• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    松果菊苷改善膿毒癥大鼠的肝損傷和炎癥反應與激活Nrf通路相關(guān)①

    2020-02-29 02:23:38蘭戴天李茂德趙曉晨
    中國免疫學雜志 2020年4期
    關(guān)鍵詞:肝功能氧化應激

    蘭戴天 何 力 李茂德 趙 源 趙曉晨

    (四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院普外科,成都 610100)

    膿毒癥是一種由宿主對感染的反應失調(diào)引起,可導致全身炎癥和多器官功能障礙綜合征的致命性疾病。盡管使用了積極的外科治療、特定的抗生素和其他藥物制劑,膿毒癥與住院死亡率相關(guān)性仍高于10%[1]。膿毒癥發(fā)展和進展的主要病理生理機制在于中炎癥介質(zhì)和抗炎因子之間動態(tài)平衡的失調(diào)[2]。肝功能障礙和衰竭是膿毒癥的傳統(tǒng)并發(fā)癥,影響內(nèi)源性和外源性的生物轉(zhuǎn)化和運輸,是膿毒癥的早期和頻發(fā)事件[3]。雖然肝功能障礙的發(fā)生率比其他重要器官的功能障礙的發(fā)生率低40% 左右,但肝功能障礙患者的死亡率比膿毒癥引起的呼吸系統(tǒng)功能障礙(最常見的器官功能障礙)患者的膿毒癥死亡率高54%[4]。此外,有研究表明在肝病患者中,膿毒癥的發(fā)病率比普通ICU患者高30%~50%[4]??紤]到肝臟在膿毒癥發(fā)病、發(fā)展和結(jié)局中的關(guān)鍵作用,肝損傷是膿毒癥患者臨床管理中開發(fā)新的治療工具的重要目標。松果菊苷(Echinaco-side,ECH)是一種從中國傳統(tǒng)中藥肉蓯蓉中分離得到的苯乙醇苷類化合物(圖1),具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保護肝臟、保護神經(jīng)、改善學習記憶及調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[5],因此,預測松果菊苷可改善膿毒癥大鼠的肝損傷和炎癥反應。本文主要研究松果菊苷對膿毒癥大鼠的肝損傷和炎癥反應的作用及機制。

    圖1 松果菊苷的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of echinacoside

    1 材料與方法

    1.1材料 120 只體重為180~200 g的雌性Wistar大鼠,購自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司,許可證號:SYXK(川)2017-203。大鼠在25℃,12 h光照/12 h黑暗循環(huán)的飼養(yǎng)室,自由獲取水和食物。在實驗前1周開始適應性喂養(yǎng)。松果菊苷(HPLC≥98%,百靈威科技有限公司,貨號:82854-37-3),地塞米松(上海聯(lián)碩生物科技有限公司,貨號:D1756),蘇木素伊紅(Hematoxylin eosin,HE)染色試劑、過氧化氫酶檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶活性檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(索萊寶科技有限公司,貨號:G1120、BC0200、BC1190、BC0170),總蛋白定量測試盒、白蛋白含量測試盒、堿性磷酸酶試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、γ-谷氨酰環(huán)化轉(zhuǎn)移酶、IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(上海聯(lián)碩生物刻科技有限公司,貨號: ml016898、ml076981、ml016867、ml037336、ml016910、ml027458、ml037361、ml002813-1、ml00 2859),HMGB1 ELISA試劑盒(上海基免實業(yè)有限公司,貨號: JM-ELISA-0126),TBARS試劑盒(上海起發(fā)實驗試劑有限公司,貨號:0801192)。

    1.2方法

    1.2.1給藥及模型構(gòu)建 將大鼠分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)、松果菊苷低劑量組(ECH-L)、松果菊苷中劑量組(ECH-M)、松果菊苷高劑量組(ECH-H)、陽性對照組(DEX),每組20只。在造模前1 h,通過尾靜脈分別注射生理鹽水、松果菊苷25、50、100 mg/kg[6]、地塞米松10 mg/kg[7]。通過盲腸結(jié)扎和穿刺(cecal ligation and puncture,CLP)模式誘導膿毒癥[8]。簡單地說,通過腹膜內(nèi)注射15 mg/kg 氯胺酮和7.5 mg/kg甲苯噻嗪麻醉動物。然后,在前腹部正中切開3 cm,露出盲腸。將糞便拖至盲腸用5/0丙烯線結(jié)扎并固定在回盲部連接桿下方,但不能引起腸梗阻。用18號針頭將盲腸穿刺10次并稍微擠壓直至出現(xiàn)一小滴糞便。將盲腸重新放于腹腔,縫合傷口。假手術(shù)動物接受了相同的剖腹手術(shù),但沒有盲腸穿刺,并作為對照組。手術(shù)后不久,所有動物皮下注射2 ml 0.9% 氯化鈉溶液。

