腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對宮頸癌SiHa細(xì)胞遷移和侵襲的影響①

吉紫陽 任云青

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，汾陽 032200)

婦科癌癥近年來日益引起人們的關(guān)注，成為一個重要的全球衛(wèi)生保健問題。其中，宮頸癌已經(jīng)成為全球女性第四大常見癌癥[1]，腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移成為宮頸癌患者預(yù)后差的主要原因。研究宮頸癌的浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制對于提高患者生存率，改善患者預(yù)后情況具有重要意義。

巨噬細(xì)胞來源于血液單核巨噬細(xì)胞，是重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，也是腫瘤浸潤性細(xì)胞的主要成分之一。根據(jù)局部組織微環(huán)境中存在的因子不同，巨噬細(xì)胞會呈現(xiàn)不同的表型和激活狀態(tài)。近來引起人們關(guān)注的是M2型(替代活化型)巨噬細(xì)胞，它主要浸潤于腫瘤免疫微環(huán)境中并包圍著癌巢，也被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumour associated-macrophages，TAMs)[2]。TAMs通過釋放多種細(xì)胞因子與腫瘤細(xì)胞相互作用進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[3]。雖然在許多腫瘤中如乳腺癌[4]、肺癌[5]等已發(fā)現(xiàn)TAMs有促瘤作用，但TAMs在宮頸癌的發(fā)生和進(jìn)展中的作用及具體分子機(jī)制尚不清楚。因此，本研究通過探討TAMs對宮頸癌SiHa細(xì)胞遷移和侵襲的影響，進(jìn)一步研究TAMs對宮頸癌進(jìn)展的潛在作用，從而為宮頸癌的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 宮頸癌SiHa細(xì)胞和人急性白血病單核細(xì)胞系THP-1分別由山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈。Transwell小室(孔徑0.4 μm和8 μm)、基質(zhì)膠Matrigel(美國Corning公司)；PE anti-human CD204抗體、PE anti-human CD206抗體(美國Biolegend公司)；E-cadherin抗體、N-cadherin抗體(CST公司)；佛波脂(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)(聯(lián)科生物有限公司)；白細(xì)胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；熒光定量PCR試劑盒(德國Qiagen公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化 取對數(shù)生長期THP-1細(xì)胞離心，PRMI1640完全培養(yǎng)基重懸，按1.0×106個/孔細(xì)胞接種至6孔板，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取50 ng/ml PMA處理THP-1細(xì)胞24 h，IL-4(20 ng/ml)繼續(xù)處理72 h，此時細(xì)胞分化效果最佳。

1.2.2腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表型鑒定 取誘導(dǎo)完成的TAMs，消化離心棄去上清，PBS洗滌細(xì)胞沉淀，100 μl PBS重懸細(xì)胞，分別加入5 μl PE標(biāo)記的 CD204和 CD206抗體，避光4℃孵育30 min，離心,棄上清,PBS洗滌細(xì)胞沉淀，500 μl PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。THP-1細(xì)胞作陰性對照。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn) 選擇對數(shù)生長期SiHa細(xì)胞消化離心，DMEM完全培養(yǎng)基重懸，按2.0×105個/孔細(xì)胞接種于6孔板，讓其貼壁生長，待細(xì)胞呈單層融合時，吸棄培養(yǎng)基，用10 μl無菌槍頭進(jìn)行劃痕，PBS洗去脫落細(xì)胞，未共培養(yǎng)組置于無血清DMEM培養(yǎng)，共培養(yǎng)組于TAMs培養(yǎng)上清中培養(yǎng)。分別于0 h、12 h、24 h、48 h對固定的劃痕區(qū)拍照，比較各時間點(diǎn)細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率(%)=(0 h劃痕愈合平均寬度-每12/24 h后劃痕愈合平均寬度)/0 h劃痕愈合平均寬度×100%，以此來評價TAMs培養(yǎng)上清對SiHa細(xì)胞遷移能力的影響。

