土木香提取物通過下調(diào)miR-31-5p表達(dá)調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的機制研究

韓一栩 周小飛 陳春妃 方秋滿 王發(fā)輝 鄧青春

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦科，?？?570311)

宮頸癌是全球第四大常見的女性惡性腫瘤，每年約有25萬人因此死亡[1]。大多宮頸癌患者確診時已是晚期，主要治療方案可能包括手術(shù)或同步放化療方案，患者預(yù)后較差，負(fù)擔(dān)重。中藥可輔助放化療提高臨床效果，減輕副反應(yīng)，提高患者生存質(zhì)量，延長患者生存期[2]。

土木香(inula helenium L.)是菊科旋覆花屬植物土木香的根，具有抑菌和抗腫瘤活性[3]。研究表明，土木香提取物(inula helenium L.ethyl acetate extract，EEIHL)可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]；土木香內(nèi)酯可抑制卵巢癌細(xì)胞生長和促進細(xì)胞凋亡，阻滯G2/M細(xì)胞周期[5]。但土木香提取物抗腫瘤的作用機制尚不清楚。研究表明，白藜蘆醇可通過下調(diào)miR-31-5p抑制腸癌細(xì)胞增殖[6]；而miR-31在宮頸癌患者血漿中高表達(dá)，其可促進宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖和遷移[7]。因此，本研究假設(shè)土木香提取物通過下調(diào)miR-31-5p表達(dá)調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖和凋亡。

本課題以人宮頸癌細(xì)胞系HeLa為研究對象，研究土木香乙酸乙酯提取物EEIHL對宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并對假設(shè)進行驗證。

1 材料與方法

1.1材料 人宮頸癌細(xì)胞株HeLa購自美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection，ATCC)；土木香藥材購自中藥批發(fā)市場，經(jīng)本院中藥師鑒定為土木香(inula helenium L.)根；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、胰蛋白酶Trypsin、二甲基亞礬(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和四氮唑藍(lán)(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT)購自Sigma-Aldrich公司；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司；引物、miR-31-5p模擬物(miR-31-5p)、miR-31-5p抑制劑(anti-miR-31-5p)和對照(miR-con和anti-miR-con)購自上海吉瑪制藥有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑Trizol、real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購自美國Invitrogen公司；雙染色流式法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；CyclinD1抗體、Cleave-caspase-3抗體和β-actin抗體購自Abcam；顯微鏡、酶標(biāo)儀及real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；BCA蛋白含量檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1土木香提取物(EEIHL)的制備[8]將土木香根(1.0 kg)進行粉碎磨成粗粉，用95%乙醇滲慮提取，真空濃縮得粗提物(約350 g)，然后溶于溫水200 ml中，用3倍量的乙酸乙酯(600 ml)萃取并減壓蒸發(fā)，得到的即為土木香乙酸乙酯提取物EEIHL。用時用DMSO配成高濃度母液，然后加入培養(yǎng)基稀釋為不同質(zhì)量濃度。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)、藥物處理 細(xì)胞培養(yǎng)：將宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于濕度95%、37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化傳代。

藥物處理：將1.2.1得到土木香提取物EEIHL溶于DMSO配制成10 mg/ml，置于-20℃保存。將HeLa細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)細(xì)胞24 h，至貼壁狀態(tài)，加入不同量的EEIHL配制成所需濃度，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，將HeLa細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為(1～2)×106個/ml，按照每孔2×103個的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至融合度達(dá)到80%，根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。先用無血清培養(yǎng)液稀釋脂質(zhì)體、miR-con、miR-31-5p、anti-miR-con和anti-miR-31-5p，取等體積的脂質(zhì)體和各組載體混合，室溫孵育20 min，加入到培養(yǎng)好的HeLa細(xì)胞中，混勻，培養(yǎng) 6 h，換成RPMI1640完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，驗證。

