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    復(fù)合酶修飾對(duì)紅薯淀粉分支結(jié)構(gòu)和物化特性的影響

    2020-03-01 21:27:24鄧銀鳳朱晨晨杜先鋒
    食品科學(xué) 2020年3期
    關(guān)鍵詞:糖苷鍵鏈長(zhǎng)直鏈

    肖 瑀,郭 麗,鄧銀鳳,王 懿,朱晨晨,杜先鋒,*

    (1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院,安徽 合肥 230036;2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 濟(jì)南 250353)

    紅薯塊莖中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%~30%的淀粉[1],但是天然紅薯淀粉在應(yīng)用和加工上存在很多局限性:比如透明度差會(huì)直接影響到紅薯淀粉產(chǎn)品的外觀和可接受性;淀粉糊黏度過高不適合用于要求高濃度、低黏度的食品和化工行業(yè);此外還有因溶解性差等而難以控制的缺陷[2]。因此,為了改善天然紅薯淀粉的一些應(yīng)用缺陷,并進(jìn)一步擴(kuò)大其應(yīng)用范圍,通常采用物理、化學(xué)或酶法對(duì)其進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)修飾以提高加工性能,相較于物理和化學(xué)改性,酶法改性具有健康、綠色、環(huán)保且反應(yīng)產(chǎn)物專一、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[3]。紅薯淀粉中含直鏈淀粉(20%~30%,質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)和支鏈淀粉(70%~80%)。許多研究表明支鏈淀粉的分支鏈結(jié)構(gòu)對(duì)淀粉的物化特性具有至關(guān)重要的作用[4-8],例如支鏈淀粉的短支鏈比例與溶脹能力、糊化焓和淀粉消化程度成正比,而與糊化溫度和結(jié)晶度成反比。Guo Li等[9]發(fā)現(xiàn),具有更高支化度和更多短鏈的支鏈淀粉不易被淀粉酶水解。為有效地修飾紅薯淀粉的分支鏈結(jié)構(gòu),本研究首先將α-淀粉酶通過內(nèi)切淀粉的α-1,4-糖苷鍵水解成較多的線性鏈,然后結(jié)合β-淀粉酶,通過從淀粉非還原性末端依次外切α-1,4-糖苷鍵,部分縮短外鏈長(zhǎng)度,進(jìn)一步生成更多的線性短鏈,最后利用葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶將兩種水解酶酶解后生成的線性短鏈通過α-1,6-糖苷鍵轉(zhuǎn)糖基作用以生成新的分支點(diǎn)[10],增加分支密度。本實(shí)驗(yàn)以紅薯淀粉為原料,采用α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的復(fù)合處理調(diào)控紅薯淀粉分支鏈結(jié)構(gòu),獲得了不同分支密度和短鏈數(shù)的紅薯淀粉,從而使紅薯淀粉具備了不同物化性質(zhì),為開發(fā)具有一定親水性、透明度、黏度和凝膠強(qiáng)度的紅薯淀粉基產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    紅薯淀粉 四川友嘉食品有限公司;α-淀粉酶(酶活力50 U/mg)、β-淀粉酶(酶活力53 U/mg) 美國(guó)Sigma公司;葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶(酶活力25 000 U/mL)日本天野酶制劑有限公司;普魯蘭酶(酶活力400 U/mL)丹麥諾維信公司;異淀粉酶(酶活力240 U/mg) 愛爾蘭Megazyme公司;所用化學(xué)試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    ICS-5000分析型離子色譜系統(tǒng) 美國(guó)加州森尼維爾Dionex公司;NMI20-015V-I核磁共振成像分析儀 蘇州紐邁電子科技有限公司;D8 Discover A25 X射線衍射儀德國(guó)布魯克AXS公司;Nicolet IS50傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)賽默飛世爾公司;UV-5500紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;DHR-1旋轉(zhuǎn)流變儀上海沃特世科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 復(fù)合酶改性紅薯淀粉的制備

