miR-143-3p靶向TREM1基因?qū)钳徯阅I炎小鼠腎小球系膜細(xì)胞炎性因子分泌及凋亡的調(diào)控機(jī)制

羅慧臣 胡丹慧 張 濟(jì)

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，衡陽(yáng) 421001)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是臨床上常見(jiàn)的一種由遺傳、免疫反應(yīng)、激素、感染等因素共同作用的自身免疫性疾病[1]。狼瘡腎炎(lupus nephritis,LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，也是引起患者殘疾和死亡的重要因素[2]。LN常見(jiàn)的病理特征包括腎小球系膜細(xì)胞炎性因子的過(guò)度分泌、細(xì)胞增殖不斷增加等[3]。因此探究LN中炎性因子的變化以及可能對(duì)其進(jìn)行調(diào)控的途徑對(duì)于明確LN的發(fā)病以及LN的治療均具有重要意義。

髓細(xì)胞觸發(fā)受體1基因(triggering receptor expressed by myeloid cells-1,TREM1)是多核細(xì)胞中的炎性受體，其能夠向細(xì)胞內(nèi)激活接頭發(fā)出信號(hào)進(jìn)而作用于下游通路[4]。TREM1也被稱為炎性因子的放大器，在慢性炎癥性腸炎等炎癥疾病患者血清中表達(dá)顯著提高[5]。也有研究證實(shí)TREM1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[6]。此外，中科院北京基因組研究所發(fā)現(xiàn)，TREM1的同源基因，TREML2可能對(duì)自身免疫性疾病的發(fā)病具有遺傳影響[7]。個(gè)體免疫系統(tǒng)失調(diào)往往導(dǎo)致炎性反應(yīng)，而炎癥體在自身免疫性疾病中也發(fā)揮重要作用。miR-143經(jīng)以往研究證實(shí)能夠?qū)Χ喾N炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，如Pekow等[8]發(fā)現(xiàn)，miR-143在潰瘍性結(jié)腸炎中表達(dá)被顯著下調(diào)，miR-143的缺失能夠促進(jìn)慢性炎癥的進(jìn)展。也有研究證實(shí)，miR-143能夠靶向ATG2B進(jìn)而抑制克羅恩病中自噬和炎癥反應(yīng)[9]。本研究旨在探討miR-143-3p靶向TREM1基因在狼瘡性腎炎小鼠腎系膜細(xì)胞炎性因子分泌以及細(xì)胞凋亡中的作用并探討其調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 雄性MRL/faslpr小鼠及MRL/MPJ小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所；pcDNA3.1(+)質(zhì)粒購(gòu)自Addgene；高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶；所有抗體均購(gòu)自ABCAM；熒光素酶試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioVision；Lipofectamin 3000試劑盒、CCK-8試劑盒、Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾；細(xì)胞裂解液、BCA試劑盒購(gòu)自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司；CytomicsTMFC 500流式細(xì)胞儀購(gòu)自德國(guó)貝克曼；HBS-1096A酶標(biāo)儀購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KH-FL20E液相色譜熒光檢測(cè)器購(gòu)自上海科哲生化科技有限公司；FRD-4C倒置顯微鏡購(gòu)自北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1TREM1沉默載體構(gòu)建 在NCBI的Nucleotide上獲取小鼠TREM1的1號(hào)轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)序列(NM_021406.5)，隨后在BLOCK-iTTMRNAi Designer(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rna-iexpress/)設(shè)計(jì)1對(duì)shRNA序列(5′-CACCGCCA-GACTTTGACAGTGAAGTCGAAACTTCACTGTCAAAG-TCTGGC-3′)及1對(duì)陰性對(duì)照序列(5′-CCGGCCTAA-GGTTAAGTCGCCCTCCTCGAGGAGGGCGACTTAAC-CTTAGGTTTTTG-3′)，隨后交由華大基因合成并在兩端分別添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。質(zhì)粒pcDNA3.1(+)用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切并回收大片段。取適量合成序列與大片段用T4 DNA連接酶連接過(guò)夜，溫度4℃。隨后轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌中進(jìn)行克隆，使用氨芐青霉素進(jìn)行抗性菌落的篩選。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，采用DNA大量抽提試劑盒提取大腸桿菌中重組載體，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2腎小球系膜細(xì)胞分離純化 雄性MRL/faslpr小鼠15只(狼瘡性腎炎模型組)及健康雄性MRL/MPJ小鼠5只(正常對(duì)照組)購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，周齡11～12周，體重18～22 g，于SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，小鼠自由進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)條件：相對(duì)溫度(20±2)℃，相對(duì)濕度(50±2)%，陰暗和光照各12 h。每周收集24 h尿量，以尿八聯(lián)試紙測(cè)定尿蛋白，濃度大于0.1～1 mg/L提示狼瘡性腎炎發(fā)病[10]。發(fā)病小鼠和正常小鼠均腹腔注射1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)溶液進(jìn)行麻醉后處死。無(wú)菌收集小鼠兩側(cè)腎臟及外周血，隨后將發(fā)病小鼠剝離腎皮質(zhì)剪成1 mm × 1 mm的碎末并使用1 mg/ml膠原酶37℃水浴消化30 min。之后培養(yǎng)基終止消化；研磨消化產(chǎn)物后收集過(guò)篩液體并在4℃下1 000 r/min離心5 min。棄上清，加入含F(xiàn)BS的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸腎小球細(xì)胞液。37℃，5%CO2條件下用Ⅰ型膠原蛋白包被過(guò)的培養(yǎng)皿孵育2 d。待培養(yǎng)皿中細(xì)胞匯合度為70%時(shí)，2.5 g/L胰酶消化2 min，隨后迅速加入適量完全培養(yǎng)基終止消化，重復(fù)多次輕輕吹打細(xì)胞使其懸浮，之后置于37℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。每隔36 h換液傳代，傳至4～6次即可得純化的腎小球系膜細(xì)胞。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批同意。

