糖蛋白130相關(guān)炎癥因子介導(dǎo)RA患者破骨細(xì)胞分化的初步研究①

徐 鵬 鄒任玲 張冬青

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性全身性的，以大小關(guān)節(jié)病變和關(guān)節(jié)滑膜受到炎性細(xì)胞浸潤為特征，逐步形成血管翳，最終導(dǎo)致骨和軟骨侵蝕破壞的自身免疫性疾病。其發(fā)病機(jī)制可歸結(jié)于患者異常免疫學(xué)功能及其所關(guān)聯(lián)的多種炎癥細(xì)胞以及多種炎癥因子介導(dǎo)了特定信號分子通路的過度活化，從而誘導(dǎo)患者關(guān)節(jié)病灶破骨細(xì)胞的分化，進(jìn)而造成患者大小關(guān)節(jié)損傷和破壞[1,2]。糖蛋白130 (gp130)作為IL-6、IL-11和IL-27等細(xì)胞因子共同的受體β亞基，受相關(guān)配體啟動(dòng)激活了JAK/STAT通路，導(dǎo)致患者JAK/STAT相關(guān)信號分子和靶點(diǎn)過度活躍及IL-6受體分子也在破骨細(xì)胞表面高表達(dá)。本文旨在分析gp130相關(guān)炎癥因子及介導(dǎo)RA患者破骨細(xì)胞增殖分化的可能機(jī)制，借以用抗gp130抗體調(diào)控gp130分子的異常表達(dá)，從而達(dá)到用免疫手段協(xié)同臨床干預(yù)RA患者疾病進(jìn)程的可能性。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 與上海市長寧區(qū)光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院合作，隨機(jī)選取2014年1月至2017年6月RA患者47例作為實(shí)驗(yàn)組，男性15例，女性32例，年齡為(57±12)歲，病程(5±3)年，符合ACR/EULAR 2010年RA分類標(biāo)準(zhǔn)[3]。對照組選取健康獻(xiàn)血者40例，男女各20例，年齡(45±15)歲，無慢性疾病史和長期用藥史，1周內(nèi)無急性感染，各關(guān)節(jié)功能正常。以上所有標(biāo)本均滿足血紅蛋白≥100 g/L，白細(xì)胞≥3.5×109L-1，血清肌酐、血清膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶不大于正常值的1.5倍[4,5]。

1.1.2主要試劑及儀器 IL-6、IL-6Rα、gp130、IL-11、IL-27和MMP-9 ELISA檢測試劑盒，購自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基，酶標(biāo)檢測儀購自美國Thermo Fisher公司；流式抗體同型對照及流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；電泳凝膠轉(zhuǎn)印成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1血清處理與酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測 室溫凝固血清30 min，3 000 r/min離心15 min，分裝EP管，-80℃冷凍保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)提前取出30 min解凍。ELISA按照各試劑盒說明書操作，以IL-6為例，加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品100 μl，37℃溫育120 min 后洗板4次，加一抗50 μl，37℃溫育60 min后洗板4次，加酶標(biāo)抗體100 μl，37℃溫育60 min后洗板4次，加底物顯色劑100 μl，避光10 min，加終止液 50 μl，在450 nm處測吸光值。分別檢測正常對照組和RA患者的血清IL-6、IL-6Rα、gp130、IL-11、IL-27和MMP-9表達(dá)量。

1.2.2破骨細(xì)胞樣細(xì)胞(OLC)培養(yǎng) 取研究對象外周全血10 ml，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋2～3倍，輕緩加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液上層，2 000 r/min離心20 min，收集單個(gè)核細(xì)胞層，再以RPMI1640洗滌2次后，1 500 r/min離心10 min，重懸細(xì)胞[4,6]。將對照組和RA患者的PBMC細(xì)胞分別在添加20 ng/ml RANKL和M-CSF的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，再添加40 ng/ml RANKL一起培養(yǎng)7 d。M-CSF和RANKL每3 d補(bǔ)充一次，直至視野下可見大量纖維狀破骨樣細(xì)胞聚集。細(xì)胞以4%多聚甲醛固定，分別并進(jìn)行TRAP 染色[7]和FITC-抗gp130抗體標(biāo)記。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測gp130陽性細(xì)胞 分別將正常對照組和RA患者的PBMC細(xì)胞，以及M-CSF/RANKL誘導(dǎo)的OLC細(xì)胞稀釋成百萬計(jì)數(shù)單位，取100 μl分裝至流式管，各加入FITC-抗gp130抗體2 μl，4℃孵育1 h，PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，在散射光參數(shù)圖上選取淋巴細(xì)胞群，在熒光參數(shù)圖上選取綠色熒光陽性的細(xì)胞群進(jìn)行分選。