    將10 g紅薯淀粉樣品與200 mL(pH 6.9、0.02 mol/L)乙酸鈉緩沖溶液在沸水浴中持續(xù)攪拌30 min。取出冷卻至50 ℃,加入80 mgα-淀粉酶后,于50 ℃條件下水浴振蕩8 h(100 r/min),然后沸水浴15 min終止反應(yīng)。待樣液溫度冷卻至37 ℃,使用0.02 mol/L乙酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值至5.2,加入10.6 mgβ-淀粉酶后,于37 ℃條件下水浴振蕩6 h(100 r/min),然后沸水浴15 min終止反應(yīng)。將樣液溫度升溫至55 ℃,使用0.02 mol/L乙酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0,分別加入不同添加量(50、100、150、200、250、300 μL)的葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶后置于55 ℃下水浴振蕩10 h,然后沸水浴15 min終止反應(yīng)。待樣液冷卻至室溫,使用乙醇沉淀處理,3 000 r/min離心10 min,將沉淀冷凍干燥,即獲得復(fù)合酶修飾后的改性紅薯淀粉樣品(W1、W2、W3、W4、W5、W6,分別對(duì)應(yīng)不同添加量葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的樣品)。通過不添加酶的酶改性淀粉制備流程獲得對(duì)照樣品。

    1.3.2 直鏈淀粉比例和鏈長(zhǎng)分布的測(cè)定

    采用碘比色法測(cè)定直鏈淀粉比例[11]。采用高效陰離子交換色譜(high performance anion-exchange chromatography equipped with pulsed amperometric detection,HPAEC-PAD)法測(cè)定淀粉的鏈長(zhǎng)分布[12]。將10 mg待測(cè)淀粉樣品溶于2 mL體積分?jǐn)?shù)90%的二甲基亞砜溶液,在沸水浴中持續(xù)攪拌20 min。待樣液冷卻至室溫后,加入6 mL無(wú)水乙醇,3 000 r/min離心15 min,取出沉淀,加入2 mL pH 4.0、50 mmol/L乙酸鈉緩沖溶液后,在沸水浴中持續(xù)攪拌20 min。然后使樣液在40 ℃下達(dá)到平衡,加入5 μL異淀粉酶后,在40 ℃下緩慢攪拌24 h,最后沸水浴10 min終止反應(yīng),取400 μL樣液,用150 mmol/L氫氧化鈉溶液將其稀釋至2 mL,0.45 μm濾膜過濾。將過濾后的樣品注入ICS-5000 HPAEC系統(tǒng),以1 mL/min的流速洗脫樣品。流動(dòng)相為150 mmol/L氫氧化鈉溶液(洗脫液A)和含有500 mmol/L醋酸鈉的150 mmol/L氫氧化鈉溶液(洗脫液B)。將洗脫液B與洗脫液A混合,洗脫條件如下:0~15 min,15%~34% B;15~26 min,34%~40% B;26~52 min,40%~49% B;52~58 min,49%~100% B;58~60 min,100%~15% B;60~80 min,15% B。

    1.3.3 分支密度的測(cè)定

    采用質(zhì)子核磁共振氫譜測(cè)定改性前后紅薯淀粉的分支密度[13-14]。稱取5 mg待測(cè)淀粉樣品溶解在1 mL重水(D2O)中,沸水浴中持續(xù)攪拌30 min,然后冷卻并冷凍干燥。再將冷凍干燥樣品重新溶解在0.6 mL的D2O中。以潘糖作為標(biāo)準(zhǔn)品,在溫度80 ℃條件下進(jìn)行質(zhì)子核磁共振光譜測(cè)定。α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵的核磁共振光譜出峰位置分別在δ5.4和δ5.0確定。通過公式(1)計(jì)算分支密度。

    式中:Sα-1,4和Sα-1,6分別是α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵的核磁共振光譜峰面積。

    1.3.4 結(jié)晶結(jié)構(gòu)的分析

    淀粉的結(jié)晶特性使用X射線衍射儀測(cè)定。程序條件設(shè)定為:電壓40 kV,電流200 mA,衍射角(2θ)的旋轉(zhuǎn)范圍為3°~40°,掃描速率為1.2°/min,步長(zhǎng)0.02°。每個(gè)樣品的掃描時(shí)間約為30 min[15]。

    1.3.5 溶解度的測(cè)定

    配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的淀粉乳液,在90 ℃恒溫水浴30 min后,將其快速冷卻至室溫。然后在2 200 r/min、20 min的條件下進(jìn)行離心。將上清液倒至培養(yǎng)皿中,并在105 ℃下干燥至恒質(zhì)量。按照公式(2)[16]計(jì)算其溶解度。

