Knops血型系統(tǒng)(KN，022)的研究進展①

任 凱 田 穩(wěn) 李凌波

(吉林大學基礎醫(yī)學院，長春 130021)

2014年以來，有3個新血型系統(tǒng)得以被確認，即分子基礎為SMIM1跨膜蛋白的Vel血型系統(tǒng)(VEL，034)[1]，以補體調節(jié)蛋白CD59為基礎的CD59血型系統(tǒng)(CD59，035)[2]，以及以核苷轉運蛋白1(ENT1)為基因產(chǎn)物的Augustine血型系統(tǒng)(AUG，036)[3]，截至目前，國際輸血協(xié)會(International Society of Blood Transfusion，ISBT)已確認了由322個紅細胞抗原構成的36個人類紅細胞血型系統(tǒng)[4]。補體調節(jié)蛋白CD59屬于膜分化抗原家族，同CD59系統(tǒng)抗原類似，1991年Rao等和Moulds等人均證明了Knops系統(tǒng)的抗原都位于補體受體1(CR1,CD35)上[5]。作為補體調節(jié)蛋白超家族成員，紅細胞CR1的主要功能為識別和傳遞C3b/C4b結合后的免疫復合物，將其運輸至肝脾吞噬系統(tǒng)清除，從而發(fā)揮紅細胞固有免疫作用。紅細胞上CR1的表達水平在正常人群中相差很大，這種表達數(shù)量上的多態(tài)性在血清學實驗中表現(xiàn)為Knops系統(tǒng)血型抗原的水平。研究發(fā)現(xiàn)，紅細胞上CR1表達數(shù)量及Knops系統(tǒng)血型抗原的多態(tài)性還與多種疾病密切相關，如在SLE患者的紅細胞表面CR1數(shù)量會顯著下降[6]，用特定的含瘧原蟲的培養(yǎng)基感染的紅細胞會和其他感染的紅細胞及未感染的紅細胞形成玫瑰花環(huán)，而低表達CR1的感染紅細胞和未感染紅細胞不形成玫瑰花環(huán)[5]，說明瘧疾的發(fā)病與CR1的數(shù)量表達具有相關性。另外，近年研究發(fā)現(xiàn)，CR1基因CR1*2(S)亞型的低密度表達導致阿爾茨海默病(AD)的淀粉樣蛋白沉積缺乏清除[7]，CR1多態(tài)性與麻風易感性增加有關[8]，中國人群CR1的兩種等位基因的低表達導致陣發(fā)性冷血紅蛋白尿(PNH)患者血紅蛋白水平下降明顯[9]。本文主要針對Knops血型系統(tǒng)的研究進展方面，綜述如下。

1 Knops血型系統(tǒng)

1970年Helgeson描述了一種微弱但具有抗球蛋白反應性的抗體[6]，這種抗體是在一位名為Knops的37歲白人婦女身上發(fā)現(xiàn)的，此人Kna抗原(-)，其血漿中有抗-Kna抗體，通過先證者Knops發(fā)現(xiàn)的抗-Kna后來被稱為“高滴度、低親和力”(HTLA)抗體，HTLA這一術語被用來描述一組異源抗體，有很多具有相同的特性，這些抗體的一個特征是它們的弱反應性，包括用抗人類球蛋白(AHG)試驗檢測,這導致準確的紅細胞表型鑒定非常困難。鑒于Knops抗原的蛋白質基因被克隆，所有已知的Knops抗原在分子水平上進行了確證，1992年ISBT確認Knops為獨立的血型系統(tǒng)[10]，2018年ISBT確認這個系統(tǒng)共有9個抗原[11],即Kna、Knb、McCa、Sl1、Yka、McCb、Sl2、Sl3和KCAM(抗原編號001-009)。1991年，Knops系統(tǒng)的抗原被證實位于補體受體1(CR1)上[12,13]，CR1是一類血型糖蛋白，它存在于紅細胞、粒細胞、單核細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞的一個亞類、腎小球足細胞及淋巴結內(nèi)樹枝狀囊泡細胞上，可溶性CR1(sCR1)存在于血漿中[5]，人類CR1存在分子量多態(tài)性、紅細胞上表達水平多態(tài)性以及Knops血型系統(tǒng)抗原多態(tài)性[14]。Knops血型系統(tǒng)的研究報道主要集中在美國白人、非洲裔美國人及部分東亞人中，研究發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性不僅體現(xiàn)在CR1在補體介導的免疫復合物的清除中起作用[15]，也與細胞內(nèi)的一些微生物相互作用如惡性瘧原蟲和結核分枝桿菌[16,17]。大多數(shù)Knops抗體不被認為具有臨床意義，因為它們不會引起明顯的溶血性輸血反應或胎兒和新生兒溶血性疾病[18]，Knops血型系統(tǒng)的抗體雖然本身不會引發(fā)輸血反應，但可能會掩蓋同一份血清中的其他可能引起輸血反應的抗體。