1.2.4抗gp130 McAb的制備(簡略)與處理 通過BALB/c小鼠腹腔注射混有弗氏完全佐劑的gp130重組蛋白，第2周及4周重復(fù)加強(qiáng)免疫2次，第5周沖擊免疫后3 d處死取脾臟研磨，以HAT選擇性培養(yǎng)基混合脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞，篩選出有效的細(xì)胞株經(jīng)擴(kuò)增純化即為其gp130單克隆抗體[8]。在培養(yǎng)OLC同時(shí)單抗干預(yù)組再每3 d加50 μg/ml鼠抗人gp130單抗，其余條件不變，進(jìn)行TRAP染色并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)定量分析結(jié)果，同時(shí)分別取PBMC和OLC細(xì)胞上清用ELISA檢測IL-6和MMP-9表達(dá)水平。

1.2.5免疫印跡法(Western blot)檢測STAT3信號 分別將正常對照PBMC、RA患者PBMC及OLC中加入50 μg/ml抗gp130 McAb，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱溫育1 h，再加入10 ng/ml IL-6，37℃溫育20 min 后，PBS洗滌2次，1 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，提取全蛋白，加β-actin參照，Western blot檢測STAT3及其磷酸化水平。

2 結(jié)果

2.1血清IL-6/IL-6Rα/gp130表達(dá)檢測 經(jīng)過ELISA檢測顯示，40例對照組IL-6、IL-6Rα、gp130血清水平分別為(18.03±4.77) pg/ml、(48.12±13.67)ng/ml、(249.66±64.99)ng/ml，47例RA患者組分別為(43.51±20.53) pg/ml、(53.26±18.36)ng/ml、(226.65±78.54)ng/ml，兩組IL-6水平比較差異性有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。雖然患者血清IL-6Rα與gp130水平差異性不顯著(P>0.05)，但進(jìn)一步計(jì)算成對標(biāo)本的IL-6Rα/gp130后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，RA患者血清均存在IL-6Rα/gp130異常升高(0.195±0.037)vs(0.240±0.050)，差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。RA患者體內(nèi)除了IL-6異常升高外，還可能存在IL-6Rα/gp130失衡狀況。

圖1 RA患者IL-6、IL-6Rα、gp130血清水平表達(dá)量及其比值Fig.1 Serum IL-6，IL-6Rα，gp130 content and ratio of IL-6Rα/gp130 in RA patientsNote: Compared with the control group,*.P<0.05；compared with the control group，**.P<0.01.

2.2血清IL-11、IL-27和MMP-9表達(dá)檢測 經(jīng)ELISA檢測顯示，47例RA患者的IL-11、IL-27和MMP-9 血清水平與40例對照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 RA患者IL-11、IL-27和MMP-9的表達(dá)量Tab.1 Serum IL-11，IL-27 and MMP-9 content in RA

Note：Compared with control group,1)P<0.05，2)P<0.01.

2.3gp130陽性細(xì)胞 用FITC標(biāo)記的抗gp130抗體FACS檢測表明：正常人外周血PBMC(PBMC-NP)gp130陽性細(xì)胞為(1.10±0.38)%，RA患者PBMC gp130陽性細(xì)胞已達(dá)(15.12±1.97)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)RANKL和M-CSF誘導(dǎo)10 d，正常人OLC具有g(shù)p130陽性細(xì)胞為(11.74±3.91)%；RA患者具有g(shù)p130陽性細(xì)胞高達(dá)(44.07±5.06)%，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。從上結(jié)果揭示RA患者淋巴細(xì)胞gp130升高，而破骨細(xì)胞表面本身可能含有豐富gp130糖蛋白。

圖2 RANKL和M-CSF誘導(dǎo)后，對照組和RA患者的細(xì)胞中g(shù)p130的表達(dá)Fig.2 gp130 expression in cells from controls and patients with RA after induction with RANKL and M-CSFNote: The percentage of gp130-positive cells was detected.

2.4破骨細(xì)胞TRAP染色分析 當(dāng)加入RANKL和M-CSF共培養(yǎng)3 d后顯微鏡下即可見細(xì)胞間隙模糊，互相融合出現(xiàn)多核巨細(xì)胞，邊緣不規(guī)則部分出現(xiàn)偽足，再添加RANKL培養(yǎng)7 d后TRAP染色，顯微鏡下可見胞漿酒紅色，細(xì)胞核個(gè)數(shù)大于3個(gè)，定義為TRAP+細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)定量分析，結(jié)果顯示與正常對照組比較，RA患者組破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。在RANKL刺激破骨細(xì)胞同時(shí)，加入自制鼠抗人gp130 McAb，誘導(dǎo)分化7 d后，可見RA患者組破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05，圖3)。

圖3 抗gp130 McAb干預(yù)破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)Fig.3 Anti-gp130 McAb interfere with induction of osteoclastsNote: A.Normal-OLC;B.Normal-OLC treatment with anti-gp130 McAb;C.RA-OLC;D.RA-OLC treatment with anti-gp130 McAb;E.The expression of TRAP-positive cells in normal and RA patients 7 days after induction by RANKL and anti-gp130 McAb.*.P<0.05.