    式中:m1為可溶性淀粉質(zhì)量/g;m2為樣品總質(zhì)量/g。

    1.3.6 透明度的測(cè)定

    配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的淀粉乳液,在沸水浴中不斷加熱攪拌30 min,待淀粉糊冷卻至25 ℃,以蒸餾水作參比,使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定淀粉糊在640 nm波長(zhǎng)處的透光率[17]。

    1.3.7 流變特性的測(cè)定

    配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的淀粉乳液,在95 ℃水浴條件下不斷加熱攪拌30 min,待其冷卻至室溫,即可進(jìn)行測(cè)定,使用DHR-1旋轉(zhuǎn)流變儀進(jìn)行流變特性的測(cè)定。表觀黏度與剪切速率的關(guān)系測(cè)定條件設(shè)定為:溫度為25 ℃,剪切速率為0~300 s-1。儲(chǔ)能模量和損耗模量與角頻率的關(guān)系測(cè)定條件設(shè)定為:應(yīng)變?yōu)?%,掃描頻率為0.1~100 rad/s[18]。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    所有實(shí)驗(yàn)測(cè)定均重復(fù)3 次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 7.5軟件中Tukey’s檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析來(lái)確定數(shù)據(jù)差異的顯著性,P<0.05表示差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 復(fù)合酶修飾對(duì)紅薯淀粉直鏈淀粉比例和鏈長(zhǎng)分布的影響

    表 1 不同酶處理改性淀粉與對(duì)照樣品的直鏈淀粉比例、鏈長(zhǎng)分布Table 1 Amylose contents and chain length distributions of modified sweet photo starches

    表1顯示了所有樣品的直鏈淀粉比例,經(jīng)α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶依次處理后直鏈淀粉比例較對(duì)照組明顯降低,且隨葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶添加量從50 μL增加至300 μL,直鏈淀粉比例從22.53%下降至12.81%,這個(gè)結(jié)果可能是因?yàn)閺?fù)合酶的降解和分支作用,形成新的分支點(diǎn),從而將直鏈淀粉轉(zhuǎn)化為支鏈淀粉,因此降低了直鏈淀粉的比例。采用HPAEC-PAD測(cè)定了復(fù)合酶處理紅薯淀粉的鏈長(zhǎng)分布,結(jié)果如表1所示,根據(jù)鏈長(zhǎng)的聚合度(degree of polymerization,DP)將鏈長(zhǎng)分布劃分為4 個(gè)部分:A鏈、B1鏈、B2鏈和B3鏈[19]。與對(duì)照組相比,經(jīng)α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶修飾后淀粉的A鏈和B1鏈比例增加,而B2鏈和B3鏈的比例降低,并且隨著葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶添加量的增加,A鏈和B1鏈的比例持續(xù)增加,B2鏈和B3鏈的比例則持續(xù)降低。當(dāng)葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶添加量增加至300 μL時(shí),A鏈和B1鏈比例分別增加至40.25%和53.82%,B2鏈和B3鏈比例則分別減少到3.41%和2.52%。同時(shí),經(jīng)復(fù)合酶處理后淀粉的平均鏈長(zhǎng)相比于對(duì)照組明顯縮短,且隨著葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶添加量從50 μL增加至300 μL,平均鏈長(zhǎng)從18.41逐漸下降至9.42。說(shuō)明復(fù)合酶處理后,紅薯淀粉的短鏈比例顯著增加,平均鏈長(zhǎng)顯著降低。

    2.2 復(fù)合酶修飾對(duì)紅薯淀粉分支密度的影響

    通過液態(tài)核磁共振氫譜法[20]深入研究紅薯淀粉分支密度。淀粉的分支側(cè)鏈?zhǔn)怯搔?1,4-糖苷鍵連接的線性鏈通過α-1,6-糖苷鍵鏈接α-D-吡喃糖基單元形成的。Hernández等[21]報(bào)道在δ5.4、δ5.0和δ4.8處的核磁峰分別代表α-1,4-糖苷鍵中端基質(zhì)子、α-1,6-糖苷鍵中端基質(zhì)子和水峰,而在δ3.3~4.5范圍內(nèi)的核磁峰則分別代表H-2、H-3、H-4和H-5。如圖1所示,所有經(jīng)α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶修飾后的紅薯淀粉α-1,6-糖苷鍵峰面積明顯大于對(duì)照樣品,說(shuō)明淀粉內(nèi)部經(jīng)葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶作用存在著明顯的鏈轉(zhuǎn)移。且所有酶改性淀粉均比對(duì)照樣品有著更高的分支密度,并隨葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶添加量的增加(從50 μL增加至300 μL),分支密度呈增加趨勢(shì)(從21%增加至35%),與平均鏈長(zhǎng)的變化規(guī)律相似。以上結(jié)果說(shuō)明,先通過α-淀粉酶和β-淀粉酶水解天然紅薯淀粉的α-1,4-糖苷鍵,從而使其外鏈長(zhǎng)變短,產(chǎn)物的平均鏈長(zhǎng)也隨之減小,再通過葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的作用將游離的葡萄糖殘基以α-1,6-糖苷鍵的形式連接到其他鏈上,形成了新的分支側(cè)鏈,提高了分支密度。