1.2.4Real-time PCR檢測RNA的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染或EEIHL處理的各組HeLa細(xì)胞，用Trizol試劑提取各組HeLa細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成的cDNA測定濃度和純度后置于-80℃保存。以cDNA為模板按照 real-time PCR的說明書進行反應(yīng)合成miR-31-5p，反應(yīng)程序為：95℃ 1 min；94℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 45 s，40個循環(huán)；72℃ 5 min。引 物 如 下：miR-31-5p RT primer：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCT-ATGCATAGCT-3′；miR-31-5p 上 游：5′-GCGCAGGCAAGATGCTCG-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCC-GAGGT-3′。運用Bio-Rad PCR系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5MTT實驗檢測細(xì)胞增殖 收集對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，用培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，以2×103個細(xì)胞/孔接種于96微孔板中，培養(yǎng)24 h，然后加入DMSO稀釋的EEIHL(終濃度分別為0、2、4、6和8 μg/ml)，0 μg/ml(對照)組加入含DMSO的培養(yǎng)液；繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄上清培養(yǎng)液，進行 MTT 實驗，每孔加入 50 μl(5 mg/ml)MTT，培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔再加入100 μl DMSO，振蕩使結(jié)晶溶解混勻5 min，酶標(biāo)儀測定490 nm 吸光度(A)值。增殖抑制率(%)=(1-給藥組A值/對照組A值)×100%。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率 收集對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，以2×105個細(xì)胞/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入終濃度分別為0(對照組)、2、4、6和8 μg/ml的EEIHL，培養(yǎng)48 h，胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，根據(jù)凋亡試劑盒說明書進行操作，加入300 μl 1×Binding buffer重懸細(xì)胞，加入5 μl的Annexin V-FITC染液 和10 μl 碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光20 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.2.7Western blot實驗 收集EEIHL處理或/和轉(zhuǎn)染48 h后的各組HeLa細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，收集蛋白并用BCA試劑盒檢測濃度。將蛋白樣本進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋的一抗(Cyclin D1抗體1∶8 000、Cleave-caspase-3抗體1∶1 000和β-actin抗體1∶4 000)，4℃孵育過夜。洗膜2次，然后加入稀釋的HRP酶標(biāo)二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，顯影成像，以β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1土木香提取物(EEIHL)可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖 采用0、2、4、6和8 μg/ml的土木香提取物(EEIHL)處理宮頸癌HeLa細(xì)胞48 h，結(jié)果表明，與0 μg/ml組相比，2 μg/ml、4 μg/ml、6 μg/ml和8 μg/ml EEIHL組對宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)，呈劑量依賴趨勢，在6 μg/ml 和8 μg/ml時達(dá)到最高抑制水平，見圖1。說明EEIHL可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖。

根據(jù)實驗結(jié)果，6 μg/ml和8 μg/ml的細(xì)胞抑制率基本相同，說明6 μg/ml時抑制率達(dá)到平臺期，選擇增殖抑制率差異較大的2 μg/ml和6 μg/ml的EEIHL濃度進行后續(xù)實驗。

圖1 MTT法檢測不同濃度土木香提取物(EEIHL)對宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of EEIHL on proliferation of cervical cancer cell HeLa was detected by MTT assayNote:*.P<0.05 vs 0 μg/ml group.

2.2土木香提取物(EEIHL)對宮頸癌細(xì)胞HeLa凋亡的影響 與0 μg/ml組相比，2 μg/ml和6 μg/ml EEIHL 組宮頸癌HeLa 細(xì)胞的凋亡率均顯著升高(P<0.05)，Cleave-caspase-3表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，且呈劑量依賴趨勢，在6 μg/ml和8 μg/ml時達(dá)到最高水平，見圖2和表1。說明EEIHL可促進宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡。

表1 Western blot檢測Cleave-caspase-3蛋白表達(dá)Tab.1 Expression of Cleave-caspase-3 protein was detec-ted by Western

Note:1)P<0.05 vs 0 μg/ml group.