    1.2.2HE染色觀察肝損傷 肝臟固定在10%福爾馬林中,石蠟包埋,切成5 μm厚,二甲苯脫蠟,乙醇濃度降低時連續(xù)脫水。切片用蘇木精-伊紅染色,光鏡下觀察并使用ColorViewⅡ相機獲取20個隨機場(400倍放大)的圖像,并由兩名資深病理學家獨立評估肝臟損傷的組織形態(tài)學。

    1.2.3血清指標檢測肝功能 根據(jù)所提供的試劑盒手冊,評估血清總蛋白、白蛋白、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase,AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT),總膽紅素(total bilirubin,TBil)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyl transferase,γ-GT)的水平來分析肝功能。

    1.2.4肝臟氧化應激分析 根據(jù)所提供的試劑盒手冊,肝臟組織中丙二醛(malondialdehyde,MDA)和巰基水平,以及抗氧化酶過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)的活性來分析肝臟氧化應激情況。

    1.2.5炎癥因子檢測 按照ELISA試劑盒說明書操作:將樣品加入各反應孔,37℃ 反應 45 min 。接著用洗滌液洗滌 4 次,再分別加入生物素標記IL-1β、IL-6、TNF-α、HMGB1的抗體,在37℃孵育30 min。洗滌后加鏈霉親和素-HRP 混合均勻,在37℃ 反應 30 min。接著加入顯色劑避光顯色。最后加終止液終止反應,檢測結(jié)果。

    1.2.6流式細胞術(shù)分選CD8+和CD4+分離肝臟組織,將肝臟組織剪碎研磨,用200目鋼網(wǎng)研磨過濾,用紅細胞裂解液進行裂解 5 min,然后用33.75% Percoll分離純化細胞,2 000 r/min離心20 min,再用0.5% BSA-PBS緩沖液重懸。用PMA和離子霉素刺激細胞4 h,并用針對PE-CD8和FITC-CD4的熒光綴合的抗體染色。 在FACS Calibur流式細胞儀中分析CD8+和CD4+細胞的頻率。

    1.2.7蛋白印跡法檢測 在裂解緩沖液中提取總蛋白質(zhì),并用BCA測定試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。將10 μg蛋白樣品用10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。 用5%脫脂奶粉封閉膜,然后用一抗(NQO1 1∶500、HO-1 1∶500、Nrf2 1∶1 000)在4℃ 封閉過夜,接著加入對應辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育1 h,最后滴ECL曝光。以GAPDH為內(nèi)參,使用Quantity One軟件進行分析目標蛋白質(zhì)的相對表達水平。

    2 結(jié)果

    2.1松果菊苷改善膿毒癥大鼠的肝損傷 Sham組顯示正常大鼠的肝組織沒有炎癥、壞死的跡象;Model組大鼠的肝臟組織存在著明顯的水腫和炎癥細胞的浸潤;ECH各組隨著給藥濃度的增加,肝臟組織的水腫和炎癥細胞浸潤程度逐漸減輕(圖2)。

    圖2 HE染色觀察肝損傷程度Fig.2 Degree of liver injury was observed by HE staining

    2.2松果菊苷改善膿毒癥大鼠的肝功能 各組大鼠的血清總蛋白含量、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性無明顯變化。與Sham組相比,Model組大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶活性、總膽紅素含量明顯增加(P<0.05,圖3);與Model組相比,ECH-H組大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶活性、總膽紅素含量明顯減少(P<0.05,圖3),其他各組無明顯變化;說明高劑量的松果菊苷改善膿毒癥大鼠的肝功能。

    圖3 通過試劑盒檢測肝功能指標Fig.3 Liver function indicators detected by kitNote:A.Total protein content;B.γ-glutamyl transferase;C.Aspartate aminotransferase activity;D.Alanine aminotransferase activity;E.Alkaline phosphatase activity;F.Total bilirubin content;*.P<0.05 versus sham group;#.P<0.05 versus model group.