表2 RA患者細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6和MMP-9表達(dá)量Tab.2 IL-6 and MMP-9 content in supernatants of RA patients cell

Note：RA PBMC compared with NC PBMC;RA OLC compared with NC OLC;RA gp130 McAb compared with NC gp130 McAb,1)P<0.05，2)P<0.01.

2.5抗gp130 McAb干預(yù)破骨細(xì)胞上清的IL-6和MMP-9表達(dá)檢測 經(jīng)ELISA分別檢測正常人和RA患者的PBMC，OLC和加入抗gp130 McAb共培養(yǎng)的OLC，結(jié)果如表2所示，正常對照組破骨細(xì)胞上清的IL-6和MMP-9均顯著低于RA患者組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，加入 抗gp130 McAb干預(yù)的RA患者組破骨細(xì)胞上清的IL-6和MMP-9均顯著下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖4 抗人gp130單克隆抗體對RA患者細(xì)胞分泌IL-6和MMP-9的影響Fig.4 Effect of anti-human gp130 MaAb on IL-6 and MMP-9 secretion by RA cellsNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

2.6Western blot檢測RA PBMC/OLC細(xì)胞STAT3的磷酸化 IL-6結(jié)合細(xì)胞表面IL-6R/gp130可激活JAK/STAT信號通路，刺激細(xì)胞內(nèi)STAT3磷酸化，20 min 即達(dá)峰值，以Western blot分別評估正常人及RA患者的PBMC和OLC細(xì)胞的抗gp130 McAb調(diào)控作用，圖5表明加入抗gp130 McAb能明顯抑制RA患者PBMC和OLC細(xì)胞內(nèi)STAT3磷酸化。

圖5 抗人gp130單克隆抗體對STAT3磷酸化的影響Fig.5 Effect of anti-human gp130 McAb on phosphoryl-ation of STAT3Note: A.Normal-PBMC;B.RA-PBMC;C.RA-OLC.

3 討論

眾所周知，IL-6和IL-11都屬于白介素IL-6家族，其主要分類依據(jù)正是此類細(xì)胞因子的受體都共同含有信號傳導(dǎo)受體亞基gp130糖蛋白。IL-6或其家族成員如IL-11與細(xì)胞膜表面或可溶性IL-6R/IL-11R的結(jié)合啟動(dòng)了IL-6R與gp130的結(jié)合，gp130隨后進(jìn)行同源二聚體化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[9,10]。而IL-27雖然屬于白介素IL-12家族，由p28和EBI3組成，但其傳導(dǎo)途徑同樣需要通過IL-27R與gp130組成異源二聚體[11]。研究表明，炎癥反應(yīng)往往由細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)完成，而體內(nèi)促炎與抗炎細(xì)胞因子的失衡往往正是誘導(dǎo)自身免疫疾病、慢性炎癥疾病以及相關(guān)機(jī)體組織破壞的罪魁禍?zhǔn)譡12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果IL-6與IL-11在RA患者血清的高表達(dá)提示其可能通過受體傳導(dǎo)信號，參與RA發(fā)病進(jìn)程。IL-6可誘導(dǎo)B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖和分化，在滑膜病灶處，誘導(dǎo)VEGF分泌可促使滑膜血管新生，誘導(dǎo)RANKL刺激破骨細(xì)胞分化侵襲關(guān)節(jié)[13]，甚至與BMPs家族水平調(diào)節(jié)相關(guān)，使破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞在骨微環(huán)境失衡[14]。IL-11具有與IL-6相似可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和骨代謝的功能，誘導(dǎo)CRP等合成，且IL-11還可刺激TPO，促進(jìn)血小板的增殖分化[9]，可能是RA患者往往同時(shí)伴有血小板增多癥的主要因素之一。IL-27在RA患者體循環(huán)的高表達(dá)揭示了RA患者Th1/Th2的免疫失衡，IL-27體內(nèi)循環(huán)調(diào)節(jié)免疫促Th1分化可上調(diào)ICAM-1在FLS表面表達(dá)，加強(qiáng)多種趨化因子，過度激活JAK/STAT通路，加重RA患者滑膜炎癥和骨破壞[11,15]。