1.2.3免疫組化染色 制備發(fā)病及正常小鼠腎臟組織的石蠟切片，隨后在60℃烘烤2 h，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，PBS洗滌4次，每次2 min；高壓抗原修復(fù)2 min，在pH6.0的0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中浸泡3 h，水浴30 min；將切片浸泡于3%的雙氧水溶液中15 min從而阻斷外源過(guò)氧化物酶活性；室溫下山羊血清封閉15 min，再與一抗TREM1在4℃條件下孵育過(guò)夜；PBS洗滌3次，每次2 min，室溫下加入二抗IgG孵育30 min；反應(yīng)產(chǎn)物用DAB顯色3 min，再用流水沖洗3次，蘇木素復(fù)染20 s，流水沖洗多余染液；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。對(duì)組織染色強(qiáng)度(SI)及陽(yáng)性細(xì)胞率(PP)進(jìn)行評(píng)分。SI分為4級(jí)：0分為無(wú)色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。PP分為5級(jí)：0分為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞<5%，1分為陽(yáng)性細(xì)胞5%～25%，2級(jí)為25%～50%，3級(jí)為51%～75%，4級(jí)為>75%。綜合評(píng)分為SI與PP乘積，0為陰性，1分為弱陽(yáng)性(+)，2分為中陽(yáng)性(++)，大于3分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)[11]。