    圖 1 不同酶處理改性淀粉與對(duì)照樣品的質(zhì)子核磁共振氫譜分析圖Fig. 1 1H NMR analysis of native and modified starches

    2.3 復(fù)合酶修飾對(duì)紅薯淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)的影響

    圖 2 不同酶處理改性紅薯淀粉與對(duì)照樣品的X射線衍射圖Fig. 2 X-ray diffraction patterns of native and modified starches

    由圖2可看出,天然紅薯淀粉不僅在15.0°和23.5°附近出現(xiàn)兩個(gè)強(qiáng)衍射峰,且在17.2°和18.2°出現(xiàn)兩個(gè)連峰,并在19.7°處具有較低強(qiáng)度的峰,這是典型的CA-型晶體結(jié)構(gòu),與之前的研究結(jié)果[22]一致。由于淀粉糊化后,淀粉顆粒吸水膨脹凝膠化,因此對(duì)照樣品沒有衍射峰。然而,經(jīng)α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶處理淀粉的衍射峰發(fā)生了較大變化,如圖2所示,在23.5°處的原始峰消失,在15.3°、17.2°和18.3°處的原始峰強(qiáng)度變?nèi)?,這說(shuō)明天然紅薯淀粉晶型被完全破壞。但酶改性淀粉在13.1°處出現(xiàn)了新的衍射峰,并且在19.7°處的峰值也相對(duì)增加,這意味著被破壞的晶體結(jié)構(gòu)可能重新排列成弱C型晶體結(jié)構(gòu),又由于13.1°和19.7°處的衍射峰是V型結(jié)晶結(jié)構(gòu)的典型峰[23],因此經(jīng)復(fù)合酶修飾后的改性淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)為C+V型,而V型為主要晶型。與天然紅薯淀粉相比,酶改性淀粉在19.7°處的較高峰強(qiáng)度可能是因?yàn)榻?jīng)復(fù)合酶修飾后的高分支淀粉具有更多的短直鏈葡聚糖,與無(wú)水乙醇的復(fù)合物有利于V型晶體結(jié)構(gòu)的形成[24]。天然紅薯淀粉的相對(duì)結(jié)晶度為38.8%,所有酶改性淀粉的相對(duì)結(jié)晶度均低于天然紅薯淀粉,但酶改性淀粉的相對(duì)結(jié)晶度呈現(xiàn)出隨著葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶添加量的增加而增加的趨勢(shì),從10.8%增加至14.8%,這是因?yàn)殡S著葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶添加量增加,短直鏈葡聚糖也越多,其與無(wú)水乙醇的復(fù)合物有利于形成V型晶體結(jié)構(gòu),因此相對(duì)結(jié)晶度會(huì)增大。

    2.4 復(fù)合酶修飾對(duì)紅薯淀粉溶解度和透明度的影響

    表 2 不同酶處理改性淀粉與對(duì)照樣品的溶解度和透明度Table 2 Solubility and transmittance of native and modified sweet photo starches

    所有樣品的溶解度如表2所示,與對(duì)照樣品相比,酶改性淀粉的溶解度顯著提高,且隨著葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶添加量從50 μL增加至300 μL,溶解度從48.48%逐漸提高至66.15%。這個(gè)結(jié)果與先前的研究一致,Jensen[25]和Sievert[26]等指出,淀粉新分支點(diǎn)的引入會(huì)抑制直鏈淀粉的重結(jié)晶、葡聚糖鏈的重新排列以及高度有序支鏈淀粉簇的形成,使溶解度增加。此外,Takata等[27]的研究表明,具有低直鏈淀粉比例、高短鏈比例的高分支聚合物高度可溶。