    2.3松果菊苷改善膿毒癥大鼠的肝氧化應激 與Sham組相比,Model組大鼠丙二醛含量明顯增加,過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶明顯減少(P<0.01,圖4);與Model組相比,ECH-L組大鼠丙二醛含量、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性無明顯變化,ECH-M組大鼠丙二醛含量明顯減少,過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶明顯增加(P<0.05,圖4),ECH-H組和DEX組大鼠丙二醛含量明顯減少,過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶明顯增加(P<0.01,圖4);說明高劑量的松果菊苷和地塞米松一樣能夠改善膿毒癥大鼠的肝氧化應激。

    圖4 通過試劑盒檢測肝氧化應激水平Fig.4 Liver oxidative stress levels were detected by each kitNote:A.Malondialdehyde content;B.Superoxide dismutase;C.Catalase;D.Glutathione peroxidation;**.P<0.01 versus sham group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus model group.

    2.4松果菊苷改善膿毒癥大鼠的炎癥反應 與Sham組相比,Model組大鼠炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、HMGB1含量增加,而CD4+、CD8+、CD4+/CD8+所占百分比均明顯減少(P<0.01,圖5、6);與Model組相比,ECH-L組大鼠炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、HMGB1含量及CD4+、CD8+、CD4+/CD8+所占百分比無明顯變化,ECH-M組大鼠炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、HMGB1含量減少而CD4+、CD8+、CD4+/CD8+所占百分比明顯增加(P<0.05,圖5、6),ECH-H組和DEX組大鼠炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、HMGB1含量減少、而CD4+、CD8+、CD4+/CD8+所占百分比明顯增加(P<0.01,圖5、6);說明高劑量的松果菊苷和地塞米松一樣能夠改善膿毒癥大鼠的炎癥反應。

    圖5 通過ELISA檢測相關(guān)炎癥因子表達水平Fig.5 Expression levels of inflammation-related factors were detected by ELISANote:A.TNF-α content was detected by ELISA;B.IL-6 content was detected by ELISA;C.IL-1β content was detected by ELISA;D.HMGB1 content was detected by ELISA;**.P<0.01 versus sham group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus model group.

    圖6 通過流式細胞術(shù)檢測肝臟CD8+和CD4+T細胞的比例Fig.6 Proportion of liver CD8+and CD4+T cells by flow cytometryNote:A.CD8+and CD4+were sorted by flow cytometry;B.Percentage of CD4+;C.Percentage of CD8+;D.CD4+/CD8+ratio;**.P<0.01 versus sham group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus model group.

    2.5松果菊苷激活膿毒癥大鼠Nrf2信號通路 轉(zhuǎn)錄因子核因子紅細胞2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid-2-related factor 2,Nrf2)信號通路是治療膿毒癥所致肝損傷過程中關(guān)鍵信息通路,通過蛋白印跡檢測Nrf2信號通路相關(guān)蛋白還原型輔酶/醌氧化還原酶[NAD(P) H:quinone oxidoreductase-1,NQO1]、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、Nrf2表達發(fā)現(xiàn):與Sham組相比,Model組大鼠NQO1、HO-1、Nrf2蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.01,圖7);與Model組相比,ECH-L組大鼠NQO1、HO-1、Nrf2蛋白表達無明顯變化,ECH-M組大鼠NQO1、HO-1、Nrf2蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05,圖7),ECH-H組大鼠NQO1、HO-1、Nrf2蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01,圖7);說明高劑量的松果菊苷激活膿毒癥大鼠Nrf2信號通路。

    圖7 通過蛋白印跡檢測NQO1、HO-1、Nrf2蛋白表達水平Fig.7 NQO1,HO-1,Nrf2 protein expression levels were detected by Western blotNote:**.P<0.01 versus sham group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus model group.