1.2.4Transwell非接觸式共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 共培養(yǎng)選用Transwell(孔徑0.4 μm)小室，上室接種THP-1細(xì)胞，按1.2.1步驟進(jìn)行誘導(dǎo)；誘導(dǎo)完成后，將小室置于種植SiHa細(xì)胞的6孔板中進(jìn)行共培養(yǎng)48 h，棄去小室，PBS洗滌SiHa細(xì)胞，用于隨后實(shí)驗(yàn)。侵襲實(shí)驗(yàn)選用Transwell(孔徑8 μm)小室，上室用50 μl Matrigel膠(1∶5稀釋)包被，SiHa細(xì)胞接種于Transwell上室，無血清DMEM培養(yǎng)，下室加入TAMs為共培養(yǎng)組，未共培養(yǎng)組下室為DMEM完全培養(yǎng)基，37℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h；4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫室溫避光染色20 min，濕棉棒擦去小室內(nèi)表面細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野拍照并計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果；每組設(shè)置3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。遷移實(shí)驗(yàn)Transwell小室不包被Matrigel膠，其余步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.5Western blot PBS清洗待測細(xì)胞3次，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。100℃變性5 min后等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，根據(jù)目的蛋白加入對應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育；TBST洗膜3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，重復(fù)洗膜。最后加入發(fā)光液于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照并統(tǒng)計灰度值計算相對表達(dá)量。

1.2.6熒光定量RT-PCR 參照RNA提取試劑盒操作說明提取總RNA，測定RNA濃度并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件：95℃、2 min預(yù)變性；95℃、5 s，60℃、10 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。用到的引物序列有β-actin F：5′-TGGACTTCGAGCAAGA-GATG-3′，R：5′-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′；Snail F：5′-GGAAGCCTAACTACAGCGAGC-3′，R：5′-AGGACAGAGTCCCAGATGAGC-3′；Slug F：5′-AAGGACACATAGAACTCACACG-3′，R：5′-CACAGCAGCCAGATTCCTCA-3′。

2 結(jié)果

2.1TAMs誘導(dǎo)分化及表型鑒定 THP-1細(xì)胞呈圓球形，懸浮生長，經(jīng)50 ng/ml PMA誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞停止增殖，呈貼壁生長；20 ng/ml IL-4繼續(xù)誘導(dǎo)72 h，細(xì)胞呈聚集成簇生長，部分細(xì)胞伸出偽足(圖1A～C)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示經(jīng)PMA、IL-4誘導(dǎo)完成的細(xì)胞表面CD204和CD206分子表達(dá)與對照組相比明顯增加。如圖1D所示，CD204誘導(dǎo)組96.63%，對照組0.06%；CD206誘導(dǎo)組48.38%，對照組0.06%。以上結(jié)果提示TAMs誘導(dǎo)成功。

圖1 TAMs的誘導(dǎo)分化及表型鑒定Fig.1 Induced differentiation and phenotypic identifica-tion of TAMsNote: A.Human acute leukemia monocyte line THP-1(×10)；B.Undifferentiated macrophages induced by PMA for 24 hours(×10)；C.Differentiated Macrophages induced by IL-4 for 72 hours(×10)；D.Expression of CD204 and CD206 on the surface of THP-1 and differentiated macrophages by Flow cytometry.

2.2TAMs-SiHa細(xì)胞共培養(yǎng)對SiHa細(xì)胞形態(tài)的影響 TAMs與SiHa細(xì)胞共培養(yǎng)(0.4 μm Transwell)48 h后，鏡下可見：未共培養(yǎng)組SiHa細(xì)胞呈“鵝卵石”樣排列，邊緣鈍圓，細(xì)胞間融合度好；共培養(yǎng)組SiHa細(xì)胞形態(tài)變化明顯，細(xì)胞呈長梭形，排列雜亂，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞間融合度降低，具有明顯的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。見圖2。

圖2 與TAMs共培養(yǎng)后SiHa細(xì)胞的形態(tài)變化(×10)Fig.2 Morphological changes of SiHa cells after co-culture with TAMs (×10)Note: A.Non-culture;B.Co-culture group.

2.3TAMs-SiHa細(xì)胞共培養(yǎng)對SiHa細(xì)胞遷移、侵襲的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與未共培養(yǎng)組相比，各時間點(diǎn)與TAMs培養(yǎng)上清共培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞遷移率均顯著增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3和表1。此外，TAMs與SiHa細(xì)胞共培養(yǎng)(8 μm Transwell)24 h后，用0.1%結(jié)晶紫染色法檢測穿過Transwell上室膜的SiHa細(xì)胞數(shù)來反映其遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示，遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)共培養(yǎng)組穿過Transwell上室膜的SiHa細(xì)胞數(shù)均顯著高于未共培養(yǎng)組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。提示與TAMs共培養(yǎng)后的SiHa細(xì)胞遷移和侵襲能力均增強(qiáng)。見圖4和表2。

圖3 TAMs培養(yǎng)上清對SiHa細(xì)胞遷移的影響Fig.3 Effect of TAMs culture supernatant on migration of SiHa cellsNote: A.Non-culture;B.Co-culture group.