2 Knops血型抗原基因和CR1

Knops抗原的編碼基因位點在第1號染色體長臂3區(qū)2帶2亞帶，1q32.2(NCBI:NG_007481.1)，基因名CR1，由39個外顯子組成，總長度約8 629 bp，基因產(chǎn)物為KN抗原糖蛋白，也稱為補體Ⅰ型受體(CR1)及“膜分化抗原CD35”，或稱為“補體C3b/C4b受體”[19-21]。CR1屬于補體活化(RCA)家族，具有短一致重復序列(small consensus repeats,SCRs)的特征，它由胞外結構域、跨膜結構域和胞質結構域組成，CR1(sCR1)的可溶性形式缺乏跨膜和細胞質結構域，存在于血清中。Knops抗原由于染色體不等交換產(chǎn)生同種異構基因，大量的插入和刪除形成了4種結構變異基因，由4種不同的外顯子序列都編碼相同的CR1糖蛋白，但與血型抗原無關，分別為CR1*1基因(由39個外顯子組成)、CR1*2基因(由47個外顯子組成)、CR1*3基因(由30個外顯子組成)、CR1*4基因(由31個外顯子組成)[5,18,21]。最常見的形式是CR1*1基因，它由39個外顯子組成，這些外顯子橫跨133 kb，產(chǎn)生220 kD的蛋白質，由2 039個氨基酸組成，包括41個氨基酸N端信號肽、1 930個氨基酸胞外結構域、25個氨基酸跨膜區(qū)和43個氨基酸胞內(nèi)結構域[5,21]。CR1的胞外結構域由一系列同源氨基酸序列區(qū)組成，每段序列由大約60個氨基酸殘基組成一個短一致重復序列(SCRs)或補體調節(jié)蛋白重復序列(CCPs)，7個SCRs進一步排列成4個長的同源重復序列(LHRs)，用LHR-A、LHR-B、LHR-C、LHR-D表示，所有Knops抗原都表達在LHR-D序列(圖1)[5,22]。CR1在膜外部的4個同源重復序列中，每個重復序列中都有4個半胱氨酸殘基，它們以2個二硫鍵維持折疊構象，在CR1上有25個N糖基化位點，每個分子上6～8個N-聚糖，CR1沒有O型糖基化位點。因為高度的同源性，定位Knops血型抗原顯得異常困難，導致Knops血型抗原出現(xiàn)多態(tài)性的基因突變多位于CR1基因第29外顯子，通過單核苷酸變化產(chǎn)生的McCa、McCb、Sl1、Sl2、Sl3、KCAM和Yka抗原被分子生物學技術確認，Kna、Knb也通過基因分型方法得以證實[5,18,22]。

圖1 最常見的CR1同種異型(CR1*1)模式圖[5]Fig.1 Diagrammatic representation of the most common allotype of CR1(CR1*1)[5]Note:Showing the 30 complement control protein repeats(CCP),the four long homologous repeats(LHR),one of the 6-8 N-linked oligosaccharides(N),the transmembrane region,and the cytoplasmic domain,the active sites(site 1 and the duplicated site 2),the position of the Knops polymorphisms in CCP-22 and CCP-25.