    3 討論

    膿毒癥是由如內(nèi)毒素、外毒素、病毒或成熟因子等多種因素引起的全身性炎癥反應,可激活強大的免疫反應,甚至免疫失調(diào),從而引起器官功能障礙和器質(zhì)損害。盡管在治療方法和重癥監(jiān)護方面有所改善,但膿毒癥的發(fā)生率和死亡率仍在繼續(xù)增加[9]。膿毒癥患者通常發(fā)生多器官功能衰竭,肺、肝、腎和心臟是嚴重受影響的器官,有研究表明,每增加一個器官的衰竭,患者死亡風險增加15%~20%[10]。肝功能障礙是一種與膿毒癥密切相關(guān)的臨床并發(fā)癥,并已作為嚴重膿毒癥和感染性休克的重癥患者高死亡率的有力預測因子[11]。本研究發(fā)現(xiàn),松果菊苷能夠明顯降低膿毒癥大鼠的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶活性、總膽紅素含量。其中,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測指標;堿性磷酸酶是一種經(jīng)肝臟向膽外排出的酶,是診斷膽道系統(tǒng)疾病時常用的指標;總膽紅素是膽汁的重要成分之一,臨床上主要用于診斷肝臟疾病和膽道梗阻。且已有研究表明松果菊苷對小鼠急性肝損傷具有明顯的保護作用[12],這與本文研究結(jié)果相一致。

    有證據(jù)證實氧化應激是膿毒癥的一個病理過程,它會損害細胞功能,最終導致多個器官功能障礙。因此,人們提出了幾種抗氧化處理方法,并取得了成功。如,褪黑素通過抗氧化治療膿毒癥后肝功能損害[13]。本文研究表明松果菊苷能減少膿毒癥大鼠肝組織中丙二醛含量,增加過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性,從而改善膿毒癥大鼠的肝氧化應激,進而減輕膿毒癥后肝功能損害。

    膿毒癥肝損傷的主要原因是炎癥介質(zhì)的過度生成。在膿毒癥中,肝細胞尤其是庫普弗細胞被微生物因子激活,激活庫普弗細胞產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)如IL-1β、IL-6和TNF-α等[14]。這些介質(zhì)或被釋放到體循環(huán)中介導多器官損傷,或通過旁分泌介導肝損傷與肝細胞和竇內(nèi)皮細胞相互作用。已有研究表明,抑制肝臟炎癥可減輕肝損傷,降低膿毒癥的發(fā)病率和死亡率[15]。在膿毒癥炎癥的初始階段,TNF-α是第一個釋放的促炎因子。IL-1β和IL-6的持續(xù)增加表明膿毒癥的預后不良。晚期的炎癥反應可以通過單核巨噬細胞激活HMGB1的大量分泌。本文研究發(fā)現(xiàn),松果菊苷能減少膿毒癥大鼠肝組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、HMGB1含量。促炎和抗炎不平衡導致膿毒癥的發(fā)生,T淋巴細胞亞群在一定程度上可針對細胞免疫狀態(tài)誘導相應的反應。膿毒癥會引起CD4+和CD8+含量的下降,據(jù)報道,CD4+/CD8+下降表明膿毒癥加重且預后較差[16]。CD4+T 細胞為輔助/誘導T淋巴細胞,其在細胞免疫反應方面作用的發(fā)揮主要是通過分泌細胞因子和趨化因子的激活和(或) 募集靶細胞來實現(xiàn)。CD4+T細胞在多種病原微生物膿毒癥中具有啟動免疫反應的作用,促進早期病原菌細胞的清除,從而減輕膿毒癥引起的器官損傷[17]。CD8+T 細胞在抗胞內(nèi)感染的免疫機制中,細胞殺傷效應占重要地位,能識別和溶解靶細胞,殺傷病原體,對細胞內(nèi)病原體產(chǎn)生有效和持久的免疫應答。CD4+、CD8+的變化基本可以反映膿毒癥患者的細胞免疫狀況。本文研究發(fā)現(xiàn),松果菊苷能增加膿毒癥大鼠CD4+和CD8+含量,并增加CD4+/CD8+,說明松果菊苷能通過調(diào)節(jié)免疫反應來減輕膿毒癥。

