。釋放時間相同時，環(huán)境溫度越高，釋放量越大。

在相同食品模擬液中，隨著釋放環(huán)境溫度的升高，釋放量總體呈逐漸增大的趨勢，在高脂肪類食品模擬體系（體積分數95%的乙醇溶液）中更為明顯。另外，釋放環(huán)境溫度越高，啤酒花浸膏達到釋放平衡的時間越快。這是因為釋放環(huán)境溫度升高，分子熱運動加劇，自由體積變大[34]，使啤酒花浸膏在食品模擬液中的溶解度增大。這一結果與六氫β-酸在不同釋放環(huán)境溫度下和不同食品模擬液中的釋放行為類似[35]。因此，在環(huán)境溫度低于25 ℃時，溫度是影響活性物質擴散的主要因素；但在接近室溫（25 ℃或30 ℃）條件時，溫度的影響程度差異不明顯。

在相同釋放溫度下，啤酒花浸膏在體積分數95%乙醇溶液中的釋放量最大，釋放速率也最快，其次是體積分數50%的乙醇溶液，啤酒花浸膏在體積分數10%的乙醇溶液中釋放量最小，釋放速率最慢。這主要是由于啤酒花浸膏是疏水性的，食品模擬液中的水分體積分數越高其溶解度越低。因此，食品的水分含量也是影響活性物質釋放的重要因素。

圖 4 α-酸在不同食品模擬液中的釋放曲線Fig. 4 Release curves of α-acid in different food simulants

圖 5 β-酸在不同食品模擬液中的釋放曲線Fig. 5 Release curves of β-acid in different food simulants

α-酸和β-酸在食品模擬液中的釋放行為如圖4、5所示。相較啤酒花浸膏，α-酸在體積分數10%乙醇溶液模擬液中的釋放行為與其類似，在低溫（4 ℃）時釋放量較小，隨著環(huán)境溫度的升高，釋放量及速率增大；β-酸在體積分數10%乙醇溶液模擬液中的釋放量也較小，并很快達到釋放平衡，其釋放量隨環(huán)境溫度的升高并未發(fā)生明顯變化。這是由于體積分數10%的乙醇溶液體系極性較大，β-酸疏水性極強，在水分含量高的體系中溫度的變化對其溶解度影響很小。在體積分數50%和95%的乙醇溶液模擬液中，β-酸的釋放行為和α-酸極為相似，二者的釋放速率和達到釋放平衡的時間均較為接近。β-酸達到平衡時的釋放量是3 種抗菌劑中最大的，這與其添加量略高于其余2 種抗菌劑有關。此外，啤酒花浸膏的主要成分為α-酸和β-酸，本實驗中啤酒花浸膏中α-酸質量分數為52.5%，且啤酒花浸膏和α-酸測定時選擇的波長一致，因此，實際測得的啤酒花浸膏釋放量會小很多。另外，SEM觀察結果也表明，啤酒花浸膏與薄膜基材形成了相對均一緊密的結構，這也會使其釋放量較小；而α-酸和β-酸因其疏水性，在膜中分散不均勻，使薄膜結構疏松，因此在食品模擬液中更易釋放，β-酸這一現象尤為突出。但前期研究結果表明，盡管啤酒花浸膏的釋放量較低，但其總體抗菌活性并不低，說明啤酒花浸膏中的α-酸和β-酸之間存在一定的協同抑菌活性[18]。

2.4 釋放行為模型的建立

Peleg模型可以預測當時間趨于無窮大時的平衡值，因此，該模型可以預測在持續(xù)時間相對較短的測試中獲得的長期值[36]。本實驗通過Peleg模型對數據進行處理，以t/MF,t對釋放時間（t）進行擬合，所得曲線如圖6～8所示，方程及相關參數見表1。

圖 6 啤酒花浸膏在不同食品模擬液中釋放機制的Peleg模型Fig. 6 Peleg model for release mechanism of hop extract in different food stimulants

圖 7 α-酸在不同食品模擬液中釋放機制的Peleg模型Fig. 7 Peleg model for release mechanism of α-acid in different food stimulants

圖 8 β-酸在不同食品模擬液中釋放機制的Peleg模型Fig. 8 Peleg model for release mechanism of β-acid in different food simulants

表 1 不同溫度下抗菌劑在不同食品模擬液中的Peleg模型相關參數Table 1 Parameters of Peleg model for release of antimicrobial agents in different food simulants at different temperatures

Peleg模型參數中，k1與抗菌劑釋放過程中初始速率的倒數相關，而k2是釋放平衡時抗菌劑釋放量的倒數（1/MF,e），其反映了抗菌劑在平衡態(tài)下的釋放總量。當t＜t臨界值時，使用Peleg模型計算的最大釋放量與實驗數據無明顯差異。由表1可知，各方程相關系數（R2）均大于0.98，說明啤酒花浸膏、α-酸或β-酸在4、25、30 ℃環(huán)境溫度下在3 種食品模擬液中的釋放行為均與Peleg模型擬合較好。這一結果與多酚在海藻酸鈉-殼聚糖可食性薄膜中的釋放行為類似[37]。

由表1可知，食品模擬液水分體積分數影響抗菌劑的釋放，食品模擬液水分體積分數越大，k1值越大，釋放初始速率越慢。在不同食品模擬液中，Peleg模型k1值的總體趨勢為體積分數10%乙醇溶液＞體積分數50%乙醇溶液＞體積分數95%乙醇溶液，這與抗菌劑在乙醇溶液中的溶解度有關。Han Yingying等[38]的研究表明，食品模擬液中水分體積分數的變化對抗菌劑的釋放具有較大影響。釋放環(huán)境溫度也影響抗菌劑的釋放，在不同釋放環(huán)境溫度中，Peleg模型k1值的總體趨勢為4 ℃＞25 ℃＞30 ℃，表明釋放環(huán)境溫度越高，釋放速率越快，這是由于溫度越高，分子熱運動越劇烈，抗菌劑越易溶解。同時，食品模擬液水分體積分數和釋放環(huán)境溫度也影響著達到平衡時的釋放量，食品模擬液中的水分體積分數越高，釋放環(huán)境溫度越低，達到平衡時的釋放量越小。當釋放條件相同時，3 種抗菌劑Peleg模型k1值的總體趨勢為啤酒花浸膏＞α-酸＞β-酸，表明啤酒花浸膏在食品模擬液中的釋放相對較慢。

3 結 論

本研究以啤酒花浸膏、α-酸或β-酸為抗菌劑，制備明膠-殼聚糖可食性抗菌薄膜，研究抗菌劑在不同環(huán)境溫度下不同食品模擬液中的釋放行為，驗證了明膠-殼聚糖可食性抗菌薄膜中啤酒花浸膏、α-酸或β-酸在食品模擬液中釋放機制Peleg模型的有效性。在不同食品模擬液中，食品模擬液水分體積分數越大，抗菌劑釋放越慢，且釋放平衡時釋放量越??；在不同釋放環(huán)境溫度下，溫度越高，抗菌劑釋放越快，且釋放平衡時釋放量越大。通過擬合Peleg模型發(fā)現，抗菌劑在4、25、30 ℃環(huán)境溫度下食品模擬液中的釋放行為均很好地符合Peleg模型。結果表明，該類可食性抗菌薄膜中的抑菌劑啤酒花浸膏、α-酸或β-酸在含酒精類食品和高脂食品中均能很好地釋放，滿足抑菌要求，而在水性食品體系中，僅添加β-酸可能不能滿足抑菌要求，這為該抗菌薄膜的開發(fā)應用提供了理論參考。