CR1是一種表達于紅細胞、白細胞和腎小球足等細胞上的多態(tài)性糖蛋白，除血小板外，人類大多數(shù)外周血細胞可見，根據(jù)使用方法的不同，每個紅細胞存在300～800 個CR1分子，而每個白細胞存在10 000～30 000個CR1分子，每個紅細胞個體CR1分子可存在差異，由20～800個不等[5,18]。由于外周血中紅細胞濃度是單核細胞(PBMCs)的103倍，它們占血液中CR1的85%以上，血液中紅細胞CR1多態(tài)性與分子長度(分子量)、CR1表達水平(受體數(shù)量)、紅細胞Knops血型抗原表達水平的差異有關。CR1是C3b和C4b的受體，在去除C3b和C4b包覆的免疫復合物中起著重要作用，它還通過阻止經(jīng)典和替代途徑轉化酶的形成以及作為共同因子參與因子Ⅰ介導的從C3b到iC3b、C3dg和C3c的分裂，來調控補體級聯(lián)激活，CR1還參與多種自身免疫性和感染性疾病的發(fā)病和發(fā)展[18]。

3 Knops血型系統(tǒng)抗原頻率及其與疾病相關性

Kna是高頻抗原，是最早發(fā)現(xiàn)的Knops系統(tǒng)抗原，Kna在美國白人及黑人中分布頻率均為98.8%，其等位基因對偶抗原Knb為低頻抗原，Knb在白種美國人中分布頻率為4.4%、黑人中頻率<0.01%[5,23]。Knops血型系統(tǒng)確認的9個抗原中，Kna、SI1、SI3、KCAM、McCa、yka在白種人中均為高頻抗原，SI1、McCa、yka在白種美國人中分布頻率分別為97.8%、98.5%、89.8%，而SI3在所有人群分布均接近100%、KCAM在大部分人群頻率98%，但SI1在非洲裔美國人中表達頻率為53.5%、KCAM在黑人中頻率約為20%[5,23]。McCb、SI2在白人中為低頻抗原，McCb在白種人中頻率<0.1%、在黑人中頻率45%，SI2在白種人中頻率<0.01%、在黑人中頻率80%[23]。另外，一些Kna(-)者表現(xiàn)為Knops表型無效，即Helgeson無效表型，該類紅細胞上的CR1只有正常紅細胞的10%，其頻率在黑種人和白種人中均是1%[5]。美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorp-hism，SNP)數(shù)據(jù)庫列表了32個Knops系統(tǒng)CR1基因的變異型，幾乎所有的Knops系統(tǒng)SNP多態(tài)性均與CR1的第29外顯子有關，并在CCP-25位編碼氨基酸的變化，但Yka的SNP多態(tài)性與第26外顯子相關，在CCP-22位點編碼氨基酸的變化。Knops血型系統(tǒng)的數(shù)據(jù)主要集中在歐洲、非洲人群中，在中國人群中的基因背景研究極少。Covas等[24]對起源于歐洲、亞洲、非洲的巴西人群Knops血型抗原進行研究，結果起源歐洲、非洲人群所有抗原均有多態(tài)性，McCb和SI2抗原在非洲組有較高的頻率，亞洲組只有KCAM抗原表達多態(tài)性。2010年Li等[25]采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(PCR)及測序方法對281名包括中國5個民族Knops血型多態(tài)性進行檢測，其中漢族人群CR1基因在編碼區(qū)檢測到12個SNP，在CR1基因第29外顯子中檢測到2個SNP(A4646G和A4870G)，Knops基因頻率為Kna等位基因頻率1.0，McCa、SI1頻率均為1.0，KCAM+頻率0.82，KCAM-頻率0.18，發(fā)現(xiàn)中國漢族人CR1基因較白種人及非洲人更為保守，且中國不同民族具有不同的CR1基因特征。

