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    超巴氏殺菌對牛乳酪蛋白微觀結(jié)構(gòu)及凝聚性質(zhì)的影響

    2020-03-01 21:27:38張安琪王玉瑩周國衛(wèi)王喜波
    食品科學(xué) 2020年3期
    關(guān)鍵詞:電子顯微鏡巴氏牛乳

    張安琪,王玉瑩,李 瑞,周國衛(wèi),王 琳,王喜波*

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

    牛乳因含有許多人體生命活動所必需的營養(yǎng)成分而被廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域中[1-2]。熱處理雖然使乳中蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,但能抑制乳中微生物的生長。其中酪蛋白為全價蛋白質(zhì),約占牛乳總蛋白的80%[3],所以熱處理后酪蛋白結(jié)構(gòu)的變化對牛乳的熱穩(wěn)定性極為重要。目前常用的巴氏殺菌方法有兩種:低溫長時巴氏殺菌(如65 ℃、30 min)和高溫短時巴氏殺菌(如72 ℃、15 s)[4]。國內(nèi)外對經(jīng)巴氏殺菌處理的牛乳的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)研究較多,如孫佳悅等[5]曾用紅外光譜法探究巴氏殺菌處理對乳蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響;王喜波等[6]研究了巴氏殺菌處理對牛乳中乳清蛋白的影響;Donato等[7]研究了熱處理后牛乳中乳清蛋白與酪蛋白結(jié)合物的性質(zhì);Considine等[8]研究了熱處理后乳蛋白結(jié)構(gòu)的變化。

    超巴氏殺菌(120~125 ℃處理數(shù)秒)是近年來出現(xiàn)的一種熱處理方法[9]。國內(nèi)外學(xué)者對超巴氏殺菌處理牛乳的風(fēng)味和感官評價進行了研究[10-11],而對超巴氏殺菌處理后酪蛋白的結(jié)構(gòu)變化鮮有研究。所以,本實驗以牛乳為原料,通過納米粒度分析儀、掃描電子顯微鏡及透射電子顯微鏡分別對3 種巴氏殺菌處理酪蛋白的微觀結(jié)構(gòu)和凝聚性質(zhì)進行研究,探究超巴氏殺菌對酪蛋白結(jié)構(gòu)的影響,為生產(chǎn)營養(yǎng)價值高并且保質(zhì)期長的乳制品提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    牛乳 哈爾濱本地奶站;IPG緩沖液pH3-10美國通用公司;乙醇 天津市博迪化工有限公司;其他化學(xué)試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Mastersizer 2000激光粒度儀 英國馬爾文儀器公司;S-3400掃描電子顯微鏡、JEM-1200EX透射電子顯微鏡日本日立公司;PE Pyris 6差示掃描量熱(differential scanning calorimetry,DSC)儀 美國PerkinElmer公司;ALPHA-1-4-LSC冷凍干燥機 德國Christ公司。

    1.3 方法

    1.3.1 脫脂乳的制備及熱處理

    將新鮮牛乳在4 ℃條件下4 000 r/min離心30 min,取出后棄去上層脂肪即得到脫脂乳。對照組為未經(jīng)過熱處理的脫脂乳,將脫脂乳進行3 種巴氏殺菌處理,即65 ℃ 30 min、72 ℃ 15 s、121 ℃ 5 s(超巴氏殺菌),前兩種熱處理方法使用水浴鍋處理,當(dāng)牛乳的中心溫度達到實驗所需溫度后開始計時,超巴氏殺菌方法使用高壓鍋加熱,加熱結(jié)束后將脫脂乳迅速于冷水中冷卻至室溫。將殺菌結(jié)束后的脫脂乳于4 ℃避光保存。

    1.3.2 酪蛋白的提取

    采用等電點沉淀法[12]提取酪蛋白,用1 mol/L HCl溶液將脫脂乳的pH值調(diào)至4.6,然后在4 ℃、12 000 r/min離心15 min,下層沉淀即為酪蛋白,取7 g酪蛋白于燒杯中,加入去離子水?dāng)嚢柚镣耆芙猓瑢H值調(diào)至8.0后定容到200 mL,于-20 ℃保存。