圖2 不同濃度土木香提取物(EEIHL)對宮頸癌細(xì)胞HeLa凋亡的影響Fig.2 Effects of different concentrations of EEIHL on apoptosis of cervical cancer HeLa cellsNote:A and B.Apoptosis was detected by flow cytometry；C.The expression of Cleave-caspase-3 protein was detected by Western blot.*.P<0.05 vs 0 μg/ml group.

2.3土木香提取物(EEIHL)對miR-31-5p表達(dá)的影響 與0 μg/ml組相比，2 μg/ml和6 μg/ml EEIHL組宮頸癌HeLa細(xì)胞的miR-31-5p的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見表2。說明EEIHL可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞中miR-31-5p表達(dá)。

表2 不同濃度土木香提取物對miR-31-5p表達(dá)的影響Tab.2 Effects of different concentrations of EEIHL on expression of miR-31-5p in cervical cancer HeLa

Note:1)P<0.05 vs 0 μg/ml group.

2.4miR-31-5p低表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖和凋亡的影響 與anti-miR-con組相比，anti-miR-31-5p組HeLa細(xì)胞中miR-31-5p表達(dá)顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Cyclin D1蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，Cleave-caspase-3表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見圖3和表3。說明抑制miR-31-5p可抑制HeLa增殖并促進細(xì)胞凋亡。

圖3 miR-31-5p低表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖和凋亡的影響Fig.3 Effect of low expression of miR-31-5p on proliferation and apoptosis of cervical cancer cells HeLaNote:A.MTT assay was used to detect the inhibition rate of cell proliferateion;B and D.Cell apoptosis was detected by flow cytometry;C.Western blot was performed to detect the expression levels of Cyclin D1 and Cleave-caspase-3 proteins.*.P<0.05 vs NC group.

表3 miR-31-5p和CyclinD1、Cleave-caspase-3蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of miR-31-5p,CyclinD1 and

Note:1)P<0.05 vs anti-miR-con group.

2.5高表達(dá)miR-31-5p能夠逆轉(zhuǎn)土木香提取物對宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖和凋亡的影響(土木香提取物：6 μg/ml) 用6 μg/ml EEIHL處理HeLa細(xì)胞并過表達(dá)miR-31-5p，驗證EEIHL通過抑制miR-31-5p發(fā)揮宮頸癌抑制作用。結(jié)果表明，與NC組相比，EEIHL組的HeLa細(xì)胞中miR-31-5p和Cyclin D1蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，Cleave-caspase-3表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率顯著升高(P<0.05)；與EEIHL+miR-con組相比，EEIHL+miR-31-5p組的HeLa細(xì)胞中miR-31-5p和Cyclin D1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，Cleave-caspase-3表達(dá)降低(P<0.05)，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率顯著下降(P<0.05)，見圖4和表4。說明過表達(dá)miR-31-5p可逆轉(zhuǎn)EEIHL對HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的作用。

圖4 高表達(dá)miR-31-5p能夠逆轉(zhuǎn)土木香提取物對宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖和凋亡的影響Fig.4 Overexpression of miR-31-5p reversed effects of EEIHL on proliferation and apoptosis of HeLa cellsNote:A.MTT assay was used to detect the inhibition rate of cell proliferation；B and D：cell apoptosis was detected by flow cytometry；C.Western blot was used to detect the expression of CyclinD1 and cleave-caspase-3.*.P<0.05 vs NC group;#.P<0.05 vs EEIHL+miR-con group.

表4 miR-31-5p和CyclinD1、Cleave-caspase-3蛋白表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of miR-31-5p,CyclinD1 and

Note:1)P<0.05 vs NC group；2)P<0.05 vs EEIHL+miR-con group.