Knops抗原強度存在個體差異，而且這種差異和紅細胞上CR1水平密切相關，每個紅細胞上CR1密度隨著細胞衰老而衰減，有推測認為是由于蛋白酶對CR1莖部附近蛋白剪切造成的[5]。除了調節(jié)補體，表達Knops抗原的CR1在紅細胞膜上的聚集被認為是紅細胞免疫黏附功能中的關鍵因素，其結合并傳遞C3b/C4b結合的免疫復合物，然后運送至肝脾清除體外，并以優(yōu)先結合IgG的方式阻止IgG與其他紅細胞抗原的結合，且這種結合并不使紅細胞裂解破壞，研究認為這解釋了Knops系統(tǒng)抗體不會發(fā)生顯著縮短所輸入的不相容紅細胞存活時間或導致輸血反應[5,18]。多種疾病被報道與紅細胞CR1水平下降有關，患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的患者紅細胞表面CR1數(shù)量顯著下降[26]，免疫黏附清除功能被破壞，免疫復合物沉積在SLE患者組織而導致疾病加重。其他自身免疫性疾病，如干燥綜合征和類風濕性關節(jié)炎[27]，也有紅細胞關聯(lián)CR1表達降低，但未發(fā)生溶血、貧血。另一類報道較多為感染性疾病如瘧疾，研究發(fā)現(xiàn)，用特定的含瘧原蟲的培養(yǎng)基感染的紅細胞會和其他感染的紅細胞及未感染的紅細胞形成玫瑰花環(huán)，而低表達CR1的感染紅細胞和未感染紅細胞不形成玫瑰花環(huán)，并且Knops系統(tǒng)抗原SI1(-)細胞形成的花環(huán)比SI1(+)細胞明顯減少，且SI1(-)、McCb表型頻率在非洲瘧疾流行地方黑人中高表達，說明瘧疾的發(fā)病與CR1表達數(shù)量和血型多態(tài)性都密切相關[5,21,28]。很多疾病在發(fā)生時都有紅細胞上CR1數(shù)量的減少，造成這種下降的機制目前無法確定，但CR1表達和/或功能降低導致免疫黏附清除受損，這對紅細胞沒有直接影響，但會使免疫復合物沉積導致疾病的進展和誘導組織炎癥反應加重。同時，含有的高水平免疫復合物需要清除的某些疾病，如SLE或者人類免疫缺陷病毒(human immunodefici-ency virus，HIV)，均會造成紅細胞上CR1損失的增加，從而導致Knops抗原強度減弱[18,29]。這些紅細胞上CR1水平下降的疾病或病變還包括陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)[30]、先兆子癇[31]、紅細胞儲存損傷[32]、胰島素依賴型糖尿病[33]、嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)[34]等。具有Knops抗原多態(tài)性的CR1是一種功能多樣的蛋白質，也有充分的證據(jù)表明CR1與多種疾病有相關性，使CR1成為研究的理想靶點，其生物作用讓它未來可作為決定疾病易感性、診斷和預后的標志[29]，甚至治療的手段，如為對抗細菌中不斷增長的抗生素耐藥性，已有人基于CR1的免疫特性對耐藥金黃色葡萄球菌感染的治療進行了實驗，設計了一種雙特異性單克隆抗體復合物，特異性識別紅細胞CR1和金黃色葡萄球菌T5分離株5型莢膜多糖，可促進將金黃色葡萄球菌轉移到紅細胞(通過CR1)，然后轉移到單核細胞或巨噬細胞內(nèi)消化和殺滅[35]。

4 Knops血型抗體及臨床意義

Knops系統(tǒng)的Kna、SI1、SI3、KCAM、McCa、yka在白種人均是紅細胞高頻抗原，而對180份中國漢族獻血者的研究表明Kna、SI1、SI3、McCa均為100%表達的高頻抗原[36]，以往認為以上相關抗原在臨床輸血中意義不大。但針對Knops系統(tǒng)抗原的抗體并不少見，抗-Kna、抗-SI1、抗-McCa及抗-Yka等均是非導致溶血抗體，不降低所輸入的不相合紅細胞的存活率，但由于它們可引起交叉配血不相合，是輸血前檢測中的一大難題，應予以鑒別[37]。