表1 TAMs培養(yǎng)上清對SiHa細(xì)胞遷移率的影響Tab.1 Effect of TAMs culture supernatant on migration rate of SiHa cells

Note:Compared with non-culture group, 1)P<0.05.

圖4 TAMs-SiHa細(xì)胞共培養(yǎng)對SiHa細(xì)胞遷移與侵襲的影響Fig.4 Effect of TAMs-SiHa co-culture on migration and invasion of SiHa cells

表2 TAMs-SiHa細(xì)胞共培養(yǎng)對SiHa細(xì)胞遷移與侵襲的影響Tab.2 Effect of TAMs-SiHa co-culture on migration and invasion of SiHa cells

Note:Compared with non-culture group, 1)P<0.001.

2.4TAMs-SiHa細(xì)胞共培養(yǎng)對SiHa細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 TAMs與SiHa細(xì)胞共培養(yǎng)(0.4 μm Transwell)48 h后，共培養(yǎng)組SiHa細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)水平為0.18±0.01，顯著低于未共培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。共培養(yǎng)組SiHa細(xì)胞N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平分別為0.89±0.04、0.64±0.03，均顯著高于未共培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖5和表3。

圖5 TAMs-SiHa共培養(yǎng)對SiHa細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of TAMs-SiHa co-culture on expression levels of EMT related proteins in SiHa cells

2.5TAMs-SiHa細(xì)胞共培養(yǎng)對SiHa細(xì)胞Snail/Slug mRNA表達(dá)水平的影響 TAMs與SiHa細(xì)胞共培養(yǎng)(0.4 μm Transwell) 48 h后， RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子Snail/Slug mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組Snail、Slug mRNA表達(dá)水平分別為2.13±0.35、3.43±0.24，均顯著高于未共培養(yǎng)組(P<0.05)。見表3。

表3 TAMs-SiHa細(xì)胞共培養(yǎng)對SiHa細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白和Snail/Slug mRNA表達(dá)水平的影響Tab.3 Effect of TAMs-SiHa co-culture on expression levels of EMT related proteins and Snail/Slug mRNA in SiHa cells

Note:Compared with non-culture group, 1)P<0.05.

表4 SiHa細(xì)胞遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白、Snail/Slug mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis between number of migration and invasion of SiHa cells and expression levels of EMT related protein and Snail/Slug mRNA

2.6SiHa細(xì)胞遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白、Snail/Slug mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析 結(jié)果如表4所示，SiHa細(xì)胞遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)與E-cadherin蛋白表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān),而與N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。SiHa細(xì)胞遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)與Snail mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)(P<0.05)，而與Slug mRNA表達(dá)水平均不相關(guān)。

3 討論

近年來，宮頸癌的發(fā)病率逐年增加，且患病人群越來越年輕化，據(jù)估計全球每年新發(fā)宮頸癌病例約57萬，死亡病例約31.1萬[1]。盡管術(shù)前術(shù)后的輔助性化療可以提高患者的生存率，但腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲仍然是宮頸癌患者治療失敗和死亡的主要原因[6]。目前，宮頸癌轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚未完全闡明。因此，進(jìn)一步探討宮頸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制，積極探索有效防止腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的新方法，對于改善宮頸癌患者預(yù)后,提高患者生存率至關(guān)重要。

越來越多的研究表明腫瘤微環(huán)境對腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展起著重要作用[7]。腫瘤微環(huán)境不僅包括多種腫瘤細(xì)胞，還包括基質(zhì)細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等，為腫瘤的進(jìn)展提供支持[8]。在惡性腫瘤浸潤的免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞含量最為豐富，通常具有明顯的M2表型，稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)。TAMs抗原提呈和吞噬作用能力弱，主要是通過自分泌、旁分泌多種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)腫瘤周圍微血管和淋巴管的生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞附著于血管表面，催化腫瘤外基質(zhì)的降解和重建[9]。因此，TAMs作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)將人急性白血病單核細(xì)胞系THP-1誘導(dǎo)成為TAMs,并采用Transwall小室將TAMs與宮頸癌SiHa細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系，充分模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，以此研究TAMs對SiHa細(xì)胞生長形態(tài)、遷移和侵襲的影響。結(jié)果顯示，與TAMs共培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞呈“長梭形、排列雜亂、細(xì)胞間融合度降低”，具有明顯的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。癌細(xì)胞形態(tài)的改變與其功能密切相關(guān)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與TAMs共培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)，提示當(dāng)SiHa細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變后，細(xì)胞間黏附變差，浸潤和遷移能力增強(qiáng)，說明TAMs在促進(jìn)SiHa細(xì)胞遷移和侵襲的過程中發(fā)揮了重要作用。

