N-乙酰半胱氨酸對(duì)順鉑導(dǎo)致腎毒性的保護(hù)作用及作用機(jī)制分析①

王 健 趙 碩 任博環(huán)

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，錦州 121001)

急性腎損傷(aucte kiney injury,AKI)是指在短時(shí)間內(nèi)患者腎功能急劇降低的情況，在化療患者中常見(jiàn)的并發(fā)癥，發(fā)生率約為10%～15%。臨床研究結(jié)果表明，合并AKI患者的死亡率和化療失敗率均顯著增加，這是由于化療藥物本身是一種腎毒性藥物，而腎毒性則是導(dǎo)致AKI的主要因素之一[1]。順鉑曾是臨床上治療實(shí)體瘤最為廣泛的一線化療藥物之一，但現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)順鉑不僅能抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成，還具有較強(qiáng)的腎毒性，可對(duì)動(dòng)物和人類的腎小管造成嚴(yán)重的損害，使其在臨床的應(yīng)用受到限制[2]。近年來(lái)，大量藥理學(xué)研究也關(guān)注如何通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用藥物減小順鉑的腎毒性，從而增加其臨床治療的安全性。研究表明，順鉑腎毒性的機(jī)制主要包括抑制DNA合成、跨膜累積、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、激活細(xì)胞凋亡途徑等，若通過(guò)使用某種藥物，減少順鉑帶來(lái)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，并對(duì)腎細(xì)胞起到保護(hù)作用，則能有效地抑制順鉑的腎毒性[3]。相關(guān)報(bào)道指出，在30年前，谷胱甘肽前體N-乙酰半胱氨酸已經(jīng)被應(yīng)用于治療氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)引起的慢性疾病如酒精肝等，而這些疾病產(chǎn)生的原因恰恰為谷胱甘肽水平減少和抗氧化能力缺乏，與順鉑導(dǎo)致腎毒性的機(jī)制符合，這也給臨床通過(guò)聯(lián)合用藥減少順鉑腎毒性及探討其機(jī)制帶來(lái)了新的研究思路。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析探討了N-乙酰半胱氨酸對(duì)于順鉑誘導(dǎo)的腎毒性和腎損傷的保護(hù)功能及其機(jī)制，旨在為臨床藥理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑 順鉑注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字：H20030675；生產(chǎn)廠家：南京制藥廠；規(guī)格：20 ml∶20 mg)，N-乙酰半胱氨酸購(gòu)自北京阿匹斯生物科技有限公司(貨號(hào)：AC0001A)，PBS溶液和生理鹽水購(gòu)自海標(biāo)科技有限公司均為超純級(jí)，Scr、尿素氮(BUN)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、谷胱甘肽(GSH)均采用雙抗夾心法測(cè)定，小鼠Scr、TNF-α GSH-PX(谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶)ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京森貝伽[貨號(hào)：SBJ-M0081(Scr)；SBJ-M0030(TNF-α)；SBJ-M0019(GSH-PX)]；小鼠BUN ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京金益柏生物科技有限公司(貨號(hào)：JEB-12858)。

1.1.2儀器 TD-4M型實(shí)驗(yàn)用低速離心機(jī)(BIOBASE產(chǎn)品)，MDF-C8V(N)型-80℃超低溫冰箱、-20℃冰箱(日本SANYO產(chǎn)品)，680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD產(chǎn)品)，CX-23型生物顯微鏡(日本Olympus產(chǎn)品)，CPA225D型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯產(chǎn)品)，KL型石蠟包埋機(jī)(國(guó)產(chǎn)湖北康龍電子科技公司產(chǎn)品)。

1.1.3動(dòng)物 選擇10月齡的健康BALB/c小鼠200只，清潔級(jí)(SPF)，雌雄各半，體重(28±2)g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，用于AKI建模及后續(xù)給藥研究，在溫度(22±1)℃、濕度(55±10)%條件下用顆粒飼料、自來(lái)水喂養(yǎng)，各組小鼠自由進(jìn)食、飲水，明暗交替時(shí)間為各12 h，每5只同性別小鼠同籠飼養(yǎng)，定期對(duì)飼養(yǎng)室進(jìn)行清潔消毒，試驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠并進(jìn)行焚燒處理。