1.2.4雙熒光素酶驗(yàn)證miR-143-3p與TREM1靶向關(guān)系 借助Targetscan靶向關(guān)系預(yù)測(cè)網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/mamm_31/)預(yù)測(cè)miR-143-3p與TREM1的結(jié)合位點(diǎn)，雙酶切將TREM1的3′UTR 片段克隆到熒光素酶報(bào)告基因pmirGLO上游，命名為TREM1-3′UTR-WT。挑菌、測(cè)序后提純質(zhì)粒備用。對(duì)miR-143-3p與TREM1的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建TREM1-3′UTR-MUT突變載體。依據(jù)LipofectamineTM3000說(shuō)明書，將miR-143-3p mimic和mimic NC分別與TREM1-3′UTR-WT及TREM1-3′UTR-MUT兩兩共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后4 h換液，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，收獲細(xì)胞。按照Promega公司雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說(shuō)明書中的要求，借助化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)。熒光素酶活性=螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.2.5系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將狼瘡性腎炎小鼠腎小球系膜細(xì)胞分為如下幾組：mimic NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染含mimic NC的脂質(zhì)體)、miR-143-3p mimic組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染含miR-143-3p mimic的脂質(zhì)體)、sh-TREM1組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染含TREM1 shRNA質(zhì)粒的脂質(zhì)體)、sh-NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染含shRNA NC質(zhì)粒的脂質(zhì)體)、miR-143-3p mimic+sh-TREM1組(細(xì)胞共轉(zhuǎn)染含TREM1 shRNA和miR-143-3p mimic的脂質(zhì)體)

轉(zhuǎn)染方式：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎小球系膜細(xì)胞接種至6孔板，待細(xì)胞密度50%左右時(shí)依據(jù)Lipofectamin 3000說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。首先使用250 μl不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM分別稀釋100 pmol miR-143-3p mimic(終濃度50 nmol/L)以及5 μl Lipofectamin 3000，混勻后室溫孵育5 min，之后將以上混合物再次混合在一起，孵育20 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)孔，5%CO2培養(yǎng)6～8 h，更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24～48 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6Western blot檢測(cè)系膜細(xì)胞釋放的炎性因子 于各組系膜細(xì)胞中加入1 ml細(xì)胞裂解液(裂解液組成：50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L EDTA、0.1%SDS、1%NP-40、5 μg/ml Aprotinin、2 mmol/L PMSF)，之后將其置冰浴上研成勻漿，加入蛋白裂解液，于4℃條件下裂解30 min，每隔10 min 振搖一次。4℃，12 000 r/min離心20 min，棄除脂層，取上清液采用BCA試劑盒測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白濃度，去離子水調(diào)整上樣量為30 μg蛋白/泳道。配制10%SDS分離膠與濃縮膠。樣品與上樣緩沖液混合，100℃煮沸5 min，冰浴、離心后用微量加樣器等量加入各泳道進(jìn)行電泳分離，再將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉4℃封閉硝酸纖維素膜過(guò)夜。加入稀釋的一抗核因子κB p65(nuclear factor kappa-B p65，NF-κB p65)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1)或TREM1孵育過(guò)夜，室溫下PBS 洗滌3次，每次5 min。滴加HRP標(biāo)記的IgG二抗37℃振蕩孵育1 h。室溫下PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min。膜與ECL液在室溫下反應(yīng)1 min。吸去液體，覆蓋保鮮膜，拍攝X光片，觀察結(jié)果。以GAPDH為內(nèi)參，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶的灰度值之比作為蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7CCK8測(cè)定系膜細(xì)胞活力 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%左右，PBS沖洗2遍，使用濃度為0.25%的胰酶消化細(xì)胞，之后將細(xì)胞懸液以4×103個(gè)/孔的密度接種至96孔板，各孔體積0.2 ml，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別在培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時(shí)取出培養(yǎng)板并加入含10%CCK8溶液(5 g/L)的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸取上清后每孔加入100 μl二甲基亞砜，振蕩混勻使其充分溶解活細(xì)胞產(chǎn)生的甲瓚晶體。之后使用酶標(biāo)儀對(duì)各孔490 nm處吸光度值進(jìn)行檢測(cè)并繪制細(xì)胞活力曲線，橫坐標(biāo)為時(shí)間點(diǎn)，縱坐標(biāo)為OD值。