    1.3.3 粒徑的測定

    粒徑采用Mastersizer 2000型激光粒度儀進行測定[13]。取40 mL酪蛋白溶液,加入到500 mL去離子水中,待攪拌裝置攪拌均勻后開始測定。泵的速率為1 800 r/min,顆粒折射率為1.460,分散劑折射率為1.330,顆粒吸收率為0.1。

    1.3.4 透射電子顯微鏡測定酪蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)

    采用JEM-1200EX型透射電子顯微鏡測定熱處理后酪蛋白溶液的內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)。用去離子水將酪蛋白樣品稀釋10 倍,劇烈振蕩15 min,取200 μL稀釋后的酪蛋白溶液于透射電子顯微鏡專用銅網(wǎng)上,保持15 min,然后采用體積分?jǐn)?shù)3%的鈾染液漂浮負(fù)染色90 s,最后在無菌恒溫條件下干燥20 min,然后在80 kV電壓下進行觀察[14]。

    1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察酪蛋白表面結(jié)構(gòu)

    參照Phadungath[15]和Dalgleish[16]等的方法,采用掃描電子顯微鏡測定酪蛋白表面結(jié)構(gòu),并依據(jù)樣品處理的需要進行調(diào)整,將不同熱處理的酪蛋白溶液用凍干機凍成粉末,在掃描之前必須經(jīng)過固定、脫水、導(dǎo)電3 個過程的前處理。固定液通常為含有戊二醛的磷酸鹽緩沖液,選用乙醇梯度脫水法進行脫水處理,用離子噴射器在酪蛋白粉表面噴厚度15 nm的金箔,加速電壓為5 kV。

    1.3.6 DSC曲線的測定

    將酪蛋白溶液置于鋁盒中,密封后在樣品箱中存放,于室溫下平衡8 h,空鋁盒為空白對照,從20 ℃加熱到110 ℃,升溫速率為10 ℃/min,得到DSC曲線[17]。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 熱處理對酪蛋白粒徑分布的影響

    圖 1 不同熱處理條件下酪蛋白粒徑分布Fig. 1 Particle size distribution of casein under different heat treatment conditions

    如圖1所示,對照組、65 ℃ 30 min和72 ℃ 15 s處理后酪蛋白膠束的粒徑分布區(qū)間主要為1~100 μm,兩種常用巴氏殺菌處理后,其粒徑無明顯變化,因為酪蛋白在70 ℃以下較穩(wěn)定。121 ℃ 5 s處理后酪蛋白膠束的粒徑區(qū)間向右移動,粒徑明顯增加,可能是因為自身發(fā)生離解和凝聚,使得粒徑增大[18],也可能是在超巴氏殺菌處理時乳清蛋白變性黏附在酪蛋白表面使粒徑增加[19]。

    圖 2 不同熱處理條件下酪蛋白平均粒徑Fig. 2 Average particle sizes of casein under different heat treatment conditions