    治療膿毒癥肝損傷的有效途徑之一就是Nrf2信號通路,如骨髓間充質(zhì)干細胞通過激活Nrf2信號通路改善膿毒癥模型大鼠肝臟損傷[3]。Nrf2由NFE2L2基因編碼,是堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子。在靜止條件下,Nrf2通過其阻遏型kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)保持在細胞質(zhì)中,并通過酶降解將其除去。當細胞暴露于氧化應激、炎癥等有害攻擊時,Nrf2從Keap1解離并轉(zhuǎn)化為細胞核,在那里它與其下游基因啟動子內(nèi)的抗氧化反應元件(anti-oxidant response element,ARE)結(jié)合,包括尿苷5′-二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶,還原型輔酶/醌氧化還原酶[NAD(P) H:quinone oxidoreductase-1,NQO1],血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1),谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶,谷氨酸半胱氨酸連接酶和谷胱甘肽過氧化物酶等[18]。這些基因中的大多數(shù)是重要的抗氧化酶和細胞保護基因。Nrf2通過與ARE結(jié)合可以上調(diào)NQO1的表達,進而調(diào)節(jié)抗氧化和炎癥細胞因子。HO-1被認為是血紅素降解的初始和限速酶的誘導型同種型,有助于免疫調(diào)節(jié)和抗炎功能,可以通過Nrf2核轉(zhuǎn)位來調(diào)節(jié)氧化應激反應和炎癥反應[19]。已有研究表明,松果菊苷通過Nrf2/HO-1依賴途徑保護血管內(nèi)皮細胞免受高糖誘導的氧化應激[20]。本文研究發(fā)現(xiàn),松果菊苷改善膿毒癥大鼠的肝損傷和炎癥反應與激活Nrf通路相關(guān)。