1.2.8PI單染法檢測(cè)系膜細(xì)胞周期 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，0.25%胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心 5 min棄上清，冷PBS洗滌細(xì)胞3次，離心棄上清，PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整其濃度在1×104ml-1左右。將2 ml 濃度為75%的乙醇置于-20℃預(yù)冷，之后用于固定細(xì)胞，4℃條件下固定30 min，離心后棄乙醇，PBS沖洗，之后加入100 μl RNase A，在37℃、避光條件下水浴30 min，加入400 μl PI染液，混勻后置于4℃避光條件下30 min，流式細(xì)胞儀記錄激發(fā)波長(zhǎng)在488 nm處紅色熒光以檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.9Annexin-V FITC/PI雙染檢測(cè)系膜細(xì)胞凋亡 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，使用0.25%不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，調(diào)整細(xì)胞濃度在1×104ml-1，取1 ml細(xì)胞懸液，離心后棄上清。冷PBS沖洗，再次離心棄上清。依據(jù)Annexin-V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明書，將Annexin-V-FITC、PI、HEPES緩沖液按照1∶2∶50的比例混勻配制Annexin-V-FITC/PI染液。100 μl染液重懸1×106個(gè)細(xì)胞，振蕩混勻后室溫孵育15 min。以488 nm波長(zhǎng)激發(fā)515 nm、620 nm濾光片分別檢測(cè)FITC、PI熒光從而檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。左上象限代表細(xì)胞收集過(guò)程中的損傷細(xì)胞，左下象限代表正常細(xì)胞，右上象限為晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1光鏡下觀察腎系膜細(xì)胞 倒置顯微鏡下觀察分離純化后傳至5代的腎系膜細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞體積較大，多為多角形或梭形，胞質(zhì)多突起，細(xì)胞核位于中央，多呈圓形或橢圓形。見(jiàn)圖1。

圖1 光鏡下觀察腎系膜細(xì)胞(×100)Fig.1 Mesangial cells were detected under optical microscope(×100)

2.2免疫組化染色結(jié)果 免疫組化染色檢測(cè)狼瘡性腎炎小鼠及正常對(duì)照腎組織中TREM1的表達(dá)。結(jié)果顯示：TREM1主要表達(dá)于細(xì)胞核中。與正常小鼠相比(+)，狼瘡性腎炎小鼠腎組織中TREM1蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。見(jiàn)圖2。

圖2 TREM1蛋白在狼瘡性腎炎小鼠腎組織中的表達(dá)(×100)Fig.2 Protein expression of TREM1 in kidney tissue of mice with LN(×100)

2.3miR-143-3p靶向下調(diào)TREM1表達(dá) Targets-can預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-143-3p與TREM1存在結(jié)合位點(diǎn)。采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證兩者靶向關(guān)系。結(jié)果顯示：與共轉(zhuǎn)染mimic NC與TREM1-3′UTR-WT相比，共轉(zhuǎn)染miR-143-3p mimic與TREM1-3′UTR-WT的293T細(xì)胞中的熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)，其余組則無(wú)顯著變化(P>0.05)。同時(shí)，與mimic NC組相比，miR-143-3p能顯著下調(diào)TREM1的蛋白表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 miR-143-3p與TREM1的靶向關(guān)系驗(yàn)證Fig.3 Targeting relationship validation between miR-143-3p and TREM1Note:A.Prediction results through Targetscan;B.Verification results of dual fluorescein reporting system;C.Protein bands of TREM1;D.Quantification of TREM1 protein.Compared with group co-transfected with mimic NC and TREM1-3′UTR-WT,&.P<0.05；compared with mimic NC group,#.P<0.05.