1.2方法

1.2.1順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷小鼠模型(AKI)的構(gòu)建 選擇BALB/c健康小鼠200只，隨機(jī)分為2組，各100只，在動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，在最后一次進(jìn)食12～15 h，模型組60只腹腔注射20 mg/kg的順鉑(順鉑注射液由生理鹽水稀釋至濃度1 g/L)，對(duì)照組60只注射等體積無(wú)菌生理鹽水，每日給藥1次，給藥第3天，每只小鼠在眼內(nèi)眥靜脈叢抽取眼球血1 ml，送至病理檢驗(yàn)科測(cè)定血清Scr、BUN水平，并做腎臟組織切片PAS染色，顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞排列疏松、腫脹、呈空泡狀、擴(kuò)張、刷狀緣部分壞死、脫落，但腎小球未見(jiàn)病變情況，與對(duì)照組有顯著差異，模型組Scr水平為對(duì)照組的10～20倍、BUN水平為對(duì)照組的3～5倍，且經(jīng)多次試驗(yàn)確定能穩(wěn)定造模，建立AKI小鼠模型。

1.2.2分組處理方法 AKI造模完成后，從模型組100只小鼠中選取60只作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)象，雌雄各半，并依據(jù)小鼠性別采用分層隨機(jī)抽樣分為6組，各10只，每組小鼠雌雄各半。在AKI模型建立7 d后，A組給予5 mg/kg順鉑，B組給予250 μg/(100 g·d)的N-乙酰半胱氨酸，C組給予5 mg/kg順鉑+250 μg/(100 g·d)的N-乙酰半胱氨酸；D組給予500 μg/(100 g·d)的N-乙酰半胱氨酸；E組給予5 mg/kg 順鉑+500 μg/(100 g·d)的N-乙酰半胱氨酸，F(xiàn)組注射生理鹽水做對(duì)照，腹腔注射給藥，每天1次，每次注射100 ml，順鉑、N-乙酰半胱氨酸注射液均根據(jù)每次注射體積由生理鹽水稀釋至相應(yīng)濃度，連續(xù)給藥7 d。

1.2.3血生化指標(biāo)、炎癥因子的檢測(cè) 在各組小鼠給藥7 d后，經(jīng)眼內(nèi)眥靜脈叢對(duì)每只小鼠抽取眼球血1 ml，取樣后加入1.5 ml離心管中，以4 000 r/min離心10 min分離血清，在2 h內(nèi)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測(cè)眼球血血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、谷胱甘肽(GSH)含量。對(duì)于不能立即檢測(cè)的血清樣本則梯度降溫保存在4℃、-20℃、-80℃環(huán)境下，最終在-80℃超低溫冷凍箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4小鼠腎臟組織病理PAS染色和腎損評(píng)分 給藥7 d后，采用乙醚對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，麻醉后，打開腹腔、胸腔，充分暴露膀胱，用移液器吸凈膀胱殘留尿液，暴露腹主動(dòng)脈、下腔靜脈，經(jīng)左心室、腹主動(dòng)脈灌注20 ml預(yù)冷PBS溶液，并剪斷下腔靜脈，觀察腎臟顏色變白后立即摘除雙側(cè)腎臟，處死小鼠。取腎臟冠狀位前1/2組織，用4%多聚甲醛固定20 h，后經(jīng)脫水、浸蠟、包埋處理做成腎臟組織切片，水化后做HE染色，由病理科醫(yī)師雙盲情況下每個(gè)切片選擇5個(gè)視野區(qū)域以10倍顯微鏡頭觀察腎小管、腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)，若出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張、刷狀緣脫落、腎細(xì)胞壞死、空泡化等情況則評(píng)價(jià)為出現(xiàn)腎組織損傷。最后根據(jù)損傷面積和范圍對(duì)每只小鼠進(jìn)行腎損傷評(píng)分：0分：無(wú)損傷；1分：損傷面積<10%；2分：損傷面積為10%～25%；3分：損傷面積為26%～50%；4分：損傷面積為51%～75%；5分：損傷面積>75%。

2 結(jié)果

2.1N-乙酰半胱氨酸對(duì)于AKI小鼠臨床指標(biāo)的影響

2.1.1N-乙酰半胱氨酸對(duì)于AKI小鼠眼球血血清Scr、BUN水平的影響 表1中的對(duì)比結(jié)果顯示，給藥前，6組小鼠血清Scr、BUN水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，給藥7 d后，6組Scr、BUN水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：A組>F組>C組>E組>B組>D組，而與治療前相比，A組顯著增加(P<0.05)；B組、D組、E組顯著降低(P<0.05)，C組、F組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 給藥前后6組AKI小鼠眼球血血清Scr、BUN水平比較Tab.1 Comparison of serum Scr and BUN levels in 6 groups AKI mice before and after

Note：Compared with before administration，group A,B,C,D,E,F，Scr value:t=3.193，P>0.05;t=37.209，P<0.05;t=1.425，P>0.05;t=36.524，P<0.05;t=25.524，P<0.05;t=1.623，P>0.05.Compared with before administration,group A,B,C,D,E,F,BUN value:t=2.424，P>0.05;t=12.422，P<0.05;t=1.562，P>0.05;t=15.446，P<0.05;t=9.262，P<0.05;t=1.834，P>0.05.