3 討論

中國城市年輕女性的宮頸癌死亡率正在以驚人的速度上升，每年新增宮頸癌病例約占全球新增病例的20%左右，死亡約3.05萬人[9]。轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者預(yù)后通常較差，而放化療的治療方式易產(chǎn)生耐受[10]，中藥在宮頸癌治療中可減輕放化療的不良反應(yīng)及耐藥性的產(chǎn)生等不良作用，抑制癌癥進展，增強機體免疫力[11]。而中藥對宮頸癌的抑制機制還不完全清楚。

土木香是菊科植物，具有健脾和胃、行氣止痛的功效，其化學(xué)成分主要為倍半萜內(nèi)酯類化合物、菊糖及少量的黃酮、氨基酸等，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗菌、抗腫瘤、保肝及驅(qū)蟲等作用[12]。Chun等[13]發(fā)現(xiàn)，土木香提取物可通過抑制STAT3信號通路抑制人乳腺異種移植瘤的生長。Koc等[14]研究表明，土木香提取物在200 μg/ml時不引起氧化應(yīng)激，可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-87MG增殖。土木香提取物(alantolactone，ALT)可通過抑制TrxR1活性誘導(dǎo)活性氧(ROS)的產(chǎn)生，從而激活p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，最終導(dǎo)致胃癌細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)抑制胃癌異種移植物的生長，且未表現(xiàn)明顯的毒性[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土木香提取物EEIHL可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖并促進細(xì)胞凋亡，呈劑量依賴趨勢，在6 μg/ml和8 μg/ml時達(dá)到最高增殖抑制率，說明土木香提取物EEIHL可抑制宮頸癌，驗證了土木香提取物的抗腫瘤作用。

但土木香抑癌的具體機制還不清楚。研究表明，白藜蘆醇可通過下調(diào)miR-31-5p表達(dá)進而抑制腸癌HCT116細(xì)胞增殖和促進細(xì)胞凋亡[6]，而miR-31在宮頸癌中高表達(dá)[7]，因此假設(shè)土木香通過下調(diào)miR-31-5p調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡。miR-31位于染色體9p21.3，在多種腫瘤中表達(dá)異常，發(fā)揮抑癌基因或癌基因的作用，不僅可以促進胰腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤的發(fā)展和進展，還可以抑制卵巢癌、前列腺癌等腫瘤的發(fā)生和誘導(dǎo)凋亡，可能通過與RAS/MARK、PI3K/AKT、RB/E2F等多種信號通路相互作用發(fā)揮功能[16]。Zheng等[17]發(fā)現(xiàn)，miR-31在宮頸癌患者和細(xì)胞中表達(dá)升高，起致癌基因的作用，促進癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤和人乳頭狀瘤病毒狀態(tài)呈正相關(guān)。Nan等[18]研究也發(fā)現(xiàn)，miR-31在宮頸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，靶向抑制BAP1進而促進宮頸癌細(xì)胞的增殖和EMT(細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化)，促進體內(nèi)異種移植瘤的生長發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，EEIHL可下調(diào)HeLa細(xì)胞中miR-31-5p的表達(dá)，抑制miR-31-5p可以抑制HeLa細(xì)胞增殖并促進細(xì)胞凋亡，與上述結(jié)果類似[17,18]；而為驗證EEIHL對HeLa細(xì)胞的抑制作用是通過抑制miR-31-5p實現(xiàn)的，我們過表達(dá)miR-31-5p，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-31-5p逆轉(zhuǎn)了EEIHL對HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用和凋亡促進作用，說明EEIHL通過下調(diào)miR-31-5p發(fā)揮抑制宮頸癌的作用。

綜上，本研究結(jié)果表明，土木香提取物EEIHL可能通過下調(diào)miR-31-5p表達(dá)抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖并促進細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制宮頸癌的目的。土木香提取物EEIHL對宮頸癌具有潛在治療作用，本研究為宮頸癌的中藥治療提供了新的研究方向。

本研究只進行了EEIHL在體外對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡影響的初步研究，尚有很多待今后進一步深入探索。比如，miR-31-5p對細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控的具體機制，EEIHL對宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移等是否有影響，以及EEIHL宮頸癌腫瘤的體內(nèi)動物實驗等，下一步將從以上等方面進行EEIHL對宮頸癌的體內(nèi)動物實驗及作用機制進行研究，進一步研究EEIHL對宮頸癌的抑制機制和臨床價值。