2.4miR-143-3p靶向TREM1抑制系膜細(xì)胞炎性因子生成 系膜細(xì)胞的促炎因子的分泌是狼瘡性腎炎最主要的病理改變。Western blot對(duì)各組系膜細(xì)胞NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和MCP-1蛋白進(jìn)行定量。結(jié)果顯示：與mimic NC相比，miR-143-3p過(guò)表達(dá)后NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和MCP-1因子的生成被顯著抑制(P<0.05)。sh-TREM1組細(xì)胞較sh-NC組而言，其NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和MCP-1表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。TREM1沉默聯(lián)合miR-143-3p模擬物能更加顯著地抑制上述因子的表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和MCP-1蛋白在系膜細(xì)胞中的表達(dá)Fig.4 Protein expression of NF-κB p65,TNF-α,IL-1β,MCP-1 in each group of mesangial cellsNote:A.Immunoblotting bands of NF-κB p65，TNF-α，IL-1β,MCP-1 in each group;B.Quantification of NF-κB p65，TNF-α，IL-1β,MCP-1.Compared with mimic NC group,#.P<0.05；compared with sh-NC group,*.P<0.05；compared with miR-143-3p mimic+sh-TREM1 group,△.P<0.05.

2.5miR-143-3p靶向TREM1抑制系膜細(xì)胞增殖活力 過(guò)度的系膜細(xì)胞增生同時(shí)也是狼瘡性腎炎的誘因之一。CCK8法測(cè)定各組系膜細(xì)胞活力，結(jié)果如下：與各自的陰性對(duì)照相比，sh-TREM1組和miR-143-3p mimic組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力被顯著抑制(P<0.05)，miR-143-3p mimic+sh-TREM1組抑制效果更加顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組系膜細(xì)胞活力Fig.5 Viability of mesangial cells in each groupNote:Compared with mimic NC group at the corresponding time point,#.P<0.05；compared with sh-NC group at the corresponding time point,*.P<0.05；compared with miR-143-3p mimic+sh-TREM1 group at the corresponding time point,△.P<0.05.

2.6miR-143-3p靶向TREM1使系膜細(xì)胞停滯在G0/G1期 通過(guò)PI單染了解各組系膜細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與各自的陰性對(duì)照相比，sh-TREM1組和miR-143-3p mimic組G1/G0期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)，但S期和G2期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.05)。說(shuō)明miR-143-3p能下調(diào)TREM1進(jìn)而阻滯系膜細(xì)胞周期。miR-143-3p mimic+sh-TREM1組阻滯效果更加明顯。見(jiàn)圖6。

圖6 各組系膜細(xì)胞周期分布Fig.6 Cell cycle distribution in each group of mesang-ial cellsNote:A.Cell cycle chart in each group；B.Cell cycle distribution in each group.Compared with mimic NC group at the corresponding time point,#.P<0.05；compared with miR-143-3p mimic+sh-TREM1 group at the corresponding time point,△.P<0.05.

2.7miR-143-3p對(duì)系膜細(xì)胞凋亡無(wú)顯著影響 為檢測(cè)miR-143-3p對(duì)系膜細(xì)胞的影響，本研究使用Annexin V/PI雙標(biāo)染色檢測(cè)各組系膜細(xì)胞早期與晚期凋亡細(xì)胞的情況。結(jié)果顯示：與mimic NC組相比，miR-143-3p組和miR-143-3p mimic+sh-TREM1組系膜細(xì)胞凋亡率有所上升，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。sh-NC組與sh-TREM1組細(xì)胞凋亡情況無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)圖7。

圖7 各組系膜細(xì)胞凋亡情況Fig.7 Apoptosis of mesangial cells in each groupNote:A.Mesangial cells apoptosis was detected by flow cytometry;B.Quantification of apoptosis rate in each group.

3 討論

腎小球系膜細(xì)胞的過(guò)度增殖被認(rèn)定為L(zhǎng)N的首要病理學(xué)指標(biāo)，也是造成腎損傷的重要原因[12]。miRNA經(jīng)研究證實(shí)在生物體基因的表達(dá)以及多種細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，另外也有越來(lái)越多的研究證實(shí)miRNA能夠?qū)γ庖吖δ苓M(jìn)行調(diào)節(jié)[13,14]。以往研究證實(shí)誘發(fā)miR-143的表達(dá)能夠抑制丙酸桿菌介導(dǎo)的皮膚炎性反應(yīng)[15]。此外，miR-143在炎癥性腸病中的保護(hù)作用也被越來(lái)越多的證實(shí)[8,16]。本研究進(jìn)一步證實(shí)了miR-143-3p能夠靶向調(diào)控TREM1基因進(jìn)而對(duì)LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞炎性因子以及細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控。