2.1.2N-乙酰半胱氨酸對(duì)于AKI小鼠眼球血血清炎癥因子水平的影響 給藥前，6組小鼠血清TNF-α、GSH水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，給藥7 d后，6組TNF-α、GSH水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：①TNF-α：A組>F組>C組>E組>B組>D組，而與治療前相比，A組顯著增加(P<0.05)；B組、D組、E組顯著降低(P<0.05)，C組、F組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；②血清GSH：A組0.05)，E組、B組、D組顯著增加(P<0.05)，相關(guān)資料見(jiàn)表2。

表2 給藥前后6組AKI小鼠眼球血血清TNF-α、GSH水平比較Tab.2 Comparison of serum TNF-α and GSH levels in 6 groups AKI mice before and after

Note：Compared with before administration，group A，B，C，D，E，F(xiàn)，TNF-α value:t=2.937，P>0.05；t=8.378，P<0.05；t=1.749，P>0.05；t=9.738，P<0.05；t=3.524，P<0.05；t=1.362，P>0.05.Compared with before administration,group A,B,C,D,E,GSH value:t=9.472，P<0.05；t=4.173，P<0.05；t=1.156，P>0.05；t=5.736，P<0.05；t=5.734，P<0.05；t=1.761，P>0.05.

2.2N-乙酰半胱氨酸對(duì)于AKI小鼠腎損傷程度的影響

2.2.1N-乙酰半胱氨酸對(duì)于AKI小鼠腎損傷評(píng)分的影響 給藥后與給藥前相比，RIS改善水平：A組0.05)，表明N-乙酰半胱氨酸對(duì)于AKI小鼠腎臟組織具有保護(hù)作用，見(jiàn)表3。

表3 給藥前后6組AKI小鼠腎組織損傷評(píng)分比較(分，Tab.3 Comparison of renal tissue damage scores of 6 groups of AKI mice before and after administration

Note：Compared with before administration，group A，B，C，D，E，F(xiàn)，t=3.332，P<0.05；t=13.262，P<0.05；t=0.828，P>0.05；t=21.549，P<0.0 5；t=6.893，P<0.05；t=0.491，P>0.05.

圖1 給藥后6組小鼠腎臟組織病理PAS染色圖(×10)Fig.1 Histopathological PAS staining of 6 groups of mice after administration (×10)Note:A.Group A;B.Group B;C.Group C;D.Group D;E.Group E;F.Group F.

2.2.2N-乙酰半胱氨酸對(duì)于AKI小鼠腎組織病理學(xué)檢查結(jié)果的影響 給藥前，6組AKI小鼠的腎臟PSA染色圖可見(jiàn)腎小管擴(kuò)張、上皮腫脹、細(xì)胞排列疏松、空泡變性，但腎小球未見(jiàn)顯著損壞，與圖1中給藥后的F組空白對(duì)照組情形相同；給藥后，給予順鉑的小鼠腎臟PAS染色圖除具有AKI小鼠腎臟損傷特征外，腎小球邊緣細(xì)胞出現(xiàn)壞死脫落，腎小球體積改變，顏色加深，與圖1中給藥后A組情形相同；而在給藥后，給予 N-乙酰半胱氨酸的4組小鼠腎小管結(jié)構(gòu)則出現(xiàn)一定改觀和修復(fù)，原損傷部位顏色變淺、深色面積縮小，特別是圖1中的B組和D組，腎臟損傷面積、壞死細(xì)胞比例明顯低于同時(shí)給予順鉑的C組和E組。

3 討論

順鉑作為常用的化療藥物之一，腎毒性是順鉑化療中頻率最高、最為嚴(yán)重的不良反應(yīng)，可影響化療順利進(jìn)行、縮短患者生存時(shí)間。研究表明，順鉑所致腎毒性可引發(fā)急性腎損傷，其重要機(jī)制包括氧化應(yīng)激、跨膜累積、炎癥反應(yīng)、P53蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑等，也有觀點(diǎn)認(rèn)為，順鉑腎毒性即自由基毒性和過(guò)氧化物毒性[4]。但順鉑對(duì)于惡性腫瘤具有廣譜抗性和強(qiáng)效抑制作用，在化療治療中不可或缺，通過(guò)聯(lián)合用藥減輕順鉑腎毒性、增強(qiáng)順鉑應(yīng)用的安全性，也是近年來(lái)藥理學(xué)研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題。