MMP-9作為金屬基質(zhì)蛋白酶的代表，參與細(xì)胞外基質(zhì)代謝，作用底物Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原及明膠等，是反映骨吸收與骨重建的重要關(guān)鍵酶，可由破骨細(xì)胞高表達(dá)，在破骨細(xì)胞遷移、侵蝕、錨定過程起重要作用[16]。實(shí)驗(yàn)表明的體循環(huán)MMP-9高表達(dá)正提示了RA患者體內(nèi)破骨細(xì)胞分化造成骨侵蝕的嚴(yán)重程度。且RA患者的IL-6、IL-11、IL-27血清學(xué)水平的異常升高，原因可能是其誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，分泌大量金屬基質(zhì)蛋白酶進(jìn)入體循環(huán)，表現(xiàn)骨侵蝕的后果。而RA患者單個(gè)核細(xì)胞上清分泌IL-6的高表達(dá)，同樣揭示其可能調(diào)控淋巴細(xì)胞自分泌的IL-6誘導(dǎo)單核細(xì)胞融合形成多核破骨樣細(xì)胞，分泌MMP-9參與骨侵蝕。

本研究檢測到的血清可溶性gp130(sgp130)，可能來源于膜結(jié)合受體的蛋白分解或選擇性剪接，且sgp130可能是IL-6/sIL-6Rα反式信號途徑天然的拮抗劑，通過競爭結(jié)合sIL-6Rα，從而部分抑制IL-6的過度激活。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：RA患者細(xì)胞表面gp130大幅增加，但游離血清中的sgp130有所減少可能就在于招募了IL-6和sIL-6Rα，從而減少了反式信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞的途徑。IL-6雖有誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化等功能，但單獨(dú)并無法發(fā)揮生物化功能，必須連接其受體IL-6Rα/gp130發(fā)揮作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RA患者血清學(xué)IL-6Rα/gp130失衡，可導(dǎo)致IL-6/IL-6Rα/gp130過量反式信號傳導(dǎo)，由于體循環(huán)存在過量的gp130相關(guān)配體，雖有血清sp130中和，但依然存在大量IL-6/IL-6Rα向膜表面gp130傳導(dǎo)反式途徑，造成JAK/STAT過度活化[17]，由此提示IL-6Rα/gp130可能是RA患者發(fā)病或病情加重的重要因素和潛在診斷手段。

體外實(shí)驗(yàn)通過收集PBMC，并以M-CSF和RANKL誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，同樣條件下，RA患者比正常人可生成更多的破骨細(xì)胞，存在高表達(dá)的IL-6和MMP-9，且RA患者的破骨細(xì)胞表面gp130的高表達(dá)提示其可能大量招募IL-6/sIL-6Rα，從而激活STAT3，進(jìn)一步誘導(dǎo)RANKL表達(dá)，而RANKL正是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體的分化成熟關(guān)鍵，同時(shí)通過抗gp130 McAb的干預(yù)亦提示破骨細(xì)胞表面存在的gp130是其骨侵蝕發(fā)揮作用的重要靶點(diǎn)，阻斷gp130可明顯抑制下游的STAT3的磷酸化，降低細(xì)胞分泌IL-6和MMP-9的水平，證明其調(diào)控gp130確可影響RA患者的破骨細(xì)胞分化。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)的研究表明RA患者中不論是IL-6和IL-11，還是IL-27，均通過多種作用機(jī)制參與RA的發(fā)病進(jìn)程，且其特異性受體均需先與gp130組成同源或異源二聚體才能激活信號傳導(dǎo)，缺乏gp130的粒細(xì)胞對IL-6并無應(yīng)答[18]，gp130是RA發(fā)病機(jī)制關(guān)鍵信號通路的重要靶點(diǎn)。RA患者細(xì)胞表面gp130增多可能激活對應(yīng)同源/異源二聚體受體，招募更多不僅限IL-6的相應(yīng)配體誘發(fā)炎癥反應(yīng)加重病情。gp130和其配體們在RA患者體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)和局部病灶的失衡是RA發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵，因此與檢測單一細(xì)胞因子相比，監(jiān)測gp130相關(guān)受體和配體的動(dòng)態(tài)水平表達(dá)可能為診斷RA病程提供更好的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

再者目前針對IL-6、IL-6R及相關(guān)激酶(JAK)等抑制劑抗體藥物已經(jīng)用于臨床[19]，而gp130已被證明高表達(dá)于破骨細(xì)胞表面，且其受到抑制時(shí)可減少破骨細(xì)胞分化，表明gp130也將是具有發(fā)展?jié)摿Φ腞A治療靶點(diǎn)。本項(xiàng)目組正在與醫(yī)院研究團(tuán)隊(duì)合作開展應(yīng)用抗gp130 mab干預(yù)RA患者的關(guān)節(jié)病灶，期待能為臨床RA病程的調(diào)控增添一新的免疫干預(yù)方法。