免疫組化染色對(duì)LN小鼠腎組織中TREM1表達(dá)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)LN小鼠腎組織中TREM1呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。TREM1經(jīng)以往研究證實(shí)在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中以及自身免疫性疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，相對(duì)于健康人群，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎標(biāo)本中TREM1表達(dá)顯著增高[6]。本研究進(jìn)一步證實(shí)了TREM1在LN小鼠腎組織中表達(dá)升高，并且通過(guò)雙熒光素報(bào)告以及Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)TREM1受miR-143-3p調(diào)控，miR-143-3p能夠抑制TREM1的表達(dá)。炎癥因子的過(guò)度分泌是LN的重要病理表現(xiàn)。本研究通過(guò)Western blot對(duì)各組細(xì)胞中炎性相關(guān)因子的蛋白進(jìn)行定量，觀察miR-143-3p靶向TREM1對(duì)系膜細(xì)胞炎癥因子的影響。LN發(fā)病時(shí)往往伴隨NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和MCP-1等炎癥因子表達(dá)水平的提高，而炎癥因子的增強(qiáng)又會(huì)進(jìn)一步加重腎臟固有細(xì)胞損傷以及免疫反應(yīng)，加重病情進(jìn)展[17]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-143-3p或抑制TREM1表達(dá)能夠顯著抑制系膜細(xì)胞中炎癥因子的生成。

LN腎小球系膜細(xì)胞是增殖性腎損傷發(fā)揮作用的重要靶細(xì)胞[18]。正常健康狀態(tài)下，腎小球系膜細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量均維持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，但特定損傷類因素則容易引起腎小球系膜細(xì)胞凋亡減少、過(guò)度增殖，使得細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度生成，最終引起腎小球硬化[19,20]。因此，誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞的凋亡、減少其增殖對(duì)于LN的治療以及防止腎小球硬化具有重要意義。本研究通過(guò)CCK8以及流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各組LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-143-3p以及沉默TREM1基因能夠抑制LN小鼠腎系膜細(xì)胞增殖活性且聯(lián)合處理效果更顯著。此外，過(guò)表達(dá)miR-143-3p以及沉默TREM1后促進(jìn)了LN小鼠腎系膜細(xì)胞的G0/G1期阻滯且聯(lián)合處理效果更明顯，但是各組之間凋亡率差異不顯著。表明LN小鼠腎系膜細(xì)胞增殖活性的改變主要是由細(xì)胞周期的變化引起的，而miR-143-3p能夠靶向下調(diào)TREM1進(jìn)而促進(jìn)G0/G1期細(xì)胞阻滯進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖活性。

綜上所述，LN小鼠腎系膜細(xì)胞中miR-143-3p表達(dá)相對(duì)于正常小鼠顯著降低，miR-143-3p能夠靶向抑制TREM1進(jìn)而抑制腎小球系膜細(xì)胞炎性因子的分泌以及細(xì)胞增殖活性，miR-143-3p有望成為L(zhǎng)N治療中的重要靶點(diǎn)。但是對(duì)于其具體作用機(jī)制以及是否通過(guò)下游通路發(fā)揮作用仍然需要通過(guò)更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。

4 結(jié)論

miR-143-3p在LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，TREM1表達(dá)則顯著增強(qiáng)，miR-143-3p能夠靶向抑制TREM1的表達(dá)進(jìn)而抑制腎小球系膜細(xì)胞炎性因子的分泌以及細(xì)胞增殖活性，在LN中發(fā)揮保護(hù)作用，因此miR-143-3p有望成為L(zhǎng)N治療的重要靶點(diǎn)。