    綜上所述,松果菊苷能夠減輕肝損傷,改善肝功能、肝氧化應激和炎癥反應,并激活Nrf通路,分子機制還有待進一步研究。本文為松果菊苷的開發(fā)利用提供參考數(shù)據(jù),為膿毒癥的預防和治療奠定基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    肝功能氧化應激
    重視肝功能正常的慢性HBV感染者
    肝博士(2024年1期)2024-03-12 08:38:08
    肝功能報告單解讀
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:58
    基于炎癥-氧化應激角度探討中藥對新型冠狀病毒肺炎的干預作用
    氧化應激與糖尿病視網(wǎng)膜病變
    慢性乙肝患者HBV-DNA、HBeAg及肝功能的關(guān)系分析
    尿酸對人肝細胞功能及氧化應激的影響
    乙肝病毒S蛋白對人精子氧化應激的影響
    氧化應激與結(jié)直腸癌的關(guān)系
    注射用頭孢呋辛鈉靜脈滴注致肝功能損害1例
    拉米夫定在乳腺癌化療期間對肝功能的作用
    a 毛片基地| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产黄频视频在线观看| 日韩av免费高清视频| 精品少妇内射三级| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 香蕉国产在线看| www.精华液| 无限看片的www在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 国产免费现黄频在线看| 亚洲伊人久久精品综合| 美国免费a级毛片| 亚洲精品国产区一区二| 捣出白浆h1v1| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲精品日本国产第一区| 男女午夜视频在线观看| 亚洲av电影在线进入| 在线观看免费午夜福利视频| 一级毛片女人18水好多 | 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 美女国产高潮福利片在线看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲欧美精品自产自拍| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品久久久久成人av| av线在线观看网站| 国产男女超爽视频在线观看| 精品久久蜜臀av无| 九色亚洲精品在线播放| 国产高清国产精品国产三级| 国产日韩欧美视频二区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产成人av激情在线播放| 脱女人内裤的视频| 热re99久久精品国产66热6| 新久久久久国产一级毛片| 国产av一区二区精品久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 成人亚洲欧美一区二区av| 99精品久久久久人妻精品| 9色porny在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 免费看不卡的av| 麻豆av在线久日| 男女高潮啪啪啪动态图| 另类精品久久| 色94色欧美一区二区| 免费在线观看黄色视频的| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精品一区蜜桃| 大型av网站在线播放| 2018国产大陆天天弄谢| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 午夜免费观看性视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 日韩,欧美,国产一区二区三区| 香蕉国产在线看| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 99热全是精品| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 一区在线观看完整版| 脱女人内裤的视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 大陆偷拍与自拍| 久久这里只有精品19| 亚洲成人手机| 天天影视国产精品| 这个男人来自地球电影免费观看| av在线播放精品| 午夜视频精品福利| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 日本一区二区免费在线视频| 老司机深夜福利视频在线观看 | 大型av网站在线播放| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美日韩黄片免| 国产在线视频一区二区| 在线观看免费午夜福利视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产一卡二卡三卡精品| 久9热在线精品视频| 国产av国产精品国产| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲精品国产色婷婷电影| 秋霞在线观看毛片| 国产一区二区激情短视频 | 一本久久精品| 人妻 亚洲 视频| 欧美精品一区二区大全| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久精品国产a三级三级三级| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 一本色道久久久久久精品综合| 老司机亚洲免费影院| 精品国产一区二区三区四区第35| 一区二区三区精品91| 日本av手机在线免费观看| 老汉色∧v一级毛片| 啦啦啦 在线观看视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 午夜日韩欧美国产| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久精品成人免费网站| 我的亚洲天堂| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久久久久久久免费视频了| 97在线人人人人妻| 又大又爽又粗| 亚洲,一卡二卡三卡| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 欧美在线一区亚洲| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲专区中文字幕在线| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 男女国产视频网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品一区二区在线观看99| 七月丁香在线播放| 亚洲熟女毛片儿| 欧美日本中文国产一区发布| 桃花免费在线播放| 狂野欧美激情性bbbbbb| 精品人妻在线不人妻| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美日韩黄片免| 精品亚洲成国产av| tube8黄色片| 1024香蕉在线观看| 成人免费观看视频高清| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲成国产人片在线观看| 国精品久久久久久国模美| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产野战对白在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 一级片免费观看大全| 亚洲伊人久久精品综合| 天堂8中文在线网| a 毛片基地| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产精品.