谷胱甘肽是機(jī)體細(xì)胞中的重要代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與三羧酸循環(huán)，其活性巰基是重要官能團(tuán)，具有抗氧化應(yīng)激、清除自由基、抑制細(xì)胞凋亡等藥理作用，可有效對(duì)抗順鉑腎毒性的相關(guān)機(jī)制如氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等。但谷胱甘肽屬于小分子肽，口服或靜滴給藥的生物利用度差，N-乙酰半胱氨酸是谷胱甘肽的前體，注射給藥后在人體代謝過(guò)程中能分解為谷胱甘肽，更高效地阻斷P53蛋白介導(dǎo)的腎細(xì)胞凋亡途徑、提高腎細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力、清除過(guò)氧化物、自由基毒性物質(zhì)，在臨床上，N-乙酰半胱氨酸也有被應(yīng)用于治療急性腎衰竭的經(jīng)驗(yàn)[5]。

因此，近年來(lái)，大量動(dòng)物試驗(yàn)都將N-乙酰半胱氨酸作為緩解順鉑腎毒性的有效藥物并研究其對(duì)于順鉑腎毒性的緩解效果，但關(guān)于順鉑導(dǎo)致腎損傷、腎毒性的動(dòng)物試驗(yàn)多數(shù)是將單一劑量的N-乙酰半胱氨酸(試驗(yàn)組)、西米替汀(陽(yáng)性對(duì)照組)、健康組(陰性對(duì)照組)加以比較，觀察指標(biāo)則主要為肌酐、尿素氮等常見(jiàn)指標(biāo)[6，7]，上述研究不足之處和本文的創(chuàng)新之處在于：①研究文獻(xiàn)中的對(duì)照組試驗(yàn)是獨(dú)立的，對(duì)象為健康小鼠，并未在AKI模型中給藥，本研究首次選取AKI模型小鼠給藥，所有給藥處理均在相同平臺(tái)上進(jìn)行，可得到較為新穎的結(jié)論；②傳統(tǒng)研究缺少濃度梯度試驗(yàn)，無(wú)法證明不同劑量的N-乙酰半胱氨酸對(duì)于順鉑所致的腎損傷的保護(hù)能力差異。本研究中首次將N-乙酰半胱氨酸根據(jù)劑量分為兩組，并引入兩組順鉑+N-乙酰半胱氨酸做梯度對(duì)照，研究結(jié)果表明：給藥7 d后，6組Scr、BUN、TNF-α和GSH改善水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：A組>F組>C組>E組>B組>D組，說(shuō)明N-乙酰半胱氨酸可促進(jìn)AKI小鼠血清炎癥因子水平改善、提高腎臟抗氧化應(yīng)激能力。這個(gè)結(jié)果不僅證實(shí)了高劑量的N-乙酰半胱氨酸對(duì)順鉑所致腎毒性的保護(hù)作用強(qiáng)于低劑量的N-乙酰半胱氨酸，還證實(shí)了N-乙酰半胱氨酸與順鉑同時(shí)聯(lián)用有助于減輕腎毒性，且不同的N-乙酰半胱氨酸劑量對(duì)于順鉑腎毒性的保護(hù)作用也不同；③傳統(tǒng)研究的觀察指標(biāo)相對(duì)單一，本研究中引入了腎組織損傷病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)、氧化應(yīng)激指標(biāo)GSH、炎癥因子TNF-α，并結(jié)合PAS染色圖對(duì)AKI小鼠腎損傷程度的改善水平進(jìn)行了綜合對(duì)比分析，觀察指標(biāo)更加全面，本研究結(jié)果也表明，這些指標(biāo)的研究結(jié)論也高度一致。

總之，本研究通過(guò)6組AKI小鼠進(jìn)行對(duì)照給藥試驗(yàn)，證實(shí)了N-乙酰半胱氨酸可減輕因順鉑導(dǎo)致的小鼠腎毒性和腎損傷程度，對(duì)腎臟具有保護(hù)作用，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的療效與N-乙酰半胱氨酸的劑量有高度相關(guān)性，其機(jī)制則與N-乙酰半胱氨酸具有抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激等藥理作用有關(guān)。不過(guò)本研究中并未涉及相關(guān)靶蛋白如C5aR、P53等的表達(dá)檢測(cè)、免疫熒光等生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，研究仍不夠深入，應(yīng)在接下來(lái)的工作中進(jìn)一步探討。