    由于酪蛋白膠束的粒徑分布區(qū)間廣泛,而熱處理后變化區(qū)間范圍也較大,所以借助平均粒徑來說明不同熱處理方式對酪蛋白膠束粒子大小變化的影響。不同熱處理條件下酪蛋白的平均粒徑如圖2所示,對照組酪蛋白平均粒徑為7.27 μm,與對照組相比,65 ℃ 30 min處理的樣品平均粒徑(6.19 μm)略有減小,但差異不顯著(P>0.05),這是因為酪蛋白膠束表面的κ-酪蛋白單體發(fā)生解離[20];72 ℃ 15 s處理的樣品平均粒徑(8.91 μm)略有增加(P>0.05),是因為隨著溫度的升高,酪蛋白自身凝聚程度大于解離程度,所以粒徑逐漸增加[20];而121 ℃ 5 s處理的樣品平均粒徑(88.98 μm)顯著增加(P<0.05),是由于溫度過高時,除了酪蛋白的自身凝聚,其疏水相互作用也會增強,酪蛋白由膠束態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂瘧B(tài)[20]。Anema等[21]研究也表明,當(dāng)熱處理溫度不大于70 ℃時,酪蛋白膠束的平均粒徑小于未經(jīng)過熱處理的樣品;當(dāng)熱處理溫度大于70 ℃時,酪蛋白膠束的粒徑隨著熱處理溫度的提高而緩慢增加,但是增加得并不明顯;只有熱處理溫度大于90 ℃時,酪蛋白膠束的粒徑才會顯著提高。由圖2可看出,實驗中未經(jīng)過熱處理的酪蛋白平均粒徑為7.27 μm,比文獻[22-23]中粒徑(50~350 nm)小,可能是因為使用的粒度儀的型號不同,還可能是酪蛋白膠束的粒徑與pH值有密切關(guān)系[24],提取酪蛋白時選用的pH值條件不同,所以粒徑不同。

    2.2 熱處理對酪蛋白凝聚性質(zhì)的影響

    圖 3 不同熱處理條件下酪蛋白的透射電子顯微鏡圖Fig. 3 Transmission electron microscopic images of casein under different heat treatment conditions

    本實驗中,酪蛋白溶液的pH值為8.0,常溫透射電子顯微鏡放大10 000 倍,可以觀察到納米級的結(jié)構(gòu)。未經(jīng)過熱處理的酪蛋白膠束的體積較?。▓D3A),是因為未經(jīng)過熱處理的牛乳提取酪蛋白后幾乎不含乳清蛋白[25]。65 ℃ 30 min處理的樣品結(jié)構(gòu)更為松散(圖3B),可能是酪蛋白表面的單體還在離解。72 ℃15 s處理后的樣品,溶液中的酪蛋白相互締結(jié)、疊加在一起,凝聚成圓形或橢圓形的膠束,形成一個巨大的網(wǎng)絡(luò)(圖3C)。121 ℃ 5 s處理的樣品,圓形微粒展開,與其他展開的膠束融合、疊加在一起,形成更巨大的聚合物,并且內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加緊密厚實(圖3D),可能是酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)被破壞,也可能是因為加熱溫度的升高,促進乳清蛋白與酪蛋白的絡(luò)合,從而引起粒子體積的增大[26],導(dǎo)致牛乳在貯藏過程中容易形成沉淀,降低其穩(wěn)定性降低,縮短保質(zhì)期。

    2.3 熱處理對酪蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

    圖 4 不同熱處理條件下酪蛋白的掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 Scanning electron microscopic images of casein under different heat treatment conditions

    如圖4所示,與對照組相比,65 ℃ 30 min處理的樣品表現(xiàn)出更不規(guī)則、更無序的碎片結(jié)構(gòu),這可能是因為低溫長時間的熱處理會使酪蛋白膠束發(fā)生解離,并且隨著加熱時間的延長,解離程度會越來越大,部分酪蛋白的解離會使蛋白變得更加細(xì)碎,大小不一[27]。而72 ℃ 15 s處理的樣品則更加均勻規(guī)則,這說明隨著溫度的升高,維持酪蛋白膠束的次級鍵受到破壞,使酪蛋白表面的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,同時,酪蛋白膠束與膠束之間也進一步黏附,形成更大更均一的狀態(tài)[28]。121 ℃ 5 s處理的樣品,酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)被破壞,形成較多小顆粒的酪蛋白,并出現(xiàn)更大程度的凝聚狀態(tài),這是因為隨著加熱溫度的升高,乳蛋白與κ-酪蛋白之間的結(jié)合增強,從而形成更巨大的蛋白分子[29]。根據(jù)酪蛋白掃描電子顯微鏡圖可知,所有組別中,65 ℃ 30 min處理的酪蛋白平均直徑最小,而121 ℃ 5 s處理的酪蛋白平均直徑最大,結(jié)果與粒徑實驗結(jié)果相一致。熱處理后酪蛋白微觀結(jié)構(gòu)的改變意味著牛乳的理化性質(zhì)發(fā)生改變,即會對牛乳的營養(yǎng)價值、風(fēng)味及貯藏穩(wěn)定性等產(chǎn)生一系列的影響。