久久久| 人人妻人人澡人人看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 精品人妻在线不人妻| 久9热在线精品视频| 一本综合久久免费| 亚洲av美国av| 国产成人欧美在线观看 | 一级片免费观看大全| 黄色a级毛片大全视频| av天堂在线播放| 99国产精品一区二区蜜桃av | 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 永久免费av网站大全| 精品第一国产精品| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产亚洲精品久久久久5区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 一本综合久久免费| 精品人妻一区二区三区麻豆| 大香蕉久久网| 男人操女人黄网站| 大片免费播放器 马上看| 韩国精品一区二区三区| 色94色欧美一区二区| 国产色视频综合| 国产人伦9x9x在线观看| 国产精品免费大片| 少妇人妻 视频| 精品第一国产精品| 亚洲五月色婷婷综合| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲精品美女久久av网站| 日韩av在线免费看完整版不卡| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久精品国产综合久久久| 亚洲欧美激情在线| 国产主播在线观看一区二区 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 老司机深夜福利视频在线观看 | 国产高清视频在线播放一区 | 国产精品国产av在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 免费一级毛片在线播放高清视频 | 久久久久久久久久久久大奶| 丝袜美足系列| 国产高清视频在线播放一区 | e午夜精品久久久久久久| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲国产精品一区三区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 新久久久久国产一级毛片| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久99一区二区三区| 久久99热这里只频精品6学生| 少妇精品久久久久久久| bbb黄色大片| 九色亚洲精品在线播放| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 啦啦啦在线免费观看视频4| 美女午夜性视频免费| 波多野结衣一区麻豆| 女性被躁到高潮视频| 日本黄色日本黄色录像| av一本久久久久| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久久亚洲精品成人影院| 午夜日韩欧美国产| 日本黄色日本黄色录像| 国产男人的电影天堂91| 手机成人av网站| 精品一品国产午夜福利视频| 成人黄色视频免费在线看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产一区二区三区综合在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 一边摸一边做爽爽视频免费| 宅男免费午夜| 精品国产一区二区久久| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 欧美成人午夜精品| 亚洲av日韩在线播放| 日日摸夜夜添夜夜爱| 80岁老熟妇乱子伦牲交| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲av综合色区一区| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲色图综合在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 一区二区三区精品91| 欧美性长视频在线观看| 老司机影院毛片| 成人影院久久| 亚洲第一av免费看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 18禁观看日本| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 免费观看人在逋| 免费在线观看日本一区| 久久亚洲国产成人精品v| 777米奇影视久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久精品成人免费网站| 老司机在亚洲福利影院| 日本a在线网址| 国产成人免费无遮挡视频| 人妻 亚洲 视频| 成人国产av品久久久| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 成人午夜精彩视频在线观看| 婷婷丁香在线五月| 久久久国产欧美日韩av| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产高清视频在线播放一区 | 欧美久久黑人一区二区| 两个人免费观看高清视频| 最新在线观看一区二区三区 | 亚洲五月婷婷丁香| 又紧又爽又黄一区二区| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲av日韩在线播放| 大片免费播放器 马上看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 777米奇影视久久| 亚洲图色成人| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产精品国产三级国产专区5o| 日韩av免费高清视频| 亚洲伊人色综图| 69精品国产乱码久久久| 婷婷色av中文字幕| 一级片免费观看大全| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| av在线播放精品| 宅男免费午夜| 制服人妻中文乱码| 亚洲视频免费观看视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 少妇精品久久久久久久| 老司机午夜十八禁免费视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 香蕉国产在线看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 七月丁香在线播放| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 伊人亚洲综合成人网| 又黄又粗又硬又大视频| 99国产综合亚洲精品| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 高清视频免费观看一区二区| 黄片播放在线免费| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美久久黑人一区二区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产人伦9x9x在线观看| kizo精华| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久狼人影院| 一边亲一边摸免费视频| h视频一区二区三区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产在线观看jvid| 99久久精品国产亚洲精品| 成年av动漫网址| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲三区欧美一区| 久久精品亚洲av国产电影网| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 丝袜人妻中文字幕| 国产日韩欧美视频二区| 91国产中文字幕| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久精品久久久久久久性| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 九色亚洲精品在线播放| 免费看十八禁软件| 国产视频一区二区在线看| 伊人亚洲综合成人网| 久久久久网色| 电影成人av| 一本大道久久a久久精品| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产麻豆69| 丝袜在线中文字幕| 免费在线观看黄色视频的| 欧美 日韩 精品 国产| 中文欧美无线码| 秋霞在线观看毛片| 久久精品亚洲av国产电影网| 老汉色∧v一级毛片| 日本av免费视频播放| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 五月开心婷婷网| 国产亚洲欧美精品永久| 一级a爱视频在线免费观看| 另类亚洲欧美激情| 午夜老司机福利片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品熟女久久久久浪| 成年美女黄网站色视频大全免费| 女性被躁到高潮视频| 满18在线观看网站| 丝袜脚勾引网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品一区二区精品视频观看| 麻豆av在线久日| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 日韩av不卡免费在线播放| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产亚洲一区二区精品| 69精品国产乱码久久久| 丝瓜视频免费看黄片| 一区二区av电影网| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 亚洲成人国产一区在线观看 | 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产免费一区二区三区四区乱码| 香蕉丝袜av| 