為了探究TAMs促進(jìn)SiHa細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制，本研究檢測了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)蛋白的表達(dá)。EMT是腫瘤進(jìn)展的一個關(guān)鍵步驟，并且在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[10]。EMT通過促使上皮細(xì)胞在某些因素作用下，失去細(xì)胞極性，丟失細(xì)胞間緊密連接和黏附連接，獲得浸潤和遷移能力，最終實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11]。有研究顯示，TAMs可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT進(jìn)展進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌[12]、肺癌[13]和肝癌[14]等腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。那么在宮頸癌中，TAMs是否可以調(diào)控SiHa細(xì)胞的EMT進(jìn)展，本實(shí)驗(yàn)通過TAMs與SiHa細(xì)胞共培養(yǎng)來觀察SiHa細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示與TAMs共培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)水平顯著降低，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達(dá)水平顯著升高，表明TAMs可以促進(jìn)SiHa細(xì)胞的EMT進(jìn)展。

機(jī)體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞EMT效應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors，TFs)包括鋅指蛋白、Snail、Slug和Twist等[15]，其中Snail/Slug的研究最為多見。Snail是轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail超家族的一員，家族成員有Snail、 Slug、E12/E47、ZEB1、SIP1。Snail家族的結(jié)構(gòu)相似，C-末端含有4～5個C2H2型的鋅指DNA的結(jié)合區(qū)域，每個鋅指結(jié)構(gòu)包括一個α螺旋和兩個β鏈；N-末端含有SNAG結(jié)構(gòu)域，對轉(zhuǎn)錄抑制因子復(fù)合物的結(jié)合至關(guān)重要[16]。有研究表明，轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug與促進(jìn)前列腺癌轉(zhuǎn)移的EMT進(jìn)展相關(guān)[17]。Chien等[18]通過下調(diào)Snail、Slug表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)升高，N-cadherin和Vimentin表達(dá)降低，證實(shí)了下調(diào)Snail/Slug表達(dá)水平可以逆轉(zhuǎn)EMT進(jìn)程。此外，在其他腫瘤中如結(jié)直腸癌[19]、乳腺癌[20]等也可觀察到Snail參與調(diào)節(jié)E-cadherin的表達(dá)來調(diào)控EMT。因此，我們推測Snail/Slug途徑可能是TAMs調(diào)控宮頸癌細(xì)胞EMT效應(yīng)的通路之一。本研究通過RT-PCR技術(shù)檢測了Snail、Slug的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與TAMs共培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞Snail、Slug的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，提示Snail/Slug可能在TAMs促進(jìn)SiHa細(xì)胞EMT進(jìn)展中起著重要作用。

為了探討SiHa細(xì)胞遷移和侵襲能力與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白、Snail/Slug mRNA表達(dá)水平之間的關(guān)系，本研究對SiHa細(xì)胞與TAMs共培養(yǎng)前后，SiHa細(xì)胞遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)與E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白和Snail/Slug mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析。研究發(fā)現(xiàn)，SiHa細(xì)胞遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)與E-cadherin蛋白表達(dá)水平具有顯著的負(fù)性相關(guān)性,而與N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平具有顯著正性相關(guān)性。SiHa細(xì)胞遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)與Snail mRNA表達(dá)水平呈正性相關(guān)，而與Slug mRNA表達(dá)水平不相關(guān)。據(jù)此推測，在TAMs促進(jìn)SiHa細(xì)胞遷移和侵襲的過程中，Snail表達(dá)上調(diào)可能加快了SiHa細(xì)胞的EMT進(jìn)展，從而促進(jìn)了SiHa細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，本研究表明TAMs在促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮了重要作用，可能是通過上調(diào)Snail表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞EMT進(jìn)展來發(fā)揮作用的。因此，抑制腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞向TAMs的轉(zhuǎn)化，負(fù)向調(diào)控Snail的表達(dá)可能會抑制宮頸癌細(xì)胞的EMT進(jìn)展，從而阻止宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，改善患者的預(yù)后情況。