Knops抗體一般是IgG抗體，它們通過抗球蛋白試驗與相應抗原發(fā)生反應，發(fā)現(xiàn)的Knops抗體IgG亞型涵蓋了IgG1、IgG3、IgG4及IgA，也曾發(fā)現(xiàn)過一例無輸血史及孕史女性產(chǎn)生了“天然”的抗-Kna抗體[5]。大多數(shù)Knops系統(tǒng)抗體具有高效價、低親合性(HTLA)的特性，但也有高或低效價、高親合性的。Knops抗體效價取決于紅細胞CR1水平，由于不同個體間Knops抗原強度差異較大，且Knops抗體也不易被抗原陽性紅細胞吸收，也很難從抗原弱陽性細胞上獲得相應的陽性洗脫物，所以Knops抗體很難被鑒定，也幾乎無法用Knops抗體來區(qū)分抗原陰性與弱陽性細胞，尤其是已儲存或運輸過的紅細胞，有研究認為這可能反映了紅細胞膜上相對低密度的CR1蛋白[5,18]。另外，在人唾液中并未發(fā)現(xiàn)CR1，但在人尿和血漿中都發(fā)現(xiàn)含量較低的CR1，推測這可能是CR1蛋白水解裂解的結果，由于如血漿中CR1含量僅到達毫微克級別[18]，所以不足以使用常規(guī)血清學技術中和Knops系統(tǒng)抗體。

Knops系統(tǒng)同種異型抗體均為免疫性抗體，由輸血或妊娠產(chǎn)生，不結合補體。普遍認為，Knops系統(tǒng)抗體在臨床上是“無害”的，通常無臨床意義，即不引起溶血性輸血反應和新生兒溶血病，也不會縮短輸入的血型不相容紅細胞的存活期。有研究顯示[38]，CR1似乎是紅細胞上一個結合IgG的優(yōu)先位點，相對數(shù)量較多的IgG可以優(yōu)先與CR1結合，且并不發(fā)生紅細胞裂解或吞噬，這可能解釋了有Knops系統(tǒng)抗體但卻不會明顯降低患者輸入不相容紅細胞生存率的原因。帶有Knops系統(tǒng)抗體的患者血清中大約50%同時含有針對其他紅細胞抗原的抗體，對這同一血清中具有臨床意義抗體的“掩蓋”成為Knops系統(tǒng)抗體的主要危險，除此之外，選擇待輸注血液時不用考慮Knops抗體。在存在Knops抗體患者體內(nèi)用放射性同位素標記不相容的紅細胞，顯示這些紅細胞生存率正常或僅輕微縮短，大量研究也證實了帶有Knops抗體的患者進行輸血并無產(chǎn)生任何不良反應[5]。盡管免疫的機會很多，在Knops相應抗原不合的母胎之間也有產(chǎn)生抗體的案例[39]，但并沒有Knops抗體引起新生兒溶血病(HDN)的報道[5]。

5 展望

Knops系統(tǒng)1992年被ISBT紅細胞表面抗原命名委員會認可成為第22號血型系統(tǒng)，從那時起含有Knops抗原的蛋白質已被鑒定，其基因也已被克隆，所有已知的Knops抗原已經(jīng)在分子水平上進行了鑒別。這使得對其研究主要體現(xiàn)在更準確地探究Knops血型系統(tǒng)在疾病中的作用。Knops系統(tǒng)基因產(chǎn)物為補體Ⅰ型受體(CR1,CD35)，其主要作用為參與抑制補體激活，是重要的紅細胞免疫機制參與者，并也與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。

CR1是人類補體系統(tǒng)調節(jié)蛋白，補體系統(tǒng)是人類先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，它不僅是機體抵御病原體入侵的有效屏障，而且是機體維持自身平衡的必要條件。然而，作為炎癥介質的過度激活，會產(chǎn)生重要的病理后果，如各種嚴重的臨床疾病。多種可溶性和膜結合調控蛋白如CR1，提供了對不適當?shù)难a體介導的組織破壞的保護。另外，補體成分的缺陷增加了感染和自身免疫性疾病的易感性，而補體調節(jié)蛋白的缺陷則可能由于不受限制的激活而導致嚴重的疾病。隨著先進診斷分析方法的建立，和對系統(tǒng)激活狀態(tài)的全面了解，從而使我們可以更好地定義疾病的嚴重程度，并分析其治療策略。對于Knops系統(tǒng)而言，由于在CR1基因中發(fā)現(xiàn)過大量的SNP[18]，分子鑒定方法的確立也有助于對Knops血型抗原的多態(tài)性進行更細致深入的鑒定，進而探討更多可能與疾病相關的機制。