我要看黄色一级片免费的| 成年美女黄网站色视频大全免费| 丝袜脚勾引网站| 日韩人妻精品一区2区三区| 久热爱精品视频在线9| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲av成人精品一二三区| 老熟女久久久| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧美另类一区| 深夜精品福利| 国产免费视频播放在线视频| 国产熟女欧美一区二区| 免费日韩欧美在线观看| 国产精品 国内视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产精品一国产av| 老熟女久久久| 91麻豆av在线| 赤兔流量卡办理| av天堂久久9| 在线精品无人区一区二区三| 久久国产亚洲av麻豆专区| 成人免费观看视频高清| 又黄又粗又硬又大视频| 国产精品 国内视频| 国产日韩欧美视频二区| av福利片在线| 在线观看人妻少妇| 多毛熟女@视频| 亚洲精品一二三| 黄片播放在线免费| 色94色欧美一区二区| 人妻人人澡人人爽人人| 永久免费av网站大全| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久99精品国语久久久| 亚洲专区中文字幕在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 精品国产一区二区三区四区第35| av天堂久久9| 99re6热这里在线精品视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 午夜福利在线免费观看网站| 欧美国产精品va在线观看不卡| av网站免费在线观看视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久九九热精品免费| 亚洲伊人色综图| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 男女床上黄色一级片免费看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产高清不卡午夜福利| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 晚上一个人看的免费电影| 老司机午夜十八禁免费视频| 美女中出高潮动态图| av天堂久久9| 在线天堂中文资源库| 亚洲欧美一区二区三区久久| av网站免费在线观看视频| 亚洲成人免费电影在线观看 | 久久久久久久大尺度免费视频| 女警被强在线播放| 少妇精品久久久久久久| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲久久久国产精品| 中文字幕高清在线视频| 国产成人精品久久二区二区91| 国产视频一区二区在线看| 99精品久久久久人妻精品| av天堂在线播放| 女警被强在线播放| 亚洲精品国产av蜜桃| 精品一区二区三区四区五区乱码 | a级毛片在线看网站| av不卡在线播放| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久久久久人人人人人| 狂野欧美激情性xxxx| 少妇的丰满在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产99久久九九免费精品| 天天添夜夜摸| 一二三四在线观看免费中文在| 大香蕉久久成人网| 亚洲精品一区蜜桃| svipshipincom国产片| 精品少妇黑人巨大在线播放| 午夜福利影视在线免费观看| 麻豆av在线久日| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美黄色淫秽网站| 日韩电影二区| 久久青草综合色| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日本色播在线视频| 波多野结衣av一区二区av| www.熟女人妻精品国产| 亚洲中文av在线| 老司机亚洲免费影院| 亚洲五月婷婷丁香| av在线app专区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲成人国产一区在线观看 | 伊人亚洲综合成人网| 蜜桃国产av成人99| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久久欧美国产精品| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 又紧又爽又黄一区二区| 午夜老司机福利片| 在线观看免费视频网站a站| 精品少妇久久久久久888优播| 国产精品av久久久久免费| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 日韩伦理黄色片| 在线观看一区二区三区激情| 青青草视频在线视频观看| 人体艺术视频欧美日本| 久久人人爽人人片av| 黄色片一级片一级黄色片| 国产淫语在线视频| 一级毛片女人18水好多 | 性色av一级| 性少妇av在线| 宅男免费午夜| 精品久久久精品久久久| 久久精品成人免费网站| 国产在线一区二区三区精| 夫妻午夜视频| 色94色欧美一区二区| 水蜜桃什么品种好| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | cao死你这个sao货| 久久久久久人人人人人| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲国产日韩一区二区| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 午夜免费鲁丝| 51午夜福利影视在线观看| 另类精品久久| 777米奇影视久久| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 成年人黄色毛片网站| 久久久久久久久免费视频了| 国产伦人伦偷精品视频| 少妇精品久久久久久久| 免费看不卡的av| 成人影院久久| 欧美激情极品国产一区二区三区| 男男h啪啪无遮挡| 丝袜美腿诱惑在线| 丝袜脚勾引网站| 国产精品成人在线| 成年av动漫网址| 91麻豆av在线| 国产一区二区三区av在线| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 中国美女看黄片| 在线观看www视频免费| 欧美日韩一级在线毛片| 成年av动漫网址| 桃花免费在线播放| 欧美av亚洲av综合av国产av| 少妇的丰满在线观看| 欧美97在线视频| 国产成人啪精品午夜网站| 久久毛片免费看一区二区三区| 色播在线永久视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久综合国产亚洲精品| 欧美xxⅹ黑人| 国产欧美日韩一区二区三区在线| svipshipincom国产片| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲精品在线美女| 91麻豆av在线| 女性生殖器流出的白浆| 国产视频一区二区在线看| 在线av久久热| 捣出白浆h1v1| 水蜜桃什么品种好| 免费不卡黄色视频| 亚洲久久久国产精品| a级毛片黄视频| 少妇人妻 视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 波多野结衣一区麻豆| 欧美黑人精品巨大| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 精品一区二区三卡| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲人成电影观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 一区二区三区四区激情视频| 一级,二级,三级黄色视频| 新久久久久国产一级毛片| 校园人妻丝袜中文字幕| cao死你这个sao货| 97在线人人人人妻| xxxhd国产人妻xxx| 男女边摸边吃奶| tube8黄色片| 国产1区2区3区精品| 18在线观看网站| 国产xxxxx性猛交| 国产成人精品久久二区二区免费| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲精品在线美女| 日本一区二区免费在线视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 后天国语完整版免费观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产成人免费观看mmmm| 中文字幕亚洲精品专区| 欧美精品一区二区免费开放| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| e午夜精品久久久久久久| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 9色porny在线观看| 亚洲中文av在线| 丝袜美足系列| 亚洲视频免费观看视频|