    2.4 熱處理對酪蛋白熱力學(xué)性質(zhì)的影響

    圖 5 不同熱處理條件下酪蛋白DSC圖Fig. 5 DSC analysis of casein under different heat treatment conditions

    由圖5可知,被測蛋白質(zhì)的變性溫度越高,說明其蛋白結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定;熱焓(吸熱峰面積)越大,說明樣品蛋白質(zhì)的變性程度越低[30]。4 個樣品均表現(xiàn)為不同的變性溫度和變性焓,可能是因為熱處理對酪蛋白各個單體及酪蛋白與乳清蛋白結(jié)合物的影響不同,從而導(dǎo)致整個酪蛋白體系的熱穩(wěn)定性不同。

    表 1 DSC圖譜峰的綜合分析Table 1 Comprehensive analysis of peaks in DSC spectra

    由表1可以看出,與對照組相比,3 組巴氏殺菌處理的熱變性溫度均升高。其中,72 ℃ 15 s處理的酪蛋白變性溫度最高,這可能是因為熱處理使蛋白質(zhì)不斷解離,轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼰o序的狀態(tài),該狀態(tài)對熱較為穩(wěn)定,當(dāng)超巴氏殺菌處理時,由于加熱溫度的升高,酪蛋白膠束與解離的酪蛋白單體之間又凝聚在了一起[31]。熱焓(ΔH)表示蛋白質(zhì)的變性程度,65 ℃ 30 min處理的樣品吸收峰面積比對照組小,說明熱變性程度更高;該組變性溫度(90.6 ℃)高于對照組和超巴氏殺菌組,說明穩(wěn)定性更高。72 ℃ 15 s處理的樣品與其他3 組相比熱焓最低,表明72 ℃ 15 s處理的酪蛋白變性程度最大,變性溫度(99 ℃)最高,說明穩(wěn)定性最高,是因為70 ℃以上熱處理時乳清蛋白會變性,從而與κ-酪蛋白形成復(fù)雜的配合物[32]。以上說明,巴氏殺菌(65 ℃ 30 min、72 ℃ 15 s)處理會提高酪蛋白的穩(wěn)定性;而121 ℃ 5 s處理的酪蛋白變性程度比巴氏殺菌處理的低,可能是因為之前離解的酪蛋白膠束又凝聚交聯(lián)在一起[33]。

    3 結(jié) 論

    本實驗以新鮮牛乳為原料,探究超巴氏殺菌處理后酪蛋白微觀結(jié)構(gòu)及凝聚性質(zhì)的變化,同時以未經(jīng)過熱處理及常用的兩種巴氏殺菌處理后的酪蛋白樣品進行比較,采用電子顯微鏡和熱力學(xué)等方法對3 種巴氏殺菌法處理酪蛋白進行分析。結(jié)果表明,超巴氏殺菌方法處理的酪蛋白,其膠束結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,使其發(fā)生大面積的凝聚、交聯(lián),粒徑明顯增加。巴氏殺菌處理會增加牛乳酪蛋白的穩(wěn)定性,但超巴氏殺菌處理牛乳會破壞部分酪蛋白膠束原有的形態(tài),使其發(fā)生凝聚交聯(lián)。超巴氏殺菌方法處理后的酪蛋白熱穩(wěn)定性高于對照組,酪蛋白變性程度低于兩種常用的巴氏殺菌方法,且其熱處理時間短,可以提高生產(chǎn)效率。同時,熱處理后酪蛋白結(jié)構(gòu)更為無序,其穩(wěn)定性會提高,從而延長保質(zhì)期。

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