    如表2所示,透明度的變化規(guī)律與溶解度相似,相比于對(duì)照樣品,酶改性淀粉的透明度明顯提高,并隨葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶添加量從50 μL增加至300 μL,溶解度從61.72%逐漸提高至73.91%,這是因?yàn)閺?fù)合酶修飾后直鏈淀粉比例減少,分支密度增加,當(dāng)?shù)矸酆?,分子間不易形成聚合作用[28],從而抑制了淀粉回生后凝膠束的形成,因此提高了淀粉糊液的透明度。

    2.5 復(fù)合酶修飾對(duì)紅薯淀粉流變特性的影響

    由圖3可知,對(duì)照和酶改性淀粉糊的表觀黏度隨著剪切速率的增加而降低,而酶改性淀粉糊的表觀黏度明顯低于對(duì)照淀粉糊,這表明酶改性淀粉糊溶液為典型的剪切變稀流體,且比對(duì)照淀粉糊具有更大的剪切稀化能力。同時(shí),酶改性淀粉糊的表觀黏度隨著葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶添加量的增加略微降低。酶改性淀粉糊表觀黏度的降低可能是因?yàn)榻?jīng)復(fù)合酶修飾后直鏈淀粉比例相對(duì)較低,分支密度增加,導(dǎo)致直鏈淀粉間形成的纏結(jié)減少,并降低了聚合物凝膠網(wǎng)絡(luò)的重建速度[29],從而降低了黏度。此外,根據(jù)Li Wenwen[30]的研究結(jié)果,高分支密度會(huì)降低鏈間締合,從而降低凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)接合區(qū)的含量,產(chǎn)生更大的剪切稀化能力。因此,隨著葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶添加量的增加,分支密度越高,剪切稀化能力越大,表觀黏度則越小。

    圖 3 不同酶處理改性紅薯淀粉與對(duì)照樣品的表觀黏度隨剪切速率變化曲線Fig. 3 Curves of apparent viscosity against shear rate for native and modified starches

    圖 4 不同酶處理改性紅薯淀粉與對(duì)照樣品的儲(chǔ)能模量和損耗模量隨角頻率變化曲線Fig. 4 Curves of storage modulus and loss modulus against angular frequency for native and modified starches

    對(duì)照和酶改性淀粉糊的儲(chǔ)能模量(G’)和損耗模量(G”)隨角頻率的變化如圖4所示,G’和G”分別用來(lái)表征淀粉糊的彈性特征和黏性特征。對(duì)照淀粉糊的G’和G”隨角頻率升高均呈規(guī)律性的逐漸增加,且在整個(gè)頻率范圍內(nèi)G’始終遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于G”,這表明對(duì)照淀粉糊表現(xiàn)出較弱的凝膠狀行為[31]。酶改性淀粉糊的G’和G”曲線特征與對(duì)照淀粉糊相似,但明顯低于對(duì)照樣品,且隨葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶添加量的增加而逐漸降低,說(shuō)明凝膠的剛性、強(qiáng)度和黏彈性隨著葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶添加量的增加而明顯下降。這是因?yàn)榈矸劢?jīng)復(fù)合酶修飾后,直鏈淀粉比例減少,分支點(diǎn)增加,使直鏈淀粉間不能有效地聚集形成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

    3 結(jié) 論

    使用α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶復(fù)合修飾紅薯淀粉,與原紅薯淀粉相比其分支密度增加,直鏈淀粉比例減少,平均鏈長(zhǎng)降低,相對(duì)結(jié)晶度、表觀黏度、儲(chǔ)能模量和損耗模量降低,溶解度和透明度均有所提高。紅薯淀粉物化特性還受到葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶添加量的影響,實(shí)驗(yàn)表明隨著葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶添加量的增加,表觀黏度和黏彈性逐漸降低,溶解度和透明度則逐漸增大。這可能是因?yàn)樵讦?淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的連續(xù)催化反應(yīng)下,隨著葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶添加量的增加,產(chǎn)生了更多的分支點(diǎn)和更均勻的短支鏈淀粉,可能形成了具有相似鏈長(zhǎng)且對(duì)稱的短鏈分支,以促進(jìn)淀粉有序結(jié)構